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組織学とは、主に光学顕微鏡を使用して組織や細胞の構造を研究する学問です。組織サンプルの作製方法は、サンプルの固有特性、例えば大きさや硬さ、サンプル作製後の染色方法やその他アプリケーションに基づいて大きく異なります。このビデオでは、まず組織サンプルの作製の第一の手順として固定の重要性を伝えています。固定することで、細胞死に伴い自動的に放出される酵素によって起こるサンプルの劣化を防ぐことができます。固定後は、包埋剤を使ってサンプルを一定の硬さにします。最も一般的な包埋剤はパラフィンワックスですが、凍結包埋にはグリセリン、その他にも寒天などが用いられます。包埋後は、ミクロトームやその他の切片作製装置を使ってサンプルをセクショニング（薄切）し、数μmから数mmの厚みの切片を作製します。セクショニング後は、切片をスライドガラスにのせ、サンプルの特性を明確にするために染色し、顕微鏡観察に備えます。
組織学とは、組織や細胞の構造を理解するための顕微解剖学です。光学顕微鏡を利用して質の高い結果を得るためには、適切に組織サンプルを作製する必要があります。
組織サンプルを作製するには、大きく次の３つのステップを踏みます。まず、組織の劣化を防ぎ保護するために固定します。次に、サンプルをそれと似た性質をもつ溶液に浸し、包埋します。そして、ミクロトームと呼ばれる切断装置を使って包埋したサンプルから切片を作製します。このビデオでは、解説を加えながらこれら3つのステップを紹介していきます。
組織固定は、細胞や組織を保護し、元の構造を維持するために重要なステップです。細胞死に伴い自動的に放出される酵素により、細胞全体や組織周辺の構造を維持しているタンパク質が分解し始めます。固定することで、酵素のタンパク質分解能を直接抑制できます。さらに、酵素の作用部位が不活化されることで、タンパク質の分解が抑制されます。
固定には、架橋結合と凝固の二つのメカニズムが利用されます。架橋固定はタンパク質内あるいはタンパク質同士の共有結合により、組織を硬化し分解を防止する手法です。凝固固定はアルコールなどの有機溶媒を使ってタンパク質を脱水する手法であり、タンパク質の三次構造を変性させ、疎水性つまり水を嫌う部分を表面に移動させます。凝固固定により、パラフィンワックスのような包埋剤を組織に浸透させることができます。
最もよく使用される固定液として、ホルマリンが挙げられます。これは水に溶けるとホルムアルデヒドになります。ホルムアルデヒドはアミノ酸のリジンやグルタミン側鎖のような1級アミンに作用し、メチレン架橋を形成します。この過程はゆっくりと進行し、通常一日二日かかります。
固定前に考慮すべき点がいくつかあります。まずは、サンプルの拡散性です。固定液の拡散係数と時間の平方根を乗じた値に比例して、固定液は組織間に拡散していきます。1mm浸透するのに1時間かかる固定液は5mm浸透するのに25時間かかることになります。ホルマリンが組織の中心まで達したあとも架橋反応は継続します。従って、適当な時間内で完全に固定するためには、サンプルを4mm以下の厚みにするのがおすすめです。
次に、固定液の量とpHを考慮しましょう。固定液とサンプルの比は少なくとも40対1とし、薬品がすぐになくならないようにします。中には酸性で使用すべき固定液もありますが、その多くはリン酸緩衝液で中性を維持し、過剰の酸によってアーチファクト（人工産物）が生じないようにするのが効率的です。
組織サンプル作製の2つ目のステップは包埋です。似たような硬さの包埋剤に浸すことでサンプルを保護できます。硬すぎたり軟らかすぎたりすると、セクショニングの際に壊れてしまうため、適切な包埋剤の選択が不可欠です。最も良く使用されている包埋剤はパラフィンワックスです。
パラフィン包埋する前に、サンプルを脱水する必要があります。まずはエタノールで脱水し、次にキシレンに浸した後に温めたパラフィンワックスで包埋します。ワックスがサンプルに浸潤したら、慎重に位置決めをし、さらにワックスを追加してブロックを作ります。その後、セクショニングのためにサンプルを組織包埋カセットにセットします。
セクショニングとは包埋ブロックをスライスしてサンプル切片を作製することです。光学顕微鏡観察用の切片は4から10μmの厚みが適当です。
まずは、ミクロトームに金属、ガラス又はダイヤモンド製の刃を固定します。次にサンプルをホルダーにセットします。 固定したサンプルを切りたい厚みだけ前進させててスライスしていきます。作製された薄いリボン状の切片はスライドガラスにのせて収集します。
パラフィン包埋サンプルの切片は、温水浴に浮かべた後にスライドの上に置き乾燥させます。
生物組織内では明確に区別ができないことが多いため、染色液や抗体を用いて細胞形態や特異タンパク質を染色します。 最も代表的なのはヘマトキシリン・エオジン染色つまりHE染色です。この染色法は非常に一般的なので、様々な切片を再現性良く染色するための自動染色装置があります。ヘマトキシリンは細胞核を青色にエオジンは細胞質をピンクに染めることで組織の細胞形態を確認できます。
固定することの難点は、タンパク質の架橋形成により抗体の結合部位が見つけにくくなるため標識が難しくなることです。サンプルの保護には、固定よりも組織の急速凍結つまりスナップフリージングが有用です。その後クライオセクショニングで凍結切片を作製します。
組織サンプルをOCTと呼ばれる凍結切片用包埋剤で覆い位置と向きを定め、急速冷凍します。他の包埋剤と同様OCTもサンプルの硬さに合わせる必要があります。
クライオミクロトーム又はクリオスタットは凍結切片を作製するための装置で、内部の温度を-20℃に設定でき、刃とサンプルを冷たいまま維持できます。パラフィン埋包切片とは違って、凍結切片はすぐにプラスに帯電したスライドガラスにのせることができます。
他にも固定せず、寒天を使って包埋する方法があります。溶かしたアガロースにサンプルを浸します。アガロースが冷えると組織がそこに固定されます。余分なアガロースは切り落として下さい。
ビブラトームは、ミクロトームに替わる装置であり、刃を振動させてアガロース包埋サンプルを薄く切ることができます。ビブラトームを使っうことでおよそ50から1000μmの厚みの切片を作製できます。
染色前にアガロースからサンプルを取り出しスライドにのせます。スライドは真空グリースなどで囲みサンプルがカバーガラスに押しつぶされるのを防ぎます。厚みのある切片の場合は、共焦点顕微鏡を利用することで解像度の高い画像が得られます。
ここまでJoVE光学顕微鏡検査のための組織サンプルの作製編をご覧いただきました。このビデオでは組織片から染色のための切片を作製する工程を紹介しました。ご覧頂きありがとうございました。
組織学は、組織や細胞の顕微鏡的解剖学の研究を指す用語です。光学顕微鏡用の適切な組織学的サンプル調製は、組織サンプルから高品質の結果を得るために不可欠です。
ほぼすべての組織学的手順に共通する3つの主要なステップがあります。まず、組織を保存し、組織の劣化を遅らせるために、サンプルを固定します。次に、サンプルを、それ自体と同様の機械的特性を持つ材料または埋め込み媒体に浸します。包埋されたサンプルは、ミクロトームと呼ばれる精密な切断ツールを使用して、薄いスライスに切片化(切断)されます。このビデオでは、これらの一般的な手順と、それらに関連するいくつかの概念について説明します。
組織固定は、細胞と組織の成分を保存し、それらの構造を維持するための重要なステップです。細胞死後、天然に存在する酵素が細胞小器官から放出され、細胞全体および細胞外マトリックス全体のタンパク質を分解し始め、それによって細胞の構造を破壊します。固定は、これらの酵素がタンパク質を消化する能力を直接阻害し、酵素の切断部位を認識できないようにすることにより、このような分解を防ぎます。
固定の2つの主要なメカニズムは、架橋と凝固です。架橋には、タンパク質内およびタンパク質間の両方で共有結合が形成されることが含まれ、これにより組織が硬化し、分解に抵抗します。凝固は、アルコールやアセトンを使用してタンパク質の脱水によって引き起こされ、タンパク質の三次構造を変形させ、疎水性または水を恐れる領域がタンパク質表面を移動させます。凝固固定は、パラフィンワックスなどの埋め込み培地が組織に浸透するのを助けることができます。
最も一般的に使用される固定剤の1つは、ホルムアルデヒドを水に溶かしたホルマリンです。固定中、ホルムアルデヒドは、アミノ酸のリジンやグルタミンの側鎖に見られるような第一級アミンに結合して、メテレン架橋と呼ばれる安定な架橋を形成します。このプロセスは本質的に遅く、最大1〜2日かかる場合があります。
固定する前に、いくつかの考慮事項を考慮する必要があります。まず、サンプルの拡散性を考えます。固定剤は、固定剤の拡散係数に時間の平方根を掛けた値に関連する速度で、組織を通って距離を拡散します。サンプルに1mm浸透するのに1時間かかる固定剤は、5mm浸透するのに25時間かかります。ホルマリンが組織の中心に到達したら、架橋反応シルが発生する必要があります。したがって、サンプルサイズは、妥当な時間で完全に固定するために、厚さ4mmに制限する必要があります。
次に、固定液の容量とpHを考慮します。固定液とサンプル容量の比率は、試薬が時間の経過とともに簡単に枯渇しないように、少なくとも40:1にする必要があります。一部の固定剤は酸性のpHで機能するように設計されていますが、ホルマリンはリン酸で緩衝して中性のpHを維持すると最も効果的であり、過剰な酸が生成されて組織にアーティファクトが発生することはありません。
組織学的調製の次のステップは、標本自体と同様の機械的剛性を持つ媒体に標本を支持する包埋法です。適切な埋込み媒体を選択することは非常に重要です、なぜなら、硬すぎたり弱すぎたりすると、切片化中に欠陥が発生する可能性があるためです。これまで、埋め込みに使用される最も一般的な媒体はパラフィンワックスです。
パラフィン包埋に先立ち、組織内の水分をエタノール、次にキシレン、最後に加温したパラフィンワックスで置き換えて、サンプルを脱水する必要があります。ワックスがサンプルに浸透したら、慎重に配置し、型を使用して追加のワックスで囲んでブロックを形成します。次に、サンプルを組織カセットに取り付けて切片化します。
セクショニングとは、埋め込みブロックからサンプルの薄いスライスを切り取るプロセスです。切片は通常、光学顕微鏡で使用するために4〜10μmの厚さです。
切片を切断するには、まず金属、ガラス、またはダイヤモンドの刃をミクロトームに固定します。その後、サンプルをサンプルホルダーに入れます。次に、サンプルを切断面まで進め、ブレード全体に引き寄せて、目的の厚さのスライスを作成します。セクションは細いリボンとして蓄積され、スライドガラスに配置できます。
切片化後、サンプルをスライド上に置きます。パラフィン包埋サンプルの場合、スライスは最初に温められた水浴に入れられ、次に水からスライド上に持ち上げられ、乾燥させます。
生体組織には固有のコントラストがほとんどないため、組織型検査の後、スライドは通常、形態や特定のタンパク質を強調する色素や抗体で染色されます。最も一般的な染色は、ヘマトキシリンとエオシン、またはH&Eです。ヘマトキシリンは細胞の核を青色に染色し、エオシンは細胞質をピンク色に染色し、組織の細胞形態を明らかにする。
固定化の欠点の1つは、タンパク質の架橋により、抗体が結合部位を見つけるのに時間がかかることです。サンプルを保存するために固定を使用するのではなく、組織の急速凍結、またはスナップ凍結を使用することができ、その後、凍結切片化
と呼ばれる切片化技術が続きます組織サンプルは、OCTと呼ばれる特殊な凍結媒体、または最適な切断温度媒体に埋め込まれ、配向され、その後急速に凍結されます。他の埋め込みメディアと同様に、OCTはサンプルの剛性と一致します。
クライオミクロトームまたはクライオスタットは、凍結切片を切断するために使用され、この装置は内部温度を-20に保ちますか?C:カッティングブレードとサンプルを冷たく保ちます。パラフィン包埋切片とは対照的に、凍結切片は、切片化直後に正に帯電したスライドガラス上に直接持ち上げることができます。
固定を避ける別の方法は、サンプルを新たに調製した液体アガロースで覆う寒天包埋法です。アガロースが冷えると、組織が所定の位置に固定され、余分なアガロースをトリミングできます。
ミクロトームの別の代替品であるバイブロトームには、アガロースに埋め込まれたサンプルを振動して移動するブレードがあります。バイブロトームは、アガロース包埋サンプルから50〜1000μmのオーダーで厚い切片を作成するために使用されます。
通常、サンプルは染色前にアガロースから取り出し、カバーガラスがサンプルを押しつぶさないように真空グリースなどの物質で囲んだスライド上に置きます。これらは、各厚い切片の高解像度画像を取得するために、共焦点顕微鏡を使用して見るのが最適です。
JoVEの光学顕微鏡用組織学的サンプル調製に関するビデオをご覧になりました。
これで、組織片から染色可能な切片に到達するためのサンプル調製に必要な手順を理解できたと思います。いつものように、ご覧いただきありがとうございます!
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