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蛍光顕微鏡は、光学顕微鏡の拡大機能と蛍光検出機能を併せ持つとても有力な分析ツールです。蛍光は、フルオロフォアとしても知られる蛍光色素分子が、特定波長の光を吸収し発光する現象です。蛍光顕微鏡の基本的な構造は光学顕微鏡と類似していますが、それに加えて強力な光源と特殊なフィルターを有しており、サンプルに標識された蛍光を観察することができます。このビデオでは、蛍光発光のメカニズム、ストークスシフト、蛍光退色などを含む蛍光顕微鏡法の基本原理や蛍光標識抗体やタンパク質、蛍光核酸染色試薬や自然界に存在する蛍光タンパク質を使用しサンプルを標識する手法を紹介しています。キセノン又は水銀ランプ、光学フィルター、ダイクロイックミラーなど蛍光顕微鏡の主要パーツ、サンプル照射する際のシャッターの使用について、そして最後に蛍光顕微鏡のアプリケーション例を紹介しています。
蛍光とは、ある物質が特定波長の光を吸収し、それよりも長波長の光を放射することにより起こる現象です。励起状態に遷移し、余分なエネルギーを持つ不安定な状態の電子が、もとの基底状態に戻るときに蛍光が放出されます。励起光、つまり電子を高いエネルギー状態にする光は、放射される光よりも波長が短く、エネルギーが高いのが特徴です。放射される蛍光は波長が長く、低エネルギーで、色も異なります。
蛍光顕微鏡は、光学顕微鏡の機能に蛍光色素分子などの蛍光物質を励起させ、蛍光を検出する機能を合わせもった顕微鏡です。蛍光顕微鏡を利用することで、組織内の目的となる細胞や細胞内の分子を観察することができます。
蛍光顕微鏡は、光学顕微鏡の構造と類似していますが二つの大きな違いがあります。光源の種類が違うことと特殊なフィルターを使用するところです。
蛍光顕微鏡には、キセノンランプや水銀ランプのような非常に強力な光源が必要になります。水銀放電ランプから放たれる光は、白熱灯の10から100倍も明るく、紫外線から赤外線と波長領域が広いのが特徴です。蛍光顕微鏡で最も注意すべきものがこの強力な光源です。フィルターを通さず光を直接見ると、網膜を損傷させる恐れがあり、また取り扱いミスにより電球が破裂する危険性があります。
蛍光顕微鏡の基本原理はシンプルです。放電ランプから放たれた光は、励起フィルターを透過し、励起波長だけが抽出されます。
光がダイクロイックミラーにあたるとサンプルに向かって反射します。ダイクロイックミラーは励起光のみを反射する特殊な鏡です。反射された励起光は対物レンズを通ってサンプルに照射されます。サンプルから発光した蛍光は対物レンズに戻りダイクロイックミラーを透過します。
この光のうち励起波長のみがバリアフィルターで抽出され、その他の不要な散乱光は透過できません。フィルターを通った蛍光のみが検出され画像のデジタル化や接眼レンズでの観察が可能となります。
フィルターキューブは励起フィルター、ダイクロイックミラー、バリアフィルターで構成されています。フィルターキューブを切り替えることでサンプルに適した励起波長を選択でき、またダイアフラムを利用して励起強度を変えることができます。
蛍光顕微鏡で観察するには、蛍光色素分子（フルオロフォア）が重要となります。蛍光色素の種類によって、使用する励起波長と検出される発光波長は様々です。励起波長は蛍光色素分子により吸収される狭い範囲のエネルギーを持っており、励起状態に遷移させます。
励起波長は 狭い範囲のエネルギーを持っており、蛍光色素分子はそのエネルギーを吸収し励起状態に遷移します。励起後、エネルギーが低い基底状態に戻ることで発光スペクトルが放射されます。
吸収又は励起スペクトルのピークと発光スペクトルのピークとの差をストークスシフトと呼びます。この差が大きいほど２つの波長を区別でき検出しやすくなります。また、重複スペクトルがフィルターキューブ内で除去されることで、バックグラウンドが抑えられ、画像の質を高めることができます。
蛍光色素分子を長時間励起すると、蛍光退色が生じ、蛍光が弱まったり失われてしまうことがあります。蛍光の退色防止のために、アンチフェード封入材をスライドにのせ、回りをマニキュア液で固定してください。イメージングしないときは暗所に保管しておきましょう。
蛍光イメージングを開始するにあたり、スイッチを入れキセノン又は水銀ランプを点灯させ、発光が安定するまで15分ほど待ちます。
次にサンプルをステージにセットし固定します。白色光源のスイッチを入れます。低倍率の対物レンズを使用し、粗動ハンドルと微動ハンドルを調整してサンプルにフォーカスを合わせます。それからステージを上下させ観察ポイントを見つけます。
次に、バックグラウンドを減らすために必要のない室内照明や白色光源を消します。イメージングする染色に適したフィルターキューブを選択し、シャッターを開けてサンプルに照射します。
そして、フォーカスを合わせ、出てきた光をイメージングカメラに送ります。使用する蛍光色素分子や蛍光染色によって暴露時間を調整する必要があります。しかしながら、同じ染色でいくつかのサンプルを比較するときには暴露時間を一定にすることが大切です。
多重染色をイメージングするためには、蛍光色素分子に応じてフィルターキューブを変更し、新しい画像として保存して下さい。
各染色をイメージングしたあとに、重ね合わせることができます。
蛍光顕微鏡はいろいろな実験に利用され、様々な蛍光色素分子が使用されています。蛍光顕微鏡の利用例として、蛍光標識された抗体を用いたタンパク質のイメージングがあります。ここでは、レプトスピラ表面タンパク質の抗体をAlexa 蛍光標識二次抗体を使って検出しています。この二次抗体は励起させると緑色の蛍光を発します。
蛍光を特異的に標識する別の方法として、緑色蛍光タンパク質、GFPのような蛍光タンパク質を生物のDNAに組み込ませる手法があります。GFP遺伝子は、最初にクラゲから単離されたもので、細胞にある刺激を加えることにより発現させることや、ここでみられるGFPのように腫瘍細胞に特異的に発現させることができます。
他にも、蛍光イメージングのアプリケーションとして蛍光スペックル顕微鏡法があります。このF-アクチンネットワークのような高分子の集合体を蛍光標識することにより重要な細胞骨格タンパク質の動きや代謝回転のキネティクスを研究できます。
光退色後蛍光回復、FRAPと呼ばれるテクニックもあります。サンプルを部分的に退色させ、その部分に蛍光標識された分子が拡散し、回復する様子を観察することで分子の動きを解析します。
ここまでJoVE蛍光顕微鏡編をご覧いただきました。このビデオでは、蛍光の概念、蛍光顕微鏡と光学顕微鏡の違い、蛍光イメージング法、そして蛍光顕微鏡のアプリケーション例を紹介しました。ご覧いただきありがとうございました。蛍光褪色はサンプルにとって良いことではないので気をつけましょう。
蛍光は、物質が特定の波長の光を吸収し、別の波長の光を放出するときに発生する現象です。蛍光は、より高く、より不安定なエネルギー状態に励起された電子が、その基底状態に弛緩し、光子を放出するときに発生します。励起、または電子をより高いエネルギー状態に移動させる役割を担う光は、波長が長く、エネルギーが低く、色が異なる蛍光発光よりも波長が短く、エネルギーが高くなります。
蛍光顕微鏡は、光学顕微鏡の拡大特性と蛍光技術を組み合わせたもので、蛍光色素の励起と蛍光化合物からの放出の検出を可能にします。蛍光顕微鏡により、科学者は組織内の特定の細胞タイプや細胞内の分子の位置を観察することができます。
蛍光顕微鏡の主な構成要素は、従来の光学顕微鏡と大きく重なります。ただし、2つの主な違いは、光源の種類と特殊なフィルターエレメントの使用です。
蛍光顕微鏡法には、ここに示されているようなキセノンや水銀アーチランプなどの非常に強力な光源が必要です。水銀アークランプから放出される光は、ほとんどの白熱灯よりも10〜100倍明るく、紫外線から赤外線まで幅広い波長の光を提供します。この高出力光源は、蛍光顕微鏡のセットアップの中で最も危険な部分であり、フィルタリングされていない光を直接見ると網膜に深刻な損傷を与える可能性があり、電球の取り扱いを誤ると電球が爆発する可能性があるためです。
蛍光顕微鏡の原理はシンプルです。光がアークランプから出ると、励起波長を選択する励磁器フィルターを通って導かれます。
この光は、励起波長でのみ光を反射するように設計されたダイクロイックミラーと呼ばれる特殊なミラーによってサンプルに向かって反射されます。反射光は対物レンズを通過し、蛍光標本に集束します。試料からの放出物は、次に対物レンズを介して戻されますか?画像の拡大が行われる場所、そして今度はダイクロイックミラーを通して。
この光は、蛍光波長を選択し、顕微鏡コンポーネントから反射されるアークランプまたはその他の光源からの汚染光をフィルタリングするバリアフィルターによってフィルタリングされます。最後に、フィルタリングされた蛍光発光は検出器に送られ、そこで画像をデジタル化するか、光学的に見るために接眼レンズに送信されます。
エキサイターフィルター、ダイクロイックミラー、バリアフィルターは、フィルターキューブと呼ばれるコンポーネントに組み立てることができます。試料の観察中にさまざまなフィルターキューブを変更して励起波長を変更したり、一連のダイアフラムを使用して励起強度を変更したりできます。
蛍光顕微鏡法の実施に関しては、蛍光色素分子は顕微鏡自体と同じくらい重要であり、画像化される蛍光色素の種類によって、使用される励起波長と検出される発光波長が決まります。励起波長には、蛍光色素分子によって吸収され、蛍光色素分子を励起状態に遷移させることができる小さなエネルギー範囲が含まれています。励起されると、広範囲の放出、または低エネルギー状態に戻ることが可能であり、その結果、発光スペクトルが得られます。
吸収曲線または励起曲線のピークと放出曲線のピークとの差は、ストークシフトとして知られています。このシフトの距離が長いほど、2つの異なる波長を分離しやすくなります。さらに、重なり合うスペクトルは、背景を減らして画質を向上させるために、フィルターキューブのコンポーネントで除去する必要があります。
蛍光色素分子が長時間の励起にさらされると、蛍光色素が弱まったり失われたりする光退色を引き起こします。光退色を減らすために、スライドに退色防止封入剤を追加し、マニキュアで端をシールすることができます。また、スライドは、画像化されていないときは暗闇に置いておく必要があります。
蛍光イメージングを開始するには、キセノンまたは水銀光源をオンにし、15分間ウォームアップして一定の照明に到達させます。
次に、サンプルをステージに置き、所定の位置に固定します。次に、顕微鏡の白色光源をオンにします。サンプルに焦点を合わせますamp最も低いパワーの対物レンズを使用して、粗いフォーカスノブと細かいフォーカスノブを調整します。次に、ステージ調整ノブを使用して、関心のある領域を見つけます。
次に、白色光源と不要な部屋の照明をオフにして、背景を減らします。
イメージングする色素に適したフィルターキューブを選択し、シャッターを開いてサンプルを照らします。
最後に、フォーカスを微調整し、出力光をイメージングカメラに向けます。使用する蛍光色素や蛍光色素ごとに露光時間を調整する必要があるでしょう。ただし、異なるサンプルで同じ色素と特徴を比較する場合は、露光時間を一定に保つことが重要です。
同じサンプル上の複数の色素をイメージングするには、各蛍光色素に一致するようにフィルターキューブを変更し、新しい画像を記録します。
サンプル中の各色素をイメージングした後、個々の画像を重ね合わせてマージすることができます。
蛍光顕微鏡法の最も一般的な用途の1つは、蛍光顕微鏡法に結合している、または「結合」している抗体で標識されたタンパク質のイメージングです。蛍光化合物に。ここでは、興奮すると緑色に蛍光を発するアレクフルーア-488に結合した二次抗体を用いて、レプトスパイラル表面タンパク質に対する抗体を検出しました。
蛍光の特定の特徴を強調する別の方法は、緑色蛍光タンパク質(GFP)などの蛍光タンパク質のコードを生物のDNAに統合することです。GFPの遺伝子はもともとクラゲから単離され、特定のトリガーに応答して培養細胞によって発現または産生することができます、またはこの画像で光っている腫瘍細胞のように特定の細胞タイプの一部として
蛍光イメージングの別のアプリケーションは、蛍光スペックル顕微鏡法であり、これは、ここで見られるF-アクチンネットワークのような蛍光標識された高分子集合体を使用する技術です。 この重要な細胞骨格タンパク質の運動と代謝回転動態を研究すること。
光退色後の蛍光回収(FRAP)として知られる高度な技術は、蛍光標識された分子が光退色領域に戻る拡散速度を監視するために、サンプルの小さな領域を意図的に光退色することによって実行されます。
JoVEの蛍光顕微鏡法の紹介をご覧になりました。
このビデオでは、蛍光の概念、蛍光顕微鏡と光学顕微鏡の違い、スコープを通じて蛍光画像を撮影する方法について学びました。また、蛍光を使用する基本的なアプリケーションと高度なアプリケーションについても学びました。見てくれてありがとう、そして忘れないでください、光退色はあなたの歯に素晴らしく見えますが、それはあなたのサンプルにはあまり良くありません。
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