マウスの網膜神経節細胞におけるシナプスと人工コンダクタンスによるダイナミッククランプの実装

次の実験の全体的な目標は、網膜神経節細胞をモデルニューロンとして使用して、興奮性シナプス入力と抑制性シナプス入力の比率と相対的なタイミングの変化がニューロンのスパイク活動に及ぼす影響を調査することです。これは、神経節細胞の細胞体を全マウント網膜にパッチし、生理学的イオン組成物とルシファーイエローに似た細胞内溶液を充填したガラスピペットを使用して、ダイナミッククランプを使用して細胞型を形態学的に特定することにより、第2ステップとして細胞型を同定することにより達成され、興奮性および抑制性コンダクタンス波形のセットが細胞体内に注入され、 これは、応答として膜電位の変化を引き起こします。次に、制御条件での生理学的実験や薬物の存在下での様々なコンダクタンス波形を細胞体内に注入し、対応する神経応答を得る。

その結果、興奮性コンダクタンスと抑制性コンダクタンスからなる電流をダイナミッククランプ記録により注入することで、網膜神経節細胞のスパイク活性に及ぼす励起比と抑制比の変化が影響することがわかりました。電流クランプや電圧クランプなどの既存の方法に対するこの手法の主な利点は、興奮性シナプスコンダクタンスと抑制性シナプスコンダクタンスの比率と相対的なタイミングをニューロンに注入して、細胞応答への影響を調査できるインタラクティブなツールを提供することです。この方法論は、網膜回路の機能だけでなく、中枢神経系の他のニューロンネットワークの機能についての洞察を提供することができます。

この手順は、電気生理学的セットアップで250ミリリットルのカルボキシ酸素化照準培地で再灌流システムをセットアップすることから始めます。次に、真空グリースの薄層を灌流チャンバーの底に均一に塗ります。カバースリップで密封し、気密性があることを確認してください。

次に、チャンバーの上端と下端に少量のグリースを置きます。グリースはグリッドを所定の位置に保持し、網膜を強く圧迫するのを防ぎます。次に、チャンバーをプラットフォームに固定し、その後、両方の開口部を位置合わせします。

イソフッ素で麻酔をかけた後、子宮頸部脱臼によって動物を犠牲にします。小さな湾曲したハサミで目をすばやく取り除きます。小さなビーカーで車の酸素化された細胞外液でそれらをよく洗い、車の酸素化された細胞外液で満たされたペトリ皿に入れます。

解剖顕微鏡で、両眼の縁から約2mmの角膜に19ゲージの針で挿入穴を開けます。この重要なステップは、両方の手綱の酸素化を可能にするために迅速である必要があります。その後、小さな虹彩はさみで角膜を1つ取り除きます。

次に、細い鉗子で虹彩と水晶体を取り外し、もう一方の目についても手順を繰り返します。片方のアイカップをカーボックスの酸素化された細胞外溶液が入ったビーカーに移します。メスの刃で、片方のアイカップを半分に切り、鈍い解剖プローブを使用するか、またはそっと引き抜くことにより、網膜を色素上皮から穏やかに分離します。

次に、剥離した網膜組織の端を細い鉗子でオーラサータに近づけ、別の細い鉗子でオーラサータをつかみます。網膜の中心に向かって引っ張ります。これはデリケートなプロセスであり、数回の試行が必要になる場合があります。

成功した場合、オーラサータ、毛様体、硝子体、硝子体液が除去され、網膜の湾曲が減少します。次に、端をトリミングし、次に網膜を灌流チャンバーに移します 神経節細胞を上に向けています。グリッドをグリースボールの上に置いて、ティッシュを所定の位置に保持します。

残りの組織は、もう一方のアイカップでカーボックスの酸素化細胞外溶液に保存し、後で使用するために記録チャンバーを直立顕微鏡の下に取り付けます。Carbox酸素化細胞外溶液で網膜の連続灌流を直ちに調整します 摂氏35.5度で毎分3〜5ミリリットルの速度で、接地電極が所定の位置にあることを確認します。次に、顕微鏡の光源をオンにし、40 x の対物レンズを通じて神経節細胞の細胞体に焦点を合わせます。

録音用のホールマウントの中心を見つけます。このステップでは、5〜8メガオームのガラスピペットをホルダーに固定し、マイクロメートルマニピュレーターを使用して40倍の対物レンズの下で顕微鏡下で移動します。ピペットをゆっくりと下げて、内側の限界膜の表面に小さなくぼみを作ります。

ピペットを慎重に前方に進めて少量の組織を捕らえ、次にピペットを上向きまたは横に動かして小さな穴を引き裂き、神経節細胞の細胞体を露出させます。次に、清潔なピペットに8〜10マイクロリットル、ルシファーイエローのカリウムベースの細胞内溶液を入れます。それをホルダーに挿入し、 amplifierのヘッドステージ、および塩素化塩化銀電極が水没していることを確認します。

セル本体が大きいセルを選択します。陽圧でピペットチップをゆっくりと下げて、メンブレンの表面に小さなくぼみを作ります。次に、圧力を停止して解放し、ギガシールを取得します。

ギガシールが達成されたら、負圧を穏やかに加えてメンブレンを破砕し、全細胞パッチクランプ構成を実現します。この手順はデリケートなステップです。負圧がかかりすぎると、接続が漏れやすくなります。

少なすぎると、メンブレンは無傷のままになります。時間が経つにつれて、ルシファーイエローが細胞を埋め尽くし、安定している場合は細胞の形態を視覚化できます。このセットアップは 30 分以上続く必要があります。

次に、パッチマスターを使用して、10ミリボルトごとにマイナス75ミリボルトからプラス35ミリボルトまでの電流電圧テストを実行し、後のテストに進みます。1ナノアンペアより大きいナトリウム電流が存在する場合のみ。次に、ラボビューを開き、カスタムで記述されたNeuro acumaプログラムを実行します。

繰り返し数を 8 に設定します。次に、興奮性コンダクタンスと抑制性コンダクタンスの反転電位をそれぞれゼロとマイナス75ミリボルトに設定します。試験のために興奮性コンダクタンスと抑制性コンダクタンスの一致するペアを1つ選択すると、緑色の興奮性コンダクタンストレースと赤色の抑制性コンダクタンストレースが下部パネルに表示されます。

その後、パッチマスターに戻り、現在のクランプモードを選択します。すぐにアンプを電流clに切り替えますamp ニューロアクーマのモード。録音ボタンを押します。

活動電位の失語症バーストを伴う細胞応答が上部パネルに現れます。次に、低コンダクタンスでセルに電流を注入します。まず、応答がほとんどまたはまったく観察されない場合は、強い応答が生成されるまで電流を少しずつ増やします。

過剰な電流注入は細胞を殺す可能性があります。テストが完了したら。新しいコンダクタンス波形のペアを選択し、生理学的コンダクタンスと人工コンダクタンスのすべてのペアに対して手順を繰り返します。

記録後、細胞本体が無傷のままになるように、ピペットを慎重に引っ込めます。その後、直ちに組織と4%パラホルムアルデヒドを30分間固定し、続いて0.1モルリン酸緩衝液で10分間を3回洗浄し、冷蔵して翌日または準備ができたら1週間以内に抗体染色を行います。ルシファーイエロー充填神経節細胞を室温で、一次抗ルシファーイエローウサギIgGを1〜10,000の希釈で5日間染色します。

その後、6日目に、二次ヤギ抗ウサギIgGで一晩滞在し、1〜500の希釈を追加し、最後に蛍光保存培地に網膜をウェットマウントします。カバースリップを置き、マニキュアで密封します。Leica SPECT 2 共焦点顕微鏡を使用して、細胞形態の共焦点画像を撮影します。

これは、それぞれ緑と赤で示された対照実験から得られた興奮性および抑制性コンダクタンスの波形の注入に対する神経節細胞の応答です。そして、テトロダトキシンの入浴後に記録されたコンダクタンス波形の注入に対する応答を示します。これは、コンダクタンス波形アームのさまざまなペアに対する別の神経節細胞の応答です。

興奮性コンダクタンスと抑制性コンダクタンスの比を1から0から1から2に変更した。阻害の程度が増加すると、細胞の応答は減少し、ここには、阻害の開始が変化したのと同じレベルの興奮に対する神経節細胞の応答を示します。デルタTは、抑制性コンダクタンスと興奮性コンダクタンスの発症との間の時間差を表します。

阻害の遅延が減少するにつれて、細胞の応答は弱くなりました。この手順は、ニューロン出力を生成するexci threeと抑制性シナプ入力との間の相互作用を明らかにするのに役立つ強力な技術です。