ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡

この手順の全体的な目標は、宿主のhela細胞と相互作用する動的な小さなHIV One粒子をイメージングすることにより、相関蛍光およびクライオ電子顕微鏡法の使用方法を実証することです。これは、まず、ガラス底培養皿の金ファインダーEMグリッド上にヒーラ細胞を播種して増殖させ、ヒラ細胞にGFP標識HIV One粒子を感染させることによって達成されます。2番目のステップは、HIV 1感染細胞のタイムラプス高速3Dライブセル共焦点画像を収集し、ガラス化後の単一粒子ダイナミクスの自動3D粒子追跡によって画像を分析することです。

サンプルは、ライブセルイメージングデータと同じウイルス粒子であり、さらに高解像度の3Dクライオ電子線トモグラフィー分析のためにクライオ蛍光画像に配置されています。最後のステップは、HIV One 粒子を含む特定されたすべての位置について傾斜したクライオ EM 投影シリーズを収集し、imad ソフトウェアを使用して重み付きバックプロジェクションアルゴリズムで 3D トムを再構築することです。最終的には、高度な3D相関生細胞蛍光顕微鏡法と高分解能クライオ電子線トモグラフィーを使用して、動的回折限定ウイルス粒子と宿主細胞との相互作用を直接視覚化します。

私たちの研究は、HIV 1つの感染のイベントのみを直接視覚化できる相関法の開発を目的としています このように、顕微鏡法、クライオ蛍光顕微鏡法、クライオ電子線トモグラフィーのような生細胞蛍光を組み合わせることで、生細胞とクライオ蛍光シグナルを使用して、クライオ電子線トモグラフィーのサンプリングを大きく導くことができます。さらに、クライオ電子線トモグラフィーから得られる構造情報は、蛍光標識標的のライフスタイルイメージングを通じて得られる動的な機能データで補完することができます。この技術または既存の方法の主な利点は、高解像度の3Dサンゴ電子線トモグラフィーアプローチによる高度な相関高速3Dライフスタイルイメージングを適用して、HIV1型や感染初期における宿主細胞の相互作用など、本質的に捕捉が困難な動的イベントを研究できることです。

細胞培養グロー放電のためのグリッドを準備するには、200メッシュR two over two quanti foil、金EMファインダーグリッドの炭素側を25ミリアンペア未満で25秒間放電します。EMグリッドをカーボン面を下にして、50マイクログラム/ミリリットルのファイバーニン溶液の液滴にカーボン面を浮かべて、ファイバーニンでコーティングします。ガラス底培養皿の中の1ミリリットルあたり10〜4細胞の密度でグリッド上に消毒プレートヘラ細胞を消毒プレートヘラ細胞のためにUV光の下で2時間放置します。

適切なサプリメントを用いたDMEMでは、HIV感染の約18時間前、HIV感染の1つ前に、5%二酸化炭素で細胞を摂氏37度でインキュベートし、ガラス底培養皿のヘラ細胞に蛍光細胞トラッカーを添加し、皿を摂氏37度で10分間インキュベートして、蛍光色素の取り込みを可能にします。 細胞をPBSで洗浄し、50マイクロリットルの予熱した新鮮な培地を加えます。ディッシュをスイープフィールド共焦点スキャナー顕微鏡の摂氏37度の生細胞チャンバーに入れます。クライオEMはサンプルの比較的薄い領域を必要とするため。

1平方あたり1〜3個のセルを含む複数のフィールドを選択し、セルが最も広がっているときに2つの有糸分裂期の間にセルを配置し、これらの位置をNISエレメントソフトウェアでフラットに保存して、将来のイメージングに備えます。次に、G-F-P-V-P-Rを含む偽型HIV One粒子であるVSVGを細胞に感染させ、ウイルス粒子を皿の底の井戸に感染させます。撮像位置は既に選択され、バリアンを添加した直後に保存されているため、あらかじめ選択した位置で20〜40分間、タイムラプス高速3D共焦点画像を収集します。

共焦点ライブセルイメージングの直後に、氷冷した銅ブロックに培養皿を置き、クライオEMサンプル調製室に移します。EMグリッドを専用のピンセットにロードし、濾紙で残留培地をすばやく拭き取り、すぐにグリッドに置き、0.2ミクロンの蛍光マイクロスフェアと混合した15ナノメートルの金ビーズ溶液のマイクロリットルに置きます。蛍光マイクロスフェアは、蛍光とクライオ電子顕微鏡の相関を助けるために使用されます。

ピンセットをガラス固化装置にロードして、最良の結果が得られるように最適化されたブロッティングパラメータでプランジ凍結します。クライオ蛍光光学顕微鏡の手順を開始するには、対物レンズの上に配置されたスリーブに乾燥窒素ガスラインを接続してレンズを暖かく霜がつかないようにし、自作のクライオ蛍光サンプルステージを倒立蛍光光学顕微鏡に取り付けます。クライオサンプルステージの液体窒素入口を自己加圧装置に接続し、液体窒素オーバーフロー保護出口を適切な容器に入れます。

凍結した水和サンプルグリッドを銅ブロックのEMサンプルカートリッジに入れ、グリッドを所定の位置に保持するために上部に予冷Cクリップリングを置きます。カートリッジをクライオステージサーチの内部チャンバーにセットし、ライブセルイメージングデータから同じウイルス粒子を見つけます。EMグリッドにはインデックスがあるため、ライブセル画像とクライオ蛍光画像の両方で、グリッド上の同じ粒子を簡単に位置特定できます。

クライオ条件下で特定された位置のクライオDICおよび蛍光画像を、長時間作動する対物レンズを備えた光学顕微鏡を使用して取得します。クライオ蛍光イメージング中は、クライオステージ内の液体窒素レベルを定期的にチェックし、必要に応じて自己加圧ドーアーで補充して、クライオ電子線トモグラフィーのためにサンプルステージを摂氏マイナス170度未満に保ちます。電界放出型電子銃を搭載した電子顕微鏡のクライオトランスファーステーションに試料グリッドをロードし、低線量探索モードを140倍の倍率で行います。

クライオ蛍光画像が取得された領域またはグリッド正方形を特定します。相関領域の低倍率クライオEM画像を記録し、その位置を低線量検索モードで3, 500 xの倍率でステージファイルに保存します。100ミクロンの対物開口サーチを挿入し、GFP信号と相関するすべての位置を第2ステージファイルに保存します。

チルト シリーズを取得するためのトモグラフィー パラメーター (傾斜角度範囲、電子線量、焦点ぼけ値、傾斜スキームなど) を設定します。保存されたすべての位置のチルトシリーズを取得して、この手順を開始します。Tomo Graham計算のいくつかのステージを同時に調整または追跡できるようにメインウィンドウを構成し、必要なパラメーターを変更し、各処理ステップに必要な特定のプログラムを実行します。

最終段階で、メイン残差誤差が 0.6 未満の完全にアラインされたスタックを作成し、重み付けされた後方投影アルゴリズムを使用して Toms を再構築します。Im mod でウイルス粒子の動的挙動を特徴付けます。HIV細胞に感染したHela細胞を高速共焦点生細胞顕微鏡でイメージングし、粒子の動きを自動3D粒子追跡で解析しました。

この代表的な図では、黄色の矢印で示された緑色の蛍光ウイルス粒子1個を、フレーム間の時間間隔を3分空けて3次元共焦点スタックで追跡し、数分の時間経過を回避しています。これは、最後の共焦点ライブセル画像の収集と急降下凍結の間に発生する可能性があります。クライオ蛍光光学顕微鏡ステージは、クライオEMカートリッジ内の凍結水和サンプルをイメージングするために設計および構築されました。

光学顕微鏡パネルAでは、銅クライオサンプルステージを冷却するために使用される液体窒素で満たされた自己加圧ドウアーを示しています。パネルBは、クライオサンプルステージの上部内部図を示しており、内側のチャンバーは白い矢印で示されています。サンプルグリッドは、黒矢印で示された銅ブロックプラットフォームの中央にあるE EM試料カートリッジ上に置かれます。

このプラットフォームは、非極性電子顕微鏡で使用するために追加されました。サンプルグリッドがロードされると、カートリッジは蛍光光のために内部チャンバーに移されます。顕微鏡パネルCとDは、非極性クライオ電子顕微鏡で使用するためにグリッドを所定の位置に保持するための銅リングを配置する前と後、それぞれ試料カートリッジを示しています。

高度な相関生命細胞顕微鏡法およびクライオ電子線トモグラフィーの手順の有用性は、宿主のヒーラ細胞と相互作用する蛍光標識されたHIV V One粒子の直接可視化によって実証されています。パネルAに示すクライオ光学顕微鏡ステージで記録されたDIC画像に、パネルBに示すGFPタグ粒子のクライオ蛍光画像を重ね合わせます。赤色のパネルC、D、Eは、パネルBとCでそれぞれ140×3、500×、27,500×で囲まれた蛍光粒子を含む領域の低線量クライオ電子顕微鏡画像です。

パネルEの挿入図は、断層撮影チルトシリーズパネルの取得後に記録された拡大図であり、FGとHは、Z方向に21ナノメートルの距離で分離された厚さ4ナノメートルの3枚の断層撮影スライスを示している。粒子とヘロ細胞膜との間の接続は、挿入図とパネルEおよび断層撮影スライスの両方の投影画像で矢印で示されています。パネルFとgで。

私たちは、タイムラプス共焦点リポ細胞蛍光イメージングとそれに続くクライオ電子断層撮影を使用して、動的ウイルスと無菌の相互作用を分析するための高度な相関アプローチを提供するための簡単なプロトコルセットを提示しました。この手順を試行する際には、蛍光画像と電子顕微鏡画像との間の正確で信頼性の高い相関関係が、カラス電子線トモグラフィーの取得を成功させるために重要であることを覚えておくことが重要です。この手順で説明したデータは、細胞シグナル伝達、表面受容体の内在化など、細胞生物学における動的細胞プロセスを含む多数のアプリケーションに役立ちます。