Name: 標的ウイルスタンパク質の分析はHER2 +腫瘍に配信ナノ粒子 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: 学ぼうHER2陽性腫瘍への標的ナノ粒子HerDoxのマルチモード光学イメージング解析法。マウス尾静脈注射から共焦点イメージングまで、腫瘍標的性と浸透性を定量的に評価する技術を解説します。

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この作品は、健康/国立がん研究所の国立研究所（R01CA129822とR01CA140995）からLKM-Kへの補助金によって賄われていた。継続的なサポートのためにメディナ-Kauweのおかげでレイ、M. M-KauweとD. Revetto博士。

1。 生体内で全身送達<ol><li> 6-8週齢NU / NUマウスベアリング皮下二国間のフランク異種移植腫瘍に対する注射当たりHerDoxの0.004 mg / kgで投与量の0.2ミリリットルを同一視するように滅菌生理食塩水で十分にHerDox混ぜる。 </li><li>優しく泡を避けて、29G針を装着し3/10 ccのインスリン注射器にHerDox混合物を描画します。 </li><li> 0.5〜1リットル/分、イソフルラン濃度：3〜4％（又は低い）麻酔ガスを掃気システム（酸素流量を備えた誘導室にイソフルラン短時間の曝露によって誘導される。 </li><li>麻酔マウス（注射当たり0.2 ml）を尾静脈内に混合物全体を注入。 IV注入はまた、拘束、無麻酔マウスで行うことができる。 </li><li> 1日1回、6以上の連続日間同じマウスに注射を繰り返します。 </li></ol> 2。 インビボ蛍光イメージング腫瘍におけるHerDox蛍光の蓄積ができマルチイメージャを用いた注射の最終日（7日）によって検出される。以下の手順は、カスタマイズされたマクロ照明および検出システム（ 図1）8の使用を伴う。 <ol><li> 生体内光学イメージャでマルチモードをオンにします。 </li><li>ドキソルビシン蛍光検出に適した排出バンドパスフィルタ（590nmの±30 nm）を選択します。 </li><li>アルゴンクリプトンレーザーをオンにして、レーザー光路の励起バンドパスフィルタ（488nmの±10 nm）を配置します。 </li><li>麻酔システムの電源を入れた後、麻酔（酸素流量にマウスを置き：0.5 L /分、イソフルラン濃度：3〜4％（以下）ガス掃気システムを装備。 </li><li>麻酔からマウスが麻酔である生体内光学イメージャでマルチモードの撮影室にマウスを移す。 </li><li>マウスの鼻の上のノーズコーンを置き、連続anestheを管理する流れを開く画像取得時にSIA（酸素流量：0.5〜L /分、イソフルラン濃度：2〜3％（以下）。 </li><li> 5-15秒の露光時間を用いて蛍光画像を取得。 </li><li>バックグラウンド補正、コントラスト調整など​​の画像解析処理を行う。 </li></ol> 3。蛍光イメージングエクスビボ HerDox蛍光はHerDoxの最終（第7日）注射後24時間後に安楽死させたマウスから採取した腫瘍と特定の臓器（肝臓、腎臓、脾臓、心臓、骨格筋を含む）で撮像することができます。 <ol><li> 生体内光学イメージャでマルチモードをオンにします。 </li><li>ドキソルビシン蛍光検出用の放射帯域通過フィルタ（580nmの±20 nm）を選択します。 </li><li>アルゴンクリプトンレーザーをオンにして、レーザー光路の励起バンドパスフィルタ（488nmの±10 nm）を配置します。 </li><li>場所の腫瘍および特定の臓器は、イメージングチャンバーOにペト​​リ皿上に配置されfの生体光学イメージャでマルチ。 </li><li> 5-15秒の露光時間を使用して組織の蛍光画像を取得。初期蛍光画像取得の一例を図2aに示されている。背景（図2b）となる空のペトリ皿を使用して同じように繰り返します。 </li><li>バックグラウンド補正、コントラスト調整など​​の画像解析処理を行う。補正された画像の例を図2aから図2bの減算に起因する、 図2cに示されている。 </li></ol> （4）腫瘍の in situ共焦点イメージング 現場共焦点イメージングで細胞レベルでHerDox腫瘍蓄積の検出と分析を可能にします。 <ol><li>ライカSPE共焦点顕微鏡をオンにします。 </li><li>ドキソルビシンためのドキソルビシン及び発光波長（560から620 nm）での励起のために488nmのレーザ光を選択蛍光検出。 </li><li>対物レンズ上の40Xまたは63X客観アンドドロップイマージョンオイルを選択します。 </li><li>手順2で説明したように以前にHerDoxとモックの治療を受けた安楽死させたマウスからの新鮮な腫瘍を抽出します。 </li><li>氷の上でペトリ皿の上に置いて腫瘍は組織の劣化を避けるために、次に共焦点イメージングのためのデルタT室に腫瘍を転送します。 </li><li>シーケンシャル焦点深度（1ミクロン、厚さ：20μmのステップサイズ）で腫瘍の共焦点画像を取得する。 z軸に沿って順次取得された画像の例を図3、左側のパネルに示されている。 </li><li>最大強度画像のz投影を実行します。 z軸積層画像の最大強度の投影は、図3、右のパネルに示されている。 </li><li> 最大強度Zの蛍光強度を意味計算- 。投影画像をビューの全体のフィールドの上に画像の蛍光強度の平均値を計算したImageJのを使用します。d。 </li></ol> 5。レシオメトリックスペクトルイメージングと解析レシオメトリックスペクトルイメージングと分析Doxを蛍光と自家蛍光の判別を可能にします。 <ol><li>蛍光共焦点レーザ走査型顕微鏡の電源をオンにします。 </li><li>ステップ10nmのサイズ、およびライカSPE共焦点顕微鏡を用いて488 nmの光で励起で、510から650ナノメートルのスペクトル範囲内で指定された深さでHerDox処理と未処理の腫瘍の15の画像を取得する。 </li><li>ドキソルビシン100μMのソリューションを準備します。 </li><li> Doxを蛍光（：510から650 nmであり、ステップサイズ：10 nmのスペクトル範囲）の純粋なスペクトルの署名を取得するために100μMのドキソルビシンソリューションの分光イメージングを実行します。グラフは、図4に示すように、得られた分光イメージング蛍光スペクトルからの画像取得の典型的な結果をプロットした。 </li><li>画像Cからの自家蛍光スペクトルの署名を取得未処理の腫瘍の分光イメージングによって得られたUBE（10 nmのスペクトル範囲：510から650 nmであり、ステップサイズ）。グラフは、図5に示すように、得られた分光イメージング蛍光スペクトルからの画像取得の典型的な結果をプロットした。 </li><li>我々は9を開発したプログラムを使用して、4つの基準スペクトルシグネチャを（純粋自家蛍光、0.1.doxorubin +0.9。自家、0.2。ドキソルビシン+0.8。自家、0.3.doxorubin +0.7。自家蛍光）を生成します。 4つの基準スペクトル特性を示す典型的な曲線を図6に示す。 </li><li>我々は以前に9を開発したプログラムを使用したユークリッド距離尺度を通して基準スペクトルシグネチャで定義されている画像のスペクトル分類を実行します。 </li><li>レシオメトリックスペクトルイメージングと解析との比較のために、我々は7を開発したスペクトルアンミキシングプログラム（ImageJの中でプラグイン）、10を使用して、それらの画像の線形スペクトルアンミキシングを行います。電子線形スペクトルアンミキシングすることにより自家蛍光からHerDox蛍光を分離するXAMPLEは、 図7に示されている。 </li></ol>

<ol><li>Agadjanian, H., Chu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+Targeting+by+DNA+Capture+in+Viral+Protein+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy Targeting by DNA Capture in Viral Protein Particles.</a> Nanomedicine. 7 (3), 335-352 (2012).</li>
<li>Agadjanian, H., Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+detection+and+elimination+by+a+targeted+gallium+corrole%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (15), 6105-6110 (2009).</li>
<li>Agadjanian, H., Weaver, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+delivery+of+corroles+to+cells+via+noncovalent+conjugates+with+viral+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Specific delivery of corroles to cells via noncovalent conjugates with viral proteins.</a> Pharm. Res. 23 (2), 367-377 (2006).</li>
<li>Medina-Kauwe, L. K., Maguire, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-viral+gene+delivery+to+human+breast+cancer+cells+by+targeted+Ad5+penton+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Non-viral gene delivery to human breast cancer cells by targeted Ad5 penton proteins.</a> Gene Therapy. , 81753-81761 (2001).</li>
<li>Medina-Kauwe, L. K., Kasahara, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3PO%2C+a+novel+non-viral+gene+delivery+system+using+engineered+Ad5+penton+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">3PO, a novel non-viral gene delivery system using engineered Ad5 penton proteins.</a> Gene Therapy. , 8795-8803 (2001).</li>
<li>Rentsendorj, A., Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Typical+and+atypical+trafficking+pathways+of+Ad5+penton+base+recombinant+protein%3A+implications+for+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Typical and atypical trafficking pathways of Ad5 penton base recombinant protein: implications for gene transfer.</a> Gene Ther. 13 (10), 821-836 (2006).</li>
<li>Hwang, J. Y., Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodality+Imaging+In+vivo+for+Preclinical+Assessment+of+Tumor-Targeted+Doxorubicin+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Multimodality Imaging In vivo for Preclinical Assessment of Tumor-Targeted Doxorubicin Nanoparticles.</a> PLoS ONE. 7 (4), e34463(2012).</li>
<li>Hwang, J. Y., Wachsmann-Hogiu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multimode+Optical+Imaging+System+for+Preclinical+Applications+In+Vivo%3A+Technology+Development%2C+Multiscale+Imaging%2C+and+Chemotherapy+Assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">A Multimode Optical Imaging System for Preclinical Applications In Vivo: Technology Development, Multiscale Imaging, and Chemotherapy Assessment.</a> Mol. Imaging Biol. , (2011).</li>
<li>Hwang, J. Y., Gross, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+spectral+imaging+for+fast+tumor+detection+and+chemotherapy+monitoring+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo.</a> J. Biomed. Opt. 16 (6), 066007(2011).</li>
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<li>Hwang, J. Y., Moffatt-Blue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimode+optical+imaging+of+small+animals%3A+development+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+of+SPIE%22%5BJournal%5D)">Multimode optical imaging of small animals: development and applications.</a> Proc. of SPIE. 6411, (2007).</li>
<li>Ducros, M., Moreaux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+unmixing%3A+analysis+of+performance+in+the+olfactory+bulb+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Spectral unmixing: analysis of performance in the olfactory bulb in vivo.</a> PLoS One. 4 (2), e4418(2009).</li>
<li>Zimmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+imaging+and+linear+unmixing+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biochem.+Eng.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Spectral imaging and linear unmixing in light microscopy.</a> Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. , 95245-95265 (2005).</li>
</ol>

著者、ダニエルFarkasのは、スペクトル分子イメージングの会長である。残りの著者は全く競合する利害関係はありません。

腫瘍は皮下あるときDoxの蛍光はマルチイメージャを用いたin vivoで検出することができます。しかし、HerDoxの治療有効用量（0.004 mg / kg体重）を単回投与した後、検出しきい値を下回っている。対照的に、7毎日注射（7日間1x/day）の後、粒子の蓄積および腫瘍保持はDoxの蛍光の可視化を可能にするのに十分である。 ドキシサイクリンまたはクリーン技術が使用されていることをin vivoイメージングするための任意の他の蛍光体を取り扱う際には重要である。イメージャはドキシサイクリンは、外部または内部にあるかどうかを区別することなく、皮膚の外側に蛍光を検出し、マウスの外側のしずくは、避けるべきである。同様に、手袋にDoxの汚染が誤蛍光検出を引き起こし、動物の取り扱い中にマウスの外側に蛍光マークを残すことができます。 マルチモード光システムにおいて、レーザビームはHerDoxの励起に利用される。レーザビームは、典型的にはガウシアンプロファイルを有する。したがって、関心のある検体の均一...

腫瘍ターゲティング化学療法の、配信療法のよりは、その目的の宛先に蓄積ではなく、非腫瘍組織に配布することができるので、関連性の低い薬に比べ低用量でがん細胞を排除する可能性を秘めている。後者の状況は、薬物の有効性を希釈し、より高い用量が効果的であることが必要となるので、腫瘍標的は、標準的な非標的治療上の両方の治療と安全性の利点があります。 自己組織化ナノ粒子にカプセル化することにより化学療法を標的とする薬剤が化学的に共有結合する分子を標的にリンクされている薬とは対照的に変更されていないままにすることができます。などの結合は、薬物および標的分子の両方の活性を変化させる可能性を有し、非共有結合アセンブリは、薬物の効力を保持することができる。 我々は以前に新規な三成分、自己組織化錯体、HerDoxは、HER2 +腫瘍を標的とすることが示されている<em&gt; in vivoおよび心臓1を含む、正常組織を温存しながら腫瘍成長アブレーションを引き出す。 HerDoxは、小さな核酸リンカーを介して結合受容体細胞侵入タンパク質、HerPBK10、及び化学療法剤、ドキソルビシン（ドキシサイクリン）の間の非共有結合性相互作用を介して形成されている。 HerPBK10は、ヒト上皮成長因子受容体（HER）と結合し、エンドソーム膜の浸透は、アデノウイルス由来のペントンベースキャプシドタンパク質4-6の取り込みを介して行われている間、受容体を介したエンドサイトーシス2-4をトリガします。タンパク質上の正に帯電したドメインは、DNAインターカレードキシサイクリンを標的送達のために輸送することができるような核酸結合4,5を可能にする。求電子性、インターカレーション、及びおそらくはオリゴマー化タンパク質の相互作用は、血液や異なる温度1に長期貯蔵で安定である平均10〜20 nmの粒子に自己組織化を促進する。彼女にターゲティング優遇HER2が上昇したとき2 +腫瘍細胞を増強リガンド親和性によって促進される。 我々の以前の研究では、非腫瘍組織上および非標的Doxを1、およびin vivo 7 中の腫瘍細胞への浸透と比較して、腫瘍におけるHerDox利回り優遇蓄積のその全身送達を示している。我々は核​​1にDoxの蓄積を可能にし、腫瘍細胞侵入後HerDoxリリースDoxのことを観察した。腫瘍蓄積は比較的低HER2発現腫瘍は比較的高いHER2レベル1のものに比べてより少ないHerDox蓄積として、受容体レベルと相関することが表示されます。また、効果的な細胞死濃度が異なる細胞表面のHER2のレベル1を発現する腫瘍細胞株に対するHER2ディスプレイと逆相関を示す。腫瘍殺害解凍に比べて10倍も低い用量で発生するとHerDoxは、非標的ドックス以上の治療と安全優位性を発揮geted薬とは関連性の低いDoxの1とは対照的に、心臓（心エコー検査および組織学的染色によって検出された）や肝臓（染色TUNELによって検出された）組織には検出可能な悪影響をもたらしません。ウイルスキャプシドタンパク質からの派生にもかかわらず、HerPBK10は治療レベル2での検出可能な免疫原性を示さない。全体アデノウイルスに既存の抗体がHerPBK10を認識することができる一方で、彼らは、2細胞結合を防止することができない。 経時的に測定した腫瘍体積は、標的治療の治療効果を評価するための標準的な方法であり、HerDoxの治療効果を評価するために採用されている。 生体とex vivoでの蛍光強度イメージングでこのアプローチを補完する、私たちはより良い効率7をターゲットに評価することができました。我々は、特にそのHerDoxないことを確認しないようにDoxを蛍光のスペクトル分析で切り出した腫瘍の in situ共焦点イメージングに統合されているtは唯一のin vivoで腫瘍に蓄積されますが、細胞質と核の7への腫瘍細胞と配信ドキシサイクリンに浸透。スペクトル解析はさらに自家7からDoxの蛍光を区別することができました。 ここでは、全身送達後にin vivoで HerDoxを評価するための、より詳細に我々のアプローチを実証し、そして最も重要なのは、評価するためのマルチモードイメージング法と分析を通してターゲティング。

<table><tbody><tr><td>蛍光レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>SPE</td><td></td></tr><tr><td>In Vivo 光学イメージャー</td><td>スペクトル分子イメージング</td><td>マルチモード In Vivo 光学イメージャー</td><td></td></tr><tr><td>ドキソルビシン-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4035</td><td></td></tr><tr><td>ヌード (NU/NU) マウス、メス、6-8 週間</td><td>チャールズ リバー</td><td>ひずみコード 088</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-435 ヒト HER2+ 腫瘍細胞</td><td>NCI-フレデリックがん DCTD 腫瘍/細胞株リポジトリ</td><td>0507292</td><td></td></tr><tr><td>3/10 cc インスリン シリンジ U-100 29G x 1/2" Ultra-FineIV 永久付属針</td><td>BD</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>Delta T chamber </td><td>Bioptechs</td><td>04200417B</td><td></td></tr></tbody></table>

標的ウイルスタンパク質の分析はher2 +腫瘍に配信ナノ粒子

Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors

HER2 +腫瘍標的ナノ粒子、HerDoxは、HER2 +癌の動物モデルにおいて腫瘍優先的な蓄積および腫瘍増殖アブレーションを示す。 HerDoxは、小さな核酸リンカーを介して、化学療法剤、ドキソルビシン、腫瘍標的細胞透過タンパク質の非共有結合性の自己集合によって形成される。求電子性、インターカレーション、及びオリゴマーの相互作用の組み合わせは、ラウンド10〜20 nmの粒子に自己組織化を促進する。 HerDoxは異なる温度で血液中と同様、拡張ストレージに安定性を示す。心臓と肝臓（非標的ドキソルビシンによってマークされた被害を受けている）を含む非腫瘍組織には検出副作用、腫瘍細胞死における担癌マウス結果のHerDoxの全身送達。 HER2上昇が上昇したHER2のレベルを表示する腫瘍細胞の発現と比較して、よりHerDox蓄積を示すため、ヒト上皮成長因子受容体を発現する細胞を標的容易インビトロおよびインビボの両方で 、より低いレベルを歌う。 現場共焦点とスペクトル解析にと組み合わせる蛍光強度イメージングは、私たちが標的生体内腫瘍と全身送達後HerDoxの腫瘍細胞の浸透に確認することができました。全身送達後のマルチモードイメージングを介して標的の腫瘍を評価するためここでは詳細私たちの方法を。

図1は、蛍光強度、スペクトル、寿命、2光子内、重要な焦点、および生物発光イメージングを含む複数のモダリティ、下の画像の取得を目的として建設された生体内光学イメージャプロトタイプに示しています。さらに、このシステムに組み込まれた冷却された高感度カメラと高出力レーザー線は、特にドキソルビシン蛍光のインビボでの検出のための商業的な結像光学系11に比べて高いコントラスト蛍光画像を生成する。したがって、このシステムは、 インビボで HerDoxの評価に複数の相補的なデータポイントを取得するために、本 ​​研究で使用するために重要でした。 図2に示すように、高い腫瘍蛍光HerDoxの全身送達後に典型的な、その腫瘍優先的ターゲティングを示す。骨格筋で検出された蛍光が非定型で、あちこちになることがあり注射手続きにおけるmの異常（ つまり体に近すぎる注入）。定性的には、 図2aに示す画...

この記事の詳細腫瘍標的ナノ粒子、HerDoxの光学イメージング解析のための手続き。特に、ターゲティングおよび腫瘍浸透性を評価する腫瘍を検出するためのマルチモードの撮像装置の詳細な使用がここで記載されている。

標的ウイルスタンパク質の分析はHER2 +腫瘍に配信ナノ粒子

The HER2+ tumor-targeted nanoparticle, HerDox, exhibits tumor-preferential accumulation and tumor-growth ablation in an animal model of HER2+ cancer. ...

この手順の目的は、マルチモード光学イメージングを用いて、腫瘍標的ナノ粒子HeroXのin vivoにおける全身送達を検出し分析することです。まず、腫瘍担持マウスの尾静脈にナノ粒子を注入し、マルチモード光学イメージングシステムを用いて蛍光画像を取得します。安楽死後、腫瘍および臓器を摘出し、腫瘍細胞内の蛍光粒子を検出するために再度イメージングを行います。次に、in situ共焦点イメージングを行います。得られた画像の解析により、全身投与後、腫瘍への標的能および浸透性が定量的に示されます。単一のイメージングモードなどの既存の手法に対するマルチモーダルイメージング技術の利点は、腫瘍へのデリバリーの解析と定量化を向上させることができる、複数の相補的な情報を提供できる点にあります。この手法は、標的薬が腫瘍に届けられるだけでなく、実際に腫瘍細胞内に浸透しているかなど、薬物送達分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本プロトコルでは、私の研究室の元博士研究員であるDr.J Yun Wangと、現在の大学院生であるJanet Markmanが手順を実演します。6〜8週齢の。皮下両側脇腹にゼノグラフト腫瘍を担持させた新しいマウスを使用します。1回の投与につきHeroX 0.004 mg/kgとなるよう、HeroXを滅菌生理食塩水と混合し、0.2 mL分を調製して全身投与の準備をします。29ゲージの針を装着した3/10 ccインスリンシリンジで、HeroX混合液0.2 mLをゆっくりと吸い上げます。麻酔後、気泡が入っていないことを十分に確認してください。その後、混合液の全量を尾静脈に注入します。注入部位からの出血を防ぐため、尾をピンチして止血してください。出血が止まった後、注射部位を滅菌綿棒で清浄し、マウスをケージに戻します。同じマウスに対して、さらに6日間連続で注射を繰り返します。1日1回、腫瘍内へのHeroX蛍光の蓄積を確認し、注射最終日までに検出可能となります。7日目は、マルチモードイメージャーを使用します。ここでの手順では、蛍光強度、スペクトル蛍光、寿命、および生体内共焦点イメージング機能を備えた光学イメージングシステムを用います。ここに、in vivo光学イメージャーのプロトタイプを示します。本システムに組み込まれた冷却高感度カメラと高出力レーザーラインにより、市販の光学イメージングシステムと比較して、特にドキソルビシンの生体内蛍光検出において、よりコントラストの高い蛍光画像が得られます。ソフトウェアでマルチモード生体内光学イメージャーをオンにします。ドキソルビシンの蛍光検出に適したエミッションバンドパスフィルターを選択してください。レーザーを点灯させ、レーザー光路に励起バンドパスフィルターを配置します。麻酔チャンバー内でマウスをイソフルランにより麻酔した後、マルチモードin vivo光学イメージャーのイメージングチャンバーに移動させます。マウスの鼻にノーズコーンを装着し、流量を調整して継続的に麻酔を投与します。画像取得時には、5〜15秒の露光時間で蛍光画像を取得します。蛍光は、最終投与日から24時間後に安楽死させたマウスから採取した腫瘍および特定の臓器（肝臓、腎臓、脾臓、心臓、骨格筋を含む）でイメージング可能です。マルチモード生体光学イメージャーの電源を入れます。前述の手順と同様に、腫瘍と特定の臓器をペトリ皿に並べて配置します。マルチモードin vivo光学イメージング装置のイメージングチャンバー内で、露光時間を5〜15秒に設定し、組織の蛍光画像を取得します。その後、空のペトリ皿を用いて同様に画像を取得し、これを背景（バックグラウンド）として使用します。背景補正やコントラスト調整を含む、画像の解析および処理を行います。in situ 共焦点イメージングにより、細胞レベルでのherd herdの腫瘍蓄積の検出および解析が可能です。共焦点顕微鏡を用いて行います。ドキソルビシンの励起用に488 nmのレーザー光を、放出波長には560 nmから620 nmを選択します。ドキソルビシンの蛍光検出には、40倍または63倍の対物レンズを選択し、その上に浸液オイルを1滴垂らします。安楽死させたマウスから摘出した腫瘍は、組織の分解を防ぐため、ペトリ皿の上に配置します。次に、共焦点イメージングのために腫瘍をdelta Tチャンバーへ移します。ステップサイズ1 µm、厚さ20 µmで、腫瘍の連続的な焦点深度における共焦点画像を取得します。Z軸に沿って連続的に取得した画像の例をここに示します。画像の最大強度Z投影（Maximum Intensity Z Projection）を作成します。次に、ImageJまたは同様のプログラムを用いて、最大強度Z投影画像の全視野比における平均蛍光強度を算出します。メトリクス分光イメージングおよび解析により、ドキソルビシンによる蛍光と自発蛍光を区別することが可能です。Leica SPE共焦点顕微鏡を用い、488 nanometerの励起光で、510から650 nanometersのスペクトル範囲を10 nanometersステップで、指定の深さにおけるHeroX処理済みおよび未処理の腫瘍の画像を15枚取得する。次に、生理食塩水で100 micromolarのドキソルビシン溶液を調製する。この100 micromolarドキソルビシン溶液のスペクトルイメージングを行う。ドキソルビシンの蛍光の純粋なスペクトルシグネチャーを取得します。未処理の腫瘍を撮影することで、イメージキューブから自家蛍光のスペクトルシグネチャーを取得してください。すべてのデータの収集が完了したら、参照スペクトルシグネチャーを生成し、画像のスペクトル分類を行い、さらにそれらの画像の線形スペクトルアンミキシングを行うことで、腫瘍内へのドキソルビシンの蓄積量を定量的に評価します。共焦点蛍光画像をin situで異なる焦点深度で取得し、次いで画像の最大強度Z投影を行い、投影画像の平均蛍光強度を測定しました。この画像に示されている高い腫瘍蛍光は、her docsの全身投与後に典型的であり、腫瘍への優先的な標的能を示しています。骨格筋で検出された蛍光は非典型的であり、注入手順の異常に起因する可能性があります。定性的に見ると、この画像はバックグラウンドが低くなっています。定量分析を行うために、ここに示すように空のディッシュを用いてバックグラウンド補正を行います。得られたバックグラウンド補正後の画像は、バックグラウンド画像のエッジ部分の強度が低いため、元の画像と比較して画像の端でバックグラウンド信号が高くなります。左側に示されているスタック画像は、1 µm ごとの深度で順次取得した腫瘍組織の共焦点スキャンを代表して示したものである。右側の画像は、左側のスタック画像を統合したものである。この統合画像には、各ピクセルにおける指定された Z 深度にわたる HeroX の蓄積情報が含まれており、したがって蛍光強度の平均値は、異なる深度における腫瘍内の全体的な herd doc の蓄積を定量的に反映している。腫瘍におけるherd docの蛍光を自家蛍光と区別し、高い特異度比指標を用いてこれら2つを定量的に判別するため、スペクトルイメージングおよび解析が行われます。この画像は、ドキソルビシンの純粋なスペクトルシグネチャーを示しています。指定された放出波長における点線で囲まれた領域の蛍光強度は、510から650ナノメートルの波長スペクトルにおけるドキソルビシンのプロファイルを示すヒストグラムを作成します。ここでは、自家蛍光の純粋なスペクトルシグネチャーが示されています。未処理の腫瘍から指定された放出波長で放出される蛍光は、自家蛍光の放出プロファイルを表す傾斜を形成します。参考文献。純粋なスペクトルシグネチャーを異なる比率で混合することによっても、スペクトルシグネチャーを作成しました。プログラムを用いて、各リファレンスを開発しました。ここでのスペクトルシグネチャーは、自家蛍光に対する腫瘍に蓄積したher docksの相対蛍光を表しています。ドックおよび自家蛍光のスペクトルシグネチャを取得した後、線形スペクトルアンミキシングを用いてドック信号を分離します。図には、スペクトルアンミキシング前の自家蛍光とドックの混合画像と、スペクトルアンミキシング後に分離されたドックの画像を示しています。このビデオを視聴することで、蛍光強度、コンフォーカル、およびスペクトルイメージングの各モダリティを組み合わせ、腫瘍への送達の解析と定量化をどのように強化するかについて、十分な理解が得られるはずです。ドキソルビシンを取り扱う際は危険が伴うため、この手順を行う間は常に、二重手袋の着用や頻繁な手袋の交換などの予防措置を講じることを忘れないでください。

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