Name: ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 43 s
Description: 学ぶ 相関顕微鏡法を用いたHIV-1粒子とHeLa細胞の動的相互作用の3次元構造解析。この手法は、高速3Dライブセル蛍光顕微鏡と高分解能クライオ電子トモグラフィーを統合し、ウイルス感染初期段階の動的イベントを可視化します。

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著者は技術のために低温蛍光試料ステージ、中国科学技術大学のChangluタオとチェン徐の建設のためにトラビスウィーラーと細胞生物学科機械工場や生理学、ピッツバーグ大学に感謝したいと思います案内、原稿の重要な読書のための博士テレサBrosenitsch。この作品は、国立衛生研究所（GM082251＆GM085043）によってサポートされていました。

1。カーボンコーティングされた上でのHeLa細胞培養、ゴールドEMファインダーグリッド<ol><li>グロー放電25秒25ミリアンペア下200メッシュR2 / 2 Quantifoil金EMファインダーグリッドの炭素側。 </li><li>コー​​トフィブロネクチンとEMグリッドは、カーボン側、それを下に浮かんで、50μgの/ mlのフィブロネクチン溶液を40μlの液滴にし、組織培養フード内で2時間、UV光の下でそれを消毒。 </li><li>プレートのHeLaグラスボトム培養皿で2×10 4細胞/ ml（合計2 mlの培養液）の密度でグリッド上のセルとDMEM中で、5％CO 2、37℃で細胞を成長させるには、4.5で補充約18時間グラム/ L L-グルタミンおよびグルコース、10％熱不活性化ウシ胎児血清、100単位/ mlのペニシリン、および100μg/ml/ mlのストレプトマイシン、。 HeLa細胞は、O / N培養後に感染している。 </li></ol> 2。 HIV-1感染症とライブセルイメージング<ol><li>グラスボトム文化に蛍光細胞トラッカー（赤CMTPX、1μlの/ 2 ml）を追加ディッシュ（ステップ1.3から）と蛍光色素のアップテイクできるように、10分間37℃で皿をインキュベート。 </li><li> PBSで細胞を洗浄し、50μlの予め温めておいた新鮮な培地を追加します。 </li><li> 37°C、スウェプトフィールド共焦点スキャナ顕微鏡でライブセルチャンバー上に皿を置きます。低温電子顕微鏡は、比較的薄い領域を必要とするので、彼らはほとんどの、フラットに広げている2つの有糸分裂の相の間の細胞と1-3のセルを含む/平方複数のフィールド（10-15位置）、（ 図2c及び2dを参照） を選択するサンプル。将来のイメージング（ステップ2.5）のためにこれらの位置を保存します。 </li><li> （我々はP24の40 ngの/ mlのを含むサンプル40μlのを使用してください）​​GFP-Vprにを含むVSV-GシュードタイプされたHIV-1粒子を細胞に感染。皿の底にウイルス粒子を追加する場合は、イメージングのための位置がすでに選択して保存されているため、EMグリッドを邪魔しないように注意してください。 </li><li>直ちにビリオンの添加後、チタニウムを集める20-40分間、前に選択した位置での高速3D共焦点画像を、（ステップ2.3から）私タイムラプス。 </li><li>共焦点画像は変形者を使用して取得し、Imarisソフトウェア（ 図1を参照）を使用して、単一粒子のダイナミクスのための自動3D粒子追跡によって分析した。我々は、回折限界のHIV-1細胞の超微細構造を有する粒子の動的挙動を相関しているので、時間経過の生細胞イメージングと3Dパーティクルトラッキングは結果に重要です。しかし、大規模な静的構造のために、シンプルな蛍光画像（ライブセルなし）相関分析のための十分であろう。 </li></ol> 3。冷凍水和EMサンプル調製サンプルの最後の共焦点画像とクライオ固定のコレクションの間の時間遅延を最小限に抑えるために、FEI Vitrobot（または他のガラス固化装置）蛍光共焦点ライブセルイメージのコレクションの間に開始され、プランジ凍結のために準備されるべきである。<ol><li>ガラス固化装置の電源をオンにし、22にその気候温度を設定°C、100％に目標湿度、7秒にブロッティング時間、待機して1秒までの時間をドレイン。 </li><li>プランジ​​ャーデュワーのグリッドストレージボックスを置き、冷たい液体エタンを準備します。ガラス化デバイスにデュワーをマウントします。 </li><li>直ちに共焦点ライブセルイメージング（セクション2）の後、氷冷した銅ブロック上に培養皿を配置し、低温電子顕微鏡の試料準備室に転送します。専門のピンセットにEMグリッドをロードし、迅速グリッド上の任意のメディアを離れてしみ。ブロッティングを0.2μm、蛍光ミクロスは直ちにグリッドに配置され、15 nmの金ビーズ溶液4μlのを混合した後、濾紙で、手作業で行われます。金ビーズは断層データ収集および整列を助けるために基準マーカーとして使用される。蛍光ミクロスフェア（ 図2cは-2fを参照 ）、蛍光灯や電子顕微鏡の画像間の相関を支援するために使用されている。 </li><li>ガラス化デバイスにピンセットをロードし、液体エタン16に凍結ブロットおよび突入するようにデバイスに指示します。最良の結果を達成するために最適化されたブロッティングパラメータは次のとおりです。ブロット時間、7秒、ブロットオフセット、0;ドレイン時間、1秒、温度22℃、そして湿度100％。 </li><li>後で使用するために即時cryoETイメージングのための低温電子顕微鏡ホルダー、または液体窒素貯蔵デュワーに冷凍水和グリッドを転送します。 </li></ol> 4。クライオ蛍光顕微鏡自作、クライオ蛍光試料室とステージシステム（ 図3）は、ステップ4.1から4.10を遂行するために必要とされる。詳細な仕様、ステージの説明6月らで見つけられるかもしれません。15。 <ol><li>少なくとも2時間低温蛍光顕微鏡（ 図3aを参照）を開始する前に液体窒素で自己加圧された液体窒素デュワーを埋める。 </li><li>手製のクライオ-FをマウントこのようなオリンパスIX 71として倒立蛍光顕微鏡へluorescence試料ステージ15（ 図3）。 </li><li>自己加圧デュワーに低温試料ステージの液体窒素の注入口を接続し、適当な容器に液体窒素オーバーフロー保護のコンセントを配置。霜のレンズは暖かく、自由を維持するために対物レンズの上に置かスリーブに乾燥窒素ガスラインを接続します。 </li><li>凍結した水和サンプルグリッドをロードするためのクライオ段室に銅ブロックのプラットフォーム（図3bに黒い矢印）を配置します。クールダウンし、自己加圧充填デュワーから入口ラインを通して液体窒素で凍結ステージの銅室を埋める。 </li><li>低温ステージは、液体窒素温度（約4-6分）に達すると、低温ステージにグリッドストレージボックス（ステップ3.5から）転送する。 </li><li>銅ブロック上にEM試料カートリッジに凍結した水和サンプルグリッドを配置し、GをクリップC-リング（Polara顕微鏡カートリッジを使用している場合）を使用して、所定の位置に取り除く、または場所でも後のグリッドを簡単に取得するためにグリッドを維持するために、（ 図3dの黒い矢印）上に予め冷却した銅リングを配置低温蛍光イメージング（非Polara低温電子顕微鏡のための場合）。 </li><li>クライオステージ（図3bで白矢印）の内側のチャンバーにカートリッジを（ステップ4.6から）に置きます。 </li><li>ライブセルイメージングデータから同じウイルス粒子を検索し、見つける。 EMグリッドがインデックスを持っているので、生細胞画像やクライオ蛍光画像の両方のグリッドで同じ粒子をローカライズするために簡単です。 </li><li>長い作業（2.7〜4ミリメートル）の対物レンズの光顕微鏡を用いて低温条件下で識別位置にクライオDICとGFPの画像を取得する。低温蛍光イメージングの間、定期的に、クライオステージと補充、それを中の液体窒素レベルを確認し、必要に応じて、-170を下回る試料ステージを維持する℃の</li><li>クライオ蛍光イメージングが完了した後、注意深く銅ブロックプラットフォームに試料カートリッジを返し、Polaraシステムとの将来cryoET分析のために液体窒素デュワーにカートリッジを格納する。非Polara低温電子顕微鏡を使用している場合は、銅リングを取り外し、サンプルグリッドを取得し、グリッドストレージボックスに入れて、試料がcryoETによって検査されるまで、液体窒素デュワーに標本を保管する。 </li><li>データ解析のために、取得されたクライオDICとGFPの画像をオーバーラップする（ステップ4.9から、 図4bを参照）、生細胞イメージング系列的に得られたものと極低温におけるGFP蛍光画像信号の位置を相関させる。 </li></ol> 5。クライオ電子線トモグラフィー<ol><li>このようなPolara G2顕微鏡として電界放出銃、装備電子顕微鏡の低温乗換駅に試料カートリッジをロードします。 </li><li> 140X、IDEの倍率で低線量検索モード下ntifyとステージファイルに関連付けられたグリッドの正方形を（ステップ4.11から）保存します。 </li><li> 3,500 Xの倍率で低線量の検索モードで、100μmの対物絞りを挿入し、検索及び第2段ファイルにGFP信号と相関すべての位置を保存します。 </li><li>重要炭素領域で氷を離れて燃焼させることにより、ステージyの関数を使用して、/Å2と傾斜軸を改良-低線量被ばくのモードでは、1または2の電子の用量にビーム強度を調整するために空白の領域を見つけるいくつかの金のビーズで。 </li><li>低線量フォーカスモードの下で、2〜3μmの焦点距離を調整し、チルト軸に対して平行になるようにフォーカスの方向を揃える角度を調整。 </li><li>低線量の検索モードでは、（ステップ5.3から）保存された位置を思い出し、試料ユーセントリックの高さを調整し、関心のある領域のための傾きの範囲を確認してください。博覧会で、8〜10μmのデフォーカスで-非常に低電子線量（/Å2〜1のe）と投影画像を取得低温電子断層撮影のための相関ウイルス粒子を確認するUREモード。 </li><li>低線量フォーカスモードに切り替えます。 TEMオート機能メニューで、フォーカスエリアに自動ユーセントリックの高さとフォーカス機能を先行。 </li><li>チルトシリーズを取得するためのパラメータを設定します。 /Å2総線量-本論文では、±70°、下45度、上記の範囲の傾斜角度、3°、2℃でチルト刻み、それぞれ、 図4の場合は6μmではフォーカスと約70 eで、使用された。 </li><li>保存されているすべてのポジションについて、手順5.7と5.8を繰り返します。バッチトモグラフィーソフトウェアは、スループットを増加させるために複数の位置で自動化されたデータ収集に使用することができる。 </li></ol> 6。 IMOD 17を用いて三次元再構成<ol><li>最小値と最大密度の値を調整し、大きなイメージシフトによる除外する任意のビューが存在するかどうかを判断するために生のチルトシリーズを点検。 </li><li> eTomoと軸タイプ、ピクセルサイズ、基準直径などを使用してセットアップ断層パネルを起動します。その後comのスクリプトを作成します。 </li><li>断層計算のいくつかの段階が調整/同時に追跡することができるように、メインウィンドウを設定します。必要なパラメータを変更し、各処理工程（eTomoチュートリアルを参照してください、で必要とされる特定のプログラムを実行<a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html" target="_blank">http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html</a> ）。 </li><li>最終段階で、完全整列スタック（0.6未満の平均残存エラーで）を作成し、IMODで加重逆投影アルゴリズムを使用して断層像を再構築する。 </li><li>コントラストと明瞭度を向上させるために適切なパラメータをIMODで実装3D非線形異方性拡散エッジ強調プログラムを使用して興味のある潜在的な領域をノイズ除去。 </li></ol>

<ol><li>Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+cells+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Visualizing cells at the nanoscale.</a> Trends in Biochemical Sciences. 34, 60-70 (2009).</li>
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<li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> European Journal of Cell Biology. 88, 669-684 (2009).</li>
<li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromachining+tools+and+correlative+approaches+for+cellular+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 172, 169-179 (2010).</li>
<li>Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+tomography+of+vitreous+sections+from+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells.</a> Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).</li>
<li>Jun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+HIV-1+with+correlative+live-cell+microscopy+and+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography.</a> Structure. 19, 1573-1581 (2011).</li>
<li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21, 129-228 (1988).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li>
<li>Whitfield, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+periodically+expressed+in+the+human+cell+cycle+and+their+expression+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors.</a> Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).</li>
<li>Agronskaia, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+fluorescence+and+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrated fluorescence and transmission electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).</li>
<li>Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused-ion-beam+thinning+of+frozen-hydrated+biological+specimens+for+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 4, 215-217 (2007).</li>
</ol>

著者らは競合する経済的利益を宣言しません。

我々はcryoET続いタイムラプス共焦点、生細胞蛍光イメージングを用いた動的な細胞事象を分析するための高度な相関的アプローチを提供するために、プロトコルの簡単なセットを提示している。高解像度のcryoETで3D生細胞イメージングを相関する我々の方法論の開発は多くの困難な生物学などの（非静的、以前に報告されているように）、稀な動的可視などの問題、および回折限界ウイルス粒子および宿主細胞との相互作用を調査することが重要である。生きた細胞内の特定の粒子の空間的および時間的挙動は、生細胞分析することを特徴とする、定義された感染段階でのウイルス - 細胞相互作用の詳細構造が検討されている。自家製、クライオ光学顕微鏡ステージは、電子顕微鏡によって撮像生細胞及び画像から蛍光画像間の直接的な相関関係を容易にするために使用される。 に心に留めておくべきいくつかの重要なポイントがあります最適なデータの収集と分析を持つように命ずる。グリッドのエッジがでチルトシリーズの取得のための視野を妨げるので、まず、時間経過共焦点ライブセルイメージングのための複数のポジションを選ぶ際に、選択された位置は、EMグリッド...

クライオ電子線トモグラフィー（cryoET）は細胞や組織の三次元（3D）の可視化を可能にし、クローズに生理的状態1の分子分解能でネイティブ小器官と細胞構造の組織に洞察力を提供する強力なイメージング技術である。しかしながら、それらの放射線感受性と組み合わせた染色凍結水和した検体の本質的に低いコントラストは難しい細胞内の関心のある領域を特定し、続いて標的領域に損傷を与えることなく、正常に傾斜シリーズを行うことができる。これらの問題を克服するために、光学および電子顕微鏡法を組み合わせた相関アプローチが必要である。蛍光標識によって強調され、特定の機能を特定し、蛍光顕微鏡で配置した後、それらの座標は、高解像度の3D構造データの取得のための電子顕微鏡に転送されます。この相関方法は、標的を見つけるのに役立ちます対処すべき関心のREAS。電子顕微鏡（&lt;300 nm）を有する試料の厚さに制限があるため、現在のセルの周辺領域のみがCryoETによる3次元構造解析に適している。さらに8を区画またはクライオ集束イオンビーム（FIB）加工9によって相関イメージングの能力を拡大する硝子によって凍結された水和試験片の厚さを減らすことができます。 以前は、相関の方法は、主に大規模な静的構造10-13用cryoETデータ収集を容易にするために使用された。これらの研究では、クライオステージは電子顕微鏡グリッドを受け入れ、正立顕微鏡や倒立顕微鏡10,11,14いずれかに適合するように実装されています。グリッドを切り替えると、そのデザインにかなり簡単に見えますが、EMグリッドのために必要な手順を転送するグリッドが、変形破損及び汚染される可能性があるという可能性を高め、追加があります。我々は最近の技術進歩を実証私たちが直接そのようなHIV-1と感染15の初期段階での宿主細胞の相互作用などの性質によって捕捉することが困難である動的なイベントを、視覚化することができ相関顕微鏡。そこで我々は、相関を容易にする、グリッド取り扱いによる試料の損傷を最小限に抑えるためにカートリッジシステムを適合させるクライオ光学顕微鏡の試料ステージの設計および実装することによって、これを達成した。私たちの設計では、両方のクライオ光と低温電子顕微鏡法は、このようにして相関処理を合理化し、試料移送することなく、同一の試料ホルダ上に、順次、行うことができるように、統合された試料カートリッジホルダを備えている。さらに、我々はまた、基準マーカーとして蛍光ラテックスビーズを用いて正確かつ信頼性の高い相関手順を実施した。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine</td><td>Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>F1141-1MG</td><td>EMグリッド上のHeLa細胞培養</td></tr><tr><td>Cell tracker</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>C34552</td><td>Red CMTPX</td></tr><tr><td>Protein A gold conjugates</td><td>Ted Pella, Inc., Redding, CA</td><td>15822-1</td><td>15 nm 直径</td></tr><tr><td>0.2 &mu;m 蛍光マイクロスフィア</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>F8811</td><td>黄緑色蛍光</td></tr><tr><td>熱不活性化子牛胎児ウシ血清</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ガラス底培養皿</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>金quantifoil finder EMグリッド</td><td>Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany</td><td>R2/2 Au NH2 200 mesh</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</strong</td></tr><tr><td>>Glow-discharge device 100X</td><td>EMS, Hatfield, PA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun FEI</td><td>,オレゴン州</td><td></td>ヒルズボロ <td>300 keV</td></tr><tr><td>Vitrobot Mark III</td><td>FEI, Hillsboro, OR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX 71 顕微鏡</td><td>Olympus America Inc., Center Valley, PA</td><td></td><td>LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm 作動距離) 対物レンズ</td></tr><tr><td>Nikon TiE 顕微鏡</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY</td><td></td><td>using a 60X/1.35 NA 油浸対物レンズ</td></tr><tr><td>スイープフィールド共焦点顕微鏡</td><td>Prairie Technologies, Middleton, WI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tokai Hit live cell chamber</td><td>Tokyo, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クライオ蛍光サンプルステージ</td><td>自作</td><td></td><td>機械工場による自作、デザインについては参考文献15を参照してください。</td></tr></tbody></table>

ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

クライオ電子線トモグラフィー（cryoET）が近い対生理状態1の分子分解能で細胞構造の3次元可視化を可能にします。しかし、cryoETとの宿主細胞環境内の個々のウイルスの複合体の直接可視化は、特にHIV-1の場合には、ウイルスの侵入のまれと動的な性質のために、2に挑戦している。タイムラプスライブセルイメージングは、HIV-1 3-7のライフサイクルの様々な側面についての多くの情報が得られているが、生きた細胞の顕微鏡検査によって得られる分解能は（〜200 nm）で制限されています。私たちの仕事は、生細胞蛍光顕微鏡、低温蛍光顕微鏡、およびcryoETを組み合わせることにより、HIV-1感染の初期のイベントの直接可視化を可能に相関法を開発することを目的とした。このようにして、生細胞とクライオ蛍光シグナルを正確にcryoETにおけるサンプリングを導くために使用することができる。さらに、構造情報はcryoET缶Bから得られeは、蛍光標識された標的の生細胞イメージングを通じて得ダイナミック機能データで補完。 このビデオの記事では、我々は、HIV-1と3D相関高速ライブセルイメージングと高解像度cryoET構造解析を用いた宿主細胞の相互作用の構造的な調査のための詳細な方法とプロトコルを提供します。 HIV-1粒子に感染したHeLa細胞を、生細胞の共焦点顕微鏡法によって特徴付けられた第一及びそのウイルス粒子を含む領域は、その後、3次元構造の詳細については、低温電子断層撮影法によって分析した。撮像データは、光学撮像と電子撮像、の2つのセットの間の相関が自作低温蛍光顕微鏡ステージを使用して達成された。ここで詳述アプローチは、ウイルス宿主細胞の相互作用の研究のためだけでなく、そのような細胞シグナル伝達、膜受容体の輸送、および他の多くの動的な細胞プロセスのような細胞生物学の広範な用途に限らず、貴重であろう。&lt;/ P&gt;

ウイルス粒子の動的挙動を特徴づけるために、HIV-1に感染したHeLa細胞を、高速共焦点生細胞顕微鏡によって撮像され、粒子の動きは、自動化された3次元粒子追跡（ 図1）によって分析した。最後の共焦点ライブセルイメージとプランジ凍結（相関HIV-1粒子を失うことに十分な長さであるかもしれない）、クライオ蛍光顕微鏡ステージ（ 図3のコレクションの間に発生することができ、数分の時間経過を回避するために、光）顕微鏡で、低温電子顕微鏡カートリッジ内に、イメージング凍結水和サンプル15のために設計され、建設された。銅ブロックのプラットフォーム（図3b、黒矢印）と銅リング（ 図3d、矢じり）は、非Polara電子顕微鏡で使用するために追加されました。共焦点生細胞、クライオ蛍光顕微鏡との間の相関、及びcryoETはインデックス金Quantifoilグリッドと0.2＆ムーを使用して達成された<html>であり、m蛍光ラテックスビーズ（ 図2）。まとめると、 <str...

我々は高速3D生細胞の蛍光顕微鏡および高分解能低温電子断層撮影法を組み合わせた相関顕微鏡法を記載している。我々はダイナミックイメージング、宿主HeLa細胞との相互作用小HIV-1粒子による相関法の能力を実証する。

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

この手順の全体的な目的は、ホストのHeLa細胞と相互作用する動的な小型HIV-1粒子のイメージングを通じて、相関蛍光光顕微鏡およびクライオ電子顕微鏡法の使用法を実証することです。まず、ガラスボトム培養皿内の金フィンダーEMグリッド上にHeLa細胞を播種・培養し、GFP標識HIV-1粒子をHeLa細胞に感染させます。次に、HIV-1感染細胞のタイムラプス高速3D生細胞共焦点画像を収集し、ガラス化後の単一粒子のダイナミクスを自動3D粒子トラッキングによって解析します。ライブセルイメージングデータから得られた同一のウイルス粒子サンプルを、さらなる高解像度3Dクライオ電子トモグラフィー解析のためにクライオ蛍光画像内で特定します。最終ステップとして、HIV-1粒子が含まれると特定されたすべての位置について、傾斜クライオ電子顕微鏡投影シリーズを収集し、imadソフトウェアを用いた重み付き逆投影アルゴリズムによって3Dトモグラムを再構成します。最終的に、高度な3D相関ライブセル蛍光顕微鏡法と高解像度クライオ電子トモグラフィーを用いることで、回折限界のダイナミックなウイルス粒子およびそれらと宿主細胞との相互作用を直接可視化します。本研究の目的は、HIV-1感染イベントのみを直接可視化することを可能にする相関手法を開発することです。このように、生細胞蛍光顕微鏡、クライオ蛍光顕微鏡、およびクライオ電子トモグラフィーを組み合わせることで、生細胞およびクライオ蛍光信号を用いて、クライオ電子トモグラフィーにおけるサンプリングを大幅にガイドすることができます。さらに、クライオ電子トモグラフィーから得られる構造情報は、蛍光標識ターゲットの生細胞イメージングを通じて得られる動的な機能データによって補完することが可能です。本手法または既存手法の主な利点は、高解像度の3Dクライオ電子トモグラフィーアプローチを伴う高度な相関高速3D生細胞イメージングを適用することで、感染初期におけるHIV-1と宿主細胞の相互作用など、本質的に捉えることが困難な動的イベントを研究できる点にあります。細胞培養用のグリッドを準備するため、200 mesh R 2/2 Quantifoil ゴールド EM finder グリッドのカーボン側を、25 mA以下で25秒間グロー放電処理します。EM グリッドを 50 µg/mL のフィブロネクチン溶液 40 µL の液滴の上にカーボン側を下にして浮かべ、フィブロネクチンでコーティングします。消毒のため、組織培養フード内の UV ライトの下で2時間放置します。ガラスボトム培養皿を用いて、HeLa 細胞を 2 × 10⁴ cells/mL の密度でグリッド上に播種します。適切なサプリメントを添加したDMEM中にて、HIV-1感染前に細胞を37 °C、5% carbon dioxideの条件下で約18時間インキュベートします。HIV感染に先立ち、ガラスボトム培養皿内のHeLa細胞に蛍光細胞トラッカーを添加し、蛍光色素を取り込ませるため皿を37 °Cで10分間インキュベートします。細胞をPBSで洗浄し、あらかじめ加温した新鮮な培地50 µLを添加します。この皿を、スイープフィールド共焦点走査顕微鏡の37 °Cに設定されたライブセルチャンバーに設置します。cryo EMでは、試料の比較的薄い領域が必要となるためです。1視野あたり1〜3個の細胞が含まれ、かつ細胞が最も広がり平坦な、2つの有糸分裂相の間にある状態の視野を複数選択し、今後のイメージングのためにこれらの位置をNIS Elementsソフトウェアで保存します。次に、GFP-VP Rを含むVSVG擬似型HIV-1粒子を、EMグリッドを乱さないように注意しながら、ディッシュの底部のウェルに感染させます。イメージング位置はあらかじめ選択し保存してあるため、ウイルス添加直後から、 previously selected positions で20〜40分間、タイムラプス高速3D共焦点画像を収集します。共焦点生細胞イメージングの直後、培養皿を氷で冷却した銅ブロックの上に置き、クライオ電子顕微鏡（cryo EM）サンプル調製室へ移動させます。EMグリッドを専用のピンセットに載せ、フィルターペーパーで残留している培地を素早く吸い取った後、15 nmの金コロイド粒子溶液と0.2 µmの蛍光マイクロビーズの混合液を数µL、直ちにグリッド上に滴下します。蛍光マイクロビーズは、蛍光像とクライオ電子顕微鏡像の相関解析を容易にするために使用されます。最適な結果を得るために最適化したブロッティングパラメータを用いて、プランジ凍結用のガラス化装置にピンセットを装着します。クライオ蛍光光顕微鏡の手順を開始するには、対物レンズを温めて霜を防ぐために、対物レンズの上に配置したスリーブに乾燥窒素ガスラインを接続し、自作のクライオ蛍光試料ステージを倒立蛍光光顕微鏡に取り付けます。クライオ試料ステージの液体窒素入口を自己加圧ドナーに接続し、液体窒素のオーバーフロー保護出口を適切な容器に入れます。凍結水和試料グリッドを銅ブロック上のEM試料カートリッジに入れ、グリッドを固定するために、あらかじめ冷却したCクリップリングを上に置きます。カートリッジをクライオステージの内部チャンバーに入れ、ライブセルイメージングデータの同じウイルス粒子を探索して特定します。EMグリッドにはインデックスがあるため、ライブセル画像とクライオ蛍光画像の両方で、グリッド上の同じ粒子を容易に特定することが可能です。作動距離の長い対物レンズを備えた光学顕微鏡を用い、凍結条件下で、特定した位置のクライオDIC像および蛍光像を取得します。クライオ蛍光イメージング中は、クライオステージ内の液体窒素レベルを定期的に確認し、クライオ電子トモグラフィーのために試料ステージを-170 °C以下に維持できるよう、必要に応じて自己加圧充填装置で補充してください。電界放出銃を備えた電子顕微鏡のクライオ転送ステーションに試料グリッドをロードし、140倍の倍率で低線量サーチモードにて観察します。クライオ蛍光画像が取得された領域またはグリッド正方形を特定します。相関領域の低倍率クライオEM画像を記録し、低線量サーチモード、倍率3,500 xで位置をステージファイルに保存します。100 micronの対物絞りサーチを挿入し、GFPシグナルと相関するすべての位置を2つ目のステージファイルに保存します。傾斜範囲、電子線量、デフォーカス値、および傾斜スキームを含む、ティルトシリーズ取得のためのトモグラフィーパラメータを設定します。本手順を開始するために、保存されたすべてのポジションでティルトシリーズを取得します。Tomo Graham計算の複数のステージを同時に調整または追跡できるようにメインウィンドウを構成し、必要なパラメータを変更して、各処理ステップで要求される特定のプログラムを実行します。最終段階として、主残差誤差が0.6未満の完全なアライメントスタックを作成し、重み付き逆投影アルゴリズムを用いてTomsを再構成します。ウイルス粒子の動的挙動を特性評価するためのIm modにおいて、HIV-1に感染させたHela細胞を高速度共焦点ライブセル顕微鏡で撮影し、粒子の動きを自動3D粒子トラッキングにより解析しました。この代表的な図では、黄色の矢印で示された単一の緑色蛍光ウイルス粒子を、3D共焦点スタックを用いて追跡しました。フレーム間の時間間隔を3分としたのは、最後の共焦点生細胞画像の収集からプランジ凍結までの間に、数分間のタイムラグが生じる可能性があるためです。クライオEMカートリッジ内の凍結水和試料をイメージングするために、クライオ蛍光光顕微鏡ステージが設計・構築されました。光学顕微鏡において、パネルAは銅製クライオス試料ステージを冷却するために使用される、液体窒素で満たされた加圧容器を示しています。パネルBはクライオス試料ステージの内部上部からのビューであり、白い矢頭で内部チャンバーが示されています。試料グリッドはE EM試料カートリッジに配置され、このカートリッジは黒い矢印で示された銅ブロックプラットフォームの中央に設置されます。このプラットフォームは、非極性電子顕微鏡での使用のために追加されました。サンプルグリッドをロードした後、カートリッジを内部チャンバーへ移送してクライオ蛍光光観察を行います。顕微鏡パネルCおよびDは、非極性クライオ電子顕微鏡で使用する際にグリッドを固定するための銅製リングを配置する前と後の試料カートリッジをそれぞれ示しています。高度な相関生細胞顕微鏡観察およびクライオ電子トモグラフィーにおける本手順の有用性は、ホストのHeLa細胞と相互作用する蛍光標識HIV-1粒子の直接可視化によって実証されています。パネルAに示すクライオ光学顕微鏡ステージで記録されたDIC画像に、パネルBに示すGFPタグ付き粒子のクライオ蛍光画像を重ね合わせています。タグ付き粒子は赤色で着色されています。パネルC、D、およびEは、パネルBおよびCで丸で囲まれた蛍光粒子の領域を、それぞれ140倍、3,500倍、27,500倍で撮影した低線量クライオEM画像です。パネルEの挿入図は、トモグラフィー・チルトシリーズ取得後に記録された拡大像であり、パネルF、G、HはZ方向に21 nanometersの間隔を空けて抽出した厚さ4 nanometersの3枚のトモグラフィー・スライスを示している。粒子とhelo細胞膜との接点は、挿入図およびパネルEの投影画像と、トモグラフィー・スライスの両方において矢印で示されている。パネルFおよびGにおいて。本稿では、タイムラプス共焦点ライブセル蛍光イメージングとそれに続くクライオ電子トモグラフィーを用いて、ウイルスと無菌的な相互作用のダイナミクスを解析するための高度な相関アプローチを提供する、簡便な一連のプロトコルを提示しました。この手順を行う際は、蛍光画像と電子顕微鏡画像との間の正確かつ信頼性の高い相関関係が、クライオ電子トモグラフィーの正常な取得に不可欠であることを忘れないでください。本手順で記述したデータは、細胞シグナリングや表面受容体の内部移行など、細胞生物学におけるダイナミックな細胞プロセスに関わる多くのアプリケーションに有用です。

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JoVE Journal

Bioengineering

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ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡

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