高塩ダイエットとルイスラットにおける慢性腎臓病を誘発するために一酸化窒素合成酵素阻害と組み合わせた5/6thの腎摘出

この手順の全体的な目的は、ルイスラットに慢性腎臓病を誘発することです。まず、一酸化窒素遮断剤であるNG Nitro、L-arginine、またはLNNAを4週間にわたって投与します。次に、右腎臓を全摘出します。

その後1週間後に、左腎臓の3分の2を切除します。最終的に、LNNAの投与と高塩分食の負荷を行いながら、ラットにおける腎不全の進行を経時的に追跡します。最終的に、尿中のタンパク質の測定、血液・血漿および/または尿中のヘマトクリット値とUIAの測定、ならびに収縮期血圧の測定を通じて、慢性腎臓病が成立したことを示す結果を得ることができます。

腎機能は、最終的にイヌリンおよびパラアミノ馬尿酸（PAH）クリアランスによって決定されます。この手法は、CKDの病理に関する理解を深めるなど、腎臓学分野における重要な課題の解決に寄与し、治療的介入の効果を研究するために利用できます。初回腎切除術の4週間前から、ラットの飲料水に20 mg/Lの一酸化窒素合成酵素阻害剤であるLNNAを投与し始めてください。

このタイムラインに従ってください。処置を開始する前に、70%アルコールを使用してテーブルを消毒します。手術の準備として、まず以下の器具を滅菌します。ブランケット 1枚、12 cmの1〜2歯付きスチューデント組織鉗子 1本、スチューデント標準型鉗子 1本、シムキン鉗子 2本、メイヨー鋏 1本、スチューデントアイリス鋏 1本、および鋏付きオルソン・ヘガー針持 1本です。

次に、以下の準備物を揃えます。加温パッドとランプを備えた手術台、酸素、およびイソフルラン。シェーバー、滅菌済み手術器具、5×5および10×10の滅菌ガーゼ、70%アルコール、0.9%塩化ナトリウム溶液。1 mLシリンジ、25G針、ジェルフォームパッド、4.0および5.0のバイクリル縫合糸、0.03 mg/kgのブプレノルフィン、および術後のラット用清潔ケージ。

導入チャンバー内で4% isoflurineを用いて麻酔を導入し、前鎮痛剤を投与します。必要に応じて、ラットをテーブル上の加温パッドの上に左側を下にして移動させ、2% isoflurineと1 Lの酸素の混合ガスを用いてノーズコーンで換気を行います。ラットの側腹部を剃毛し、アルコールを用いて手術部位を消毒します。

手術は準無菌環境で行われるため、より無菌的な準備として、赤色の皮膚をアルコールのみで消毒します。ベタジンでのスクラブ洗浄を行うことも可能です。ヘッドキャップとマスクを着用し、手を洗浄・消毒した後、滅菌手術用手袋を着用します。次に、解剖用ピンセットと鈍端剪刀を用いて、肋骨に平行に1〜1.5 cmの切開を加えます。

次に、背筋を鈍的剥離して右腎を露出させます。腎臓の下極が見えたら、小型の鈍的ピンセットを用いて周囲の脂肪組織を慎重に把持します。その後、ピンセットで脂肪組織をそっと牽引し、副腎を傷つけないように注意しながら腎臓を外に引き出し、腎臓と副腎を分離させます。

ピンセットを脂肪組織の内側に配置し、副腎と腎臓の間の組織をゆっくりと上方へ移動させます。腎臓をゆっくりとガーゼの上に置き、周囲の脂肪や結合組織を取り除いて視認しやすくします。腎動脈と腎静脈を特定し、緩く保持します。

結紮糸が抜けないように、血管の周囲に単結節で結紮します。切断後、腎臓と結節の間にスペースを作るため、緩んだ結節を血管に沿って大動脈側へ約0.5センチメートル慎重に移動させます。次に、結紮糸の両端を切らずに、二重結節を2箇所に結びます。

灌流が正常に停止すると、腎臓の色がすぐに褐色に変わります。次に、腎血管を腎臓の根元で切断し、腎臓を取り出します。結紮糸の長い端をそっと引っ張り、腎血管からの出血がないか確認してください。

結紮糸が血管に留まっていることを確認してください。結紮糸の長い端を切断します。残った腎血管は腹腔内に後退します。

直ちに5.0 Vicryl連続縫合糸を用いて、後肢の骨格筋を閉鎖します。ブプレノルフィン0.03 mg/kgを筋肉内に注射します。その後、4.0 Vicryl皮内縫合糸を用いて皮膚を閉鎖します。

次に、摘出した腎臓の水分を吸い取り、重量を測定します。ラットを清潔な個別のケージに戻し、半分をヒーティングパッドに乗せた状態で餌と水を与え、テキストプロトコルに従って観察します。7日後。

2回目の手術に備え、右腎臓の約3分の2の重量を算出し、少量のゲルフォームを準備します。同様の手順で左腎臓を体外へ露出させ、副腎を分離します。鋭い剪刀を左腎臓の上極に当て、一気に切除し、直ちにゲルフォームで覆い、滅菌ガーゼで軽く圧迫してください。

次に、腎臓の下極を切除し、皮膚上での凝固を防ぐために同様の方法で覆います。腎臓を持ち上げ、出血が止まるまで、滅菌ガーゼを用いて両方のジェルフォームパッドに軽い圧迫を加えます。別のフォームパッドで出血が続く場合は、ジェルフォームパッドが付着したままの残存腎を腹腔内に戻し、筋肉と皮膚を閉鎖します。

前述と同様の手順に従い、ラットの回復を観察し、飼育します。準全腎摘出後、全腎重量の約6分の1が残ります。この図は、右腎から摘出された腎重量の算出パーセンテージを、平均値および標準偏差とともに示しています。

前回の実験において、片腎摘出後の1週間で左腎の代償性肥大が起こることが判明しました。その結果、右腎の計算上の重量に基づいて決定した、除去すべき最適な腎組織量の見積もりがわずかに少なくなりました。しかし、左腎の重量を事前に確定させることは不可能であるため、この方法は腎質量の約5/6を除去するための最も正確な手法となります。腎不全の進行は、タンパク質およびクレアチニンの測定のための尿採取、血漿尿素およびクレアチニンの測定のための血液採取、および収縮期血圧の測定によって追跡します。

クレアチニンクリアランスを算出することは可能ですが、ラットでは尿細管でのクレアチニン分泌が広範に行われるため、GFRの低下を過小評価する傾向があります。このため、イヌリンおよびPAHクリアランスを用いて腎機能を決定するゴールドスタンダード法の重要性が強調されており、Connersらがその完全な手順について記述しています。イヌリンおよびPAHクリアランスは、尿検体中の濃度、尿流率、および血漿中濃度から算出されます。時間の経過とともに、慢性腎臓病（CKD）のラットでは、高血圧、貧血、蛋白尿、ならびに糸球体濾過量および有効腎血漿流量の著しい低下が生じます。

6週間後には慢性腎臓病（CKD）が確立されており、これは時間をかけて救済介入を試験するのに適切な時点です。高血圧と蛋白尿の強い進行が観察される一方で、ヘマトクリット値と腎機能は軽度の悪化を示します。本実験では重点を置いていないその他の症状として、カルシウム・リン代謝および脂質代謝の異常などが挙げられ、ラットの系統によって他にも多くの症状が現れます。CKDの発症状況は、本研究で使用したルイスラットでは著しく異なる場合があります。

高塩分食と一酸化窒素遮断剤を投与し、高血圧および血管内皮機能不全を誘発させました。これは小規模なステップです。適切に実施すれば、この手法はおよそ50分から20分で完了できます。

このビデオを視聴することで、段階的な部分腎摘出術を行い、ルーズレッド種において慢性腎臓病を誘発する方法について深く理解できるはずです。