Name: マウスの網膜神経節細胞におけるシナプスと人工コンダクタンスによるダイナミッククランプの実装 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: 学ぶマウス網膜神経節細胞におけるダイナミッククランプを用いたシナプス入力の比とタイミングが神経発火に与える影響。この手法は興奮性と抑制性シナプス伝導度をリアルタイムに制御し、網膜回路の機能解明に有用である。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、オーストラリア研究会議（ARC DP0988227）とバイオメディカルサイエンスの調教からバイオメディカルサイエンス研究イニシアティブ助成、シドニー大学でサポートされています。機器のパッチクランプアンプEPC 8はバイオメディカルサイエンスの調教からスタートアップ基金、シドニー大学によって資金を供給された。機器InstruTECH LIH 8 +8データ収集システムは、レベッカL.クーパー財団とバイオメディカルサイエンスの調教からスタートアップ基金、シドニー大学からの資金で購入した。我々は彼らの洞察に満ちた提案やコメントのために匿名の査読に感謝したいと思います。

1。全般設定と組織の準備<ol><li> 30分（そのストレスレベルを減少させることを目指して）のために暗闇の中でマウスをおいてください。待っている間、外液の1 Lを用意。第ミリQ水の半分リットルの重炭酸ナトリウム1.9gを溶解する。そのpHを95％O 2および5％CO 2でバブリングすることにより7.4に維持される。 5分後、ミリQ水で1 Lまでの上部、重炭酸ナトリウム溶液に加える、ミリQ水100mlにエイムス媒体の8.8グラムを溶解し、よく混合する。実験の残りのcarboxygenatedこのソリューションを保つ。 </li><li> carboxygenatedエイムス培地250mlのを取るとセットアップ電気生理学的に流体灌流システムを設定。ソリューションはcarboxygenated保つ。 </li><li>灌流チャンバーの底部上に均一に塗沫真空グリースを薄く。カバースリップでそれを封印し、それが気密であることを確認します。グリースの少量（直径約2 mm）を取り、上にそれを置き、ボトムは、チャンバの端。これらのボールの場所にグリッド（デンタルフロスで張らプラチナフレーム）を保持し、それが網膜上にあまりにもハード押す防ぐことができます。プラットフォームにチャンバーを修正し、両方の開口部の位置を合わせます。 </li><li>動物は2分間イソフルランとの最初の麻酔され、その後頸椎脱臼により屠殺。迅速に、小さなハサミ（湾曲した刃）で目を取り除く小さなビーカーにcarboxygenated細胞外液で十分に洗った後、carboxygenated細胞外液で満たされたペトリ皿に置きます。 </li><li>解剖顕微鏡下では、19ゲージの針を使用して角膜に挿入孔を（端から〜2mm）を作る。他の目について、この手順を繰り返します。これは重要なステップは、両方の網膜の酸素化を可能にする迅速でなければならない。その縁に平行に切断することにより、虹彩はさみの小さなペアで1角膜を削除します。次に、細かい鉗子一対の虹彩、レンズを取り外します。他の目について、この手順を繰り返します。入ったビーカーに1アイカップを転送細胞外溶液をcarboxygenated。 </li><li>メス刃で、ホールマウントを平らにするために、網膜ごとに2つの全マウントを入手することができるように、半分に1アイカップを切った。鈍解剖プローブを用いた色素上皮からやそっとそれを引っ張って網膜を慎重に分離します。一度デタッチ、網膜はかなり透明になります。凸面は、光受容体の側であることに注意してください。凹面は、神経節細胞側である、それは粘着性硝子体液の存在に起因して、それ自体に付着することがあります。 </li><li>細かい鉗子のペアで、鋸状縁に近い一戸建て網膜組織のエッジを保持し、細かい鉗子の別のペアで鋸状縁をつかむ、網膜の中心に向かってそれを引く。これは微妙なプロセスであり、いくつかの試みがかかる場合があります。成功した場合、鋸状縁、毛様体及び硝子体液は、このプロセスによって除去され、網膜の曲率（ すなわち平坦に）低減される。 </li><li>エッジをトリミングしてから、当たりに転送上向きに神経節細胞との融合チャンバ。グリースのボールの上にグリッドを配置することによって所定の位置に組織を持ちます。後で使用するために他のアイカップで、残りの組織を置きます。網膜の解剖のために同様の方法がミドルトンとプロッティ16とPottek らで説明されています17。 </li><li>正立顕微鏡で記録室をマウントします。 5ml /分 - すぐに3の割合でcarboxygenated細胞外溶液（35.5°C）で網膜の連続灌流を設定します。接地電極が配置されていることを確認します。 </li><li>顕微鏡に装着すると、組織の可視化を可能にするデジタルカメラです。全体のセットアップはエアテーブル（衝撃吸収性）の上およびファラデーケージ（ブロック外部静的および非静的電界）の内部に位置しています。 </li><li>光源（赤外線、&gt; 850 nm）のオンと40X目的に回して、神経節細胞の細胞体に焦点をもたらす。 recorのための全体のマウントの中央エリアを検索鼎。 </li><li>デフロストKの凍結バイアル+ベースの細胞内溶液（300μL、でpH = 7.4）を含有する（単位：mm）K-グルコン酸：140、HEPES酸：10、のMgCl 2：4.6、ATP-のNa +：4、GTP-のNa + ：0.4とEGTA：10。すべての試薬は、Sigma-Aldrich社から購入した。 </li></ol> 2。網膜神経節細胞のパッチ適用細胞体<ol><li>最初に火がホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブの端を磨いて、それから2つの加熱ステップ（： - MΩ8 5抵抗）とガラス微小電極プラーとそれらを引く。 </li><li>細胞内液にルシファーイエローの3液（最終濃度0.2％）を加え、よく混ぜて、それを遠心分離。次に、1ミリリットルのシリンジに液の上部85％を譲渡、30 G再利用可能な皮下注射針に、その後、0.22μmのFの ILTERユニットに接続します。冷蔵。 </li><li>そのホルダーに、録音に使用されているものと同様のチップサイズで、ガラスピペットを修正し、micromanipulaを使用して顕微鏡下に移動器。それは内境界膜の表面に小さなくぼみを作るまで、40X目的の下で、ゆっくりとピペットを下げる。それは少量の組織を捕捉するまで慎重にピペットを前方に前進した後、神経節細胞の細胞体を露出させるための小さな穴を引き裂くために上方および/または横に移動する。穴より小さい、網膜ネットワークの整合度が高いが維持される。所望であれば、スルホローダミン101（SR101、0.5から1μM）を蛍光顕微鏡15を用いて損傷した神経細胞を標識するための細胞外培地に添加することができる。 </li><li>細胞内の溶液10μl - 8とクリーンピペットを埋める。アンプのヘッドステージに取り付けるホルダーにそれを挿入し、塩素化塩化銀電極が水没していることを確認します。汚れ、及び/又は気泡が/存在しているされている場合は破棄します。 </li><li>すべての装置の電源をオンにします。我々は、電圧クランプ消費で細胞全体の記録を達成するためにPatchMasterによって制御EPC 8パッチクランプ増幅器を使用し形状。高速モードで電流クランプ記録を可能にする他のアンプを使用することもできることに留意されたい。ピペット溶液中の正圧を適用し、維持する。それはむしろ避難アマクリン細胞やグリア細胞よりも神経節細胞であるので、最も可能性の高い大規模な細胞体とのセルを選択します。ゆっくりと、膜の表面上に小さなディンプルを行っているので、ピペットチップを下げ停止し、圧力を解放する。 60 mVの - 即時に保持電位を下げる。ギガシール（GΩ）がそれらの間に達成されると、穏やかに全細胞パッチクランプ構成を実現するために、膜を破るために吸う。あまりにも負圧が印加された場合は、この手順では、繊細なステップであり、接続は漏れなり、少なすぎると、膜はそのまま残ります。 </li><li>時間が経つにつれて、ルシファーイエロー、セルの形態の可視化を可能にし、セルを記入します。安定した場合には、このセットアップは30分以上持続する必要があります。 </li></ol> 3。 Dynamiを使用した神経節細胞の録音Cクランプ<ol><li>まず、電流 - 電圧試験（904 - 75 + 35 mVのすべての10 mVのには）PatchMasterを使用して実行されます。大型のNa +電流（&gt; 1 NA）が存在する場合のみ、後でテストに進みます。避難アマクリン細胞にパッチが適用されてまれで、その場合には、それに続く現在の注射に活動電位の列車で応答しないことに注意してください。 </li><li>オープンLabVIEWとカスタム書かNeuroakumaプログラムを実行し、その後さまざまなコンダクタンス波形をロードします。 8（ - 8統計的目的のための6）に繰り返し数を設定します。それぞれ75 mVの - 0とで興奮性と抑制性のコンダクタンスの逆転電位を設定します。テストのための興奮性と抑制コンダクタンスの一つ一致するペアを選択します。興奮性コンダクタンストレース（緑色）と抑制コンダクタンストレースは（赤）下のパネルに表示されます。 </li><li> PatchMasterに戻り、電流クランプモードを選択し、すぐに &#39;CC +通信FAST&#39;電流クランプモードにアンプを切り替える。このモードでは、ACCにできますurately膜電位の急激な変化に追従。膜とピペットとの間に良好なシールが維持されている場合は、少し/補償なしが必要とされ、そうでない場合、記録は長くは続かないだろう。 Neuroakumaでは、 &quot;記録&quot;ボタンを押してください。細胞応答（通常、活動電位の相性バースト、 図1A）は、上部パネルに表示されます。なし/少し応答が観察されている場合は、それが強力な応答を生成するまで最初のコンダクタンスの低いスケーリングとセルに電流を注入、少しずつ増加。過大電流注入は、セルを殺すことができる。いったんテストが完了し、コンダクタンス波形の新しいペアを選択し、生理学的および人工的なコンダクタンスのすべてのペアについては、上記を繰り返します。リアルタイムで注入された生理的な電流は、（I）に基づいています。 I（t）が大口 = G（t）は×（V M（t）は、 - V EXC）+ G INH（トン）×（V M（t）は、 - V INH） </li></ol>コンダクタンスは（NSのG）SYかもしれませんnapticまたは人工。興奮性と抑制性シナプスコンダクタンス波形は（TTX、1μM）制御条件の異なる視覚刺激に応答し、テトロドトキシンの存在下でプロッティ、ディマルコ、黄、Vonhoff、グエンとソロモン（未発表結果）によって実行される以前の実験から収集した。人工コンダクタンス波形はアルファ関数を用いてモデル化した。 V mが （mV単位）記録された膜電位である。 G EXCとG INHは、V EXCとV INHは 、それぞれ興奮性と抑制コンダクタンスの逆転電位を表しながらそれぞれ興奮性と抑制性のコンダクタンスを表しています。時間はミリ秒でtです。サンプリングレートは40 kHzです。 I S = I 0（T /α）のe-αT 上記の式は、アルファ機能（;電流のピークから1 /α=時間（秒-1）I 0 =最大電流）です。シナプスの立ち上がり時間と減衰時間電流は、α4によって決定されます。抑制コンダクタンスの待ち時間は、励起の発症（ 図2D）に対してその遅延を減らし、変更されたながら興奮コンダクタンスが変化しなかった。 <ol start="4"><li>細胞体はそのまま留まるように記録した後、慎重にピペットを撤回。直ちにリン酸緩衝液0.1Mの持つ3つの10分間の洗浄に続いて30分間の4％パラホルムアルデヒドで組織を固定する。冷蔵と抗体は翌日染色または週間以内に行います。 </li></ol> 4。ルシファーイエローいっぱい網膜神経節細胞に対する抗体染色<ol><li>二次ヤギ抗ウサギIgG（希釈= 1:500と6日目に、一晩染色、室温でルシファーイエローいっぱい神経節細胞（5日間の主要抗ルシファーイエローウサギIgG（希釈= 1:10,000）に対する抗体染色））。蛍光保存メディアで網膜をマウントぬらし。釘pはスリップとシールをカバーolish。 </li><li>ライカSPEC-II共焦点顕微鏡（ 図1B）を使用して、細胞の形態の共焦点写真を撮る。軸索の存在は、神経節細胞の確認を可能にします。 </li></ol>

<ol><li>Robinson, H. P. C., Kawai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+digitally+synthesized+synaptic+conductance+transients+to+measure+the+integrative+properties+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 49, 157-165 (1993).</li>
<li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+clamp%3A+artificial+conductances+in+biological+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons.</a> Trends in Neuroscience. 16, 389-394 (1993).</li>
<li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clamp%3A+computer-generated+conductances+in+real+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).</li>
<li>Johnson, D., Wu, S. M. -S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohnson%2C+D+%22Foundations+of+cellular+neurophysiology%22">Foundations of cellular neurophysiology</a>. , The MIT Press. London. (1995).</li>
<li>Taylor, W. R., Vaney, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+synaptic+mechanisms+generate+direction+selectivity+in+the+rabbit+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Diverse synaptic mechanisms generate direction selectivity in the rabbit retina.</a> Journal of Neuroscience. 22 (17), 7712-7720 (2002).</li>
<li>Jurkat-Rott, K., Lehmann-Horn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+patch+clamp+technique+in+ion+channel+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The patch clamp technique in ion channel research.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 4, 221-238 (2003).</li>
<li>Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+clamp+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The dynamic clamp comes of age.</a> Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).</li>
<li>Williams, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+compartmentalization+and+functional+impact+of+conductance+in+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial compartmentalization and functional impact of conductance in pyramidal neurons.</a> Nature Neuroscience. 7 (9), 961-967 (2004).</li>
<li>Perkins, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-attached+voltage-clamp+and+current-clamp+recording+and+stimulation+techniques+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).</li>
<li>Feng, S. S., Jaeger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+SK+calcium-dependent+potassium+currents+in+regulating+the+activity+of+deep+cerebellar+nucleus+neurons%3A+a+dynamic+clamp+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">The role of SK calcium-dependent potassium currents in regulating the activity of deep cerebellar nucleus neurons: a dynamic clamp study.</a> Cerebellum. 7 (4), 542-546 (2008).</li>
<li>Butera, R., Lin, R. Key factors for improving dynamic clamp performance. In: Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aButera%2C+R+%22Dynamic-Clamp+From+Principles+to+Applications+Series%3A+Springer+Series+in+Computational+Neuroscience%22">Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series: Springer Series in Computational Neuroscience</a>. Destexhe, A., Bal, T. 1, Springer. (2009).</li>
<li>Marco, S. D. i, Nguyen, V. A., Bisti, S., Protti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+functional+reorganization+of+retinal+circuits+induced+by+early+long-term+visual+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Permanent functional reorganization of retinal circuits induced by early long-term visual deprivation.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (43), 13691-13701 (2009).</li>
<li>Zhao, Y., Inayat, S., Dikin, D. A., Singer, J. H., Ruoff, R. S., Troy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+technique%3A+review+of+the+current+state+of+the+art+and+potential+contributions+from+nanoengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Institution+of+Mechanical+Engineers%2C+Part+N%3A+Journal+of+Nanoengineering+and+Nanosystems%22%5BJournal%5D)">Patch clamp technique: review of the current state of the art and potential contributions from nanoengineering.</a> Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part N: Journal of Nanoengineering and Nanosystems. 222 (1), 1-11 (2009).</li>
<li>Lobb, C. J., Paladini, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+NMDA+receptor+conductance+in+rat+midbrain+dopaminergic+neurons+using+the+dynamic+clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Application of a NMDA receptor conductance in rat midbrain dopaminergic neurons using the dynamic clamp technique.</a> J. Vis. Exp. (46), e2275(2010).</li>
<li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).</li>
<li>Middleton, T. P., Protti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoids+modulate+spontaneous+synaptic+activity+in+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cannabinoids modulate spontaneous synaptic activity in retinal ganglion cells.</a> Visual Neuroscience. 28 (5), 393-402 (2011).</li>
<li>Pottek, M., Knop, G. C., Weiler, R., Dedek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+GFP-expressing+cell+populations+in+the+intact+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of GFP-expressing cell populations in the intact retina.</a> J. Vis. Exp. (57), e3457(2011).</li>
</ol>

すべての手順は、最初にシドニー大学の動物実験倫理委員会によって承認された後、科学的な目的のために、動物のケアと使用のための実践のオーストラリアのコードのガイドライン（国民健康オーストラリアの医学研究評議会に合わせて行われた）。

ここでは、比の影響と網膜神経節細胞の出力に興奮と抑制の相対的なタイミングを評価するためのダイナミック·クランプを使用することを示しています。ダイナミッククランプは生きているニューロンに生理的に記録されたまたは人工シナプスコンダクタンスを導入するためのコンピュータシミュレーションを利用しています。この方法論はコンダクタンスが変更され、ニューロンの応答への影響を計算するための神経細胞に注入することのできるインタラクティブなツールを提供しています。コンダクタンス波形を視覚刺激は、制御条件および特定の細胞や回路の寄与を分離する薬剤の存在下で感光体を活性化するために使用される実験から求めることができる。これらのコンダクタンス波形の異なる組み合わせの注射は、出力をスパイクへの貢献を明らかにする。動的クランプ記録の使用はまた、異なる光適応conditio下で行うことができる背景雑音のレベルの操作を可能に<html> NS。また、コンダクタンス波形はまた、α関数などのシナプス入力のモデルから、また、電圧依存性（ すなわち、NMDA受容体）を有するだけでなく、電位依存性イオンチャンネル又は電気的に結合さ細胞に対するシナプス入力のために生...

網膜は、眼の後部に並ぶ近透明な神経組織である。多くの研究では、視覚処理とシナプス伝達のメカニズムの最初のステップを検討するモデルとして網膜を使用しています。ホールマウントの準備における網膜ネットワークは解剖後に無傷のままであるので、その生理反応がインビボ条件下に非常に類似しているとして、シナプスの相互作用を研究するための理想的なシステムを表しています。したがって、そのニューロンの特性はパッチクランプ技術（技術の上でレビューのために、6,9,13を参照）を使用して研究することができる孤立網膜を用いた。薬剤は、様々な部位に作用するような特定の回路や神経節細胞応答に神経伝達物質の正確な寄与の同定は、しかしながら、通常は妨げられる。 光に網膜神経細胞の生理学的反応、自然な刺激が、細胞内液で満たされたガラスピペットで記録することができます。パッチCLを使用してアンプ技術、光刺激に対するニューロンの応答は、膜電位変動（電流クランプ）または電流（電圧クランプ）として記録することができます。異なる電圧で膜電位を保持し、 事後コンダクタンス分析を実施することにより、抑制性および興奮性シナプス入力5,12を単離することができる。実験のこのタイプは、通常の入浴中に、異なる神経伝達物質および神経応答に対する受容体の寄与を分離するために、異なる薬剤の存在下で行うことができる。多くの研究室からの研究の富は、このような大きさ、コントラスト、空間的および時間周波数、方向、向きや他の刺激変数として刺激特性に出力し、興奮性と抑制性の入力をスパイクの依存性を特徴としている。これらの実験的なアプローチは刺激特性の関数としてスパイク出力とシナプス入力との間の関係に関する情報を提供していますが、細胞の興奮に、特定の細胞の種類とそのシナプス入力の寄与の解釈は簡単ではありません。これは、典型的に興奮性および抑制両方の入力が刺激特性によって異なり、したがって、それはこれらの入力のいずれかの変化は神経スパイクに与える正確な影響を評価することができないという事実によるものである。 これらの制限を回避する別のアプローチは、出力スパイクへの個々のシナプス入力の貢献の重要な評価を可能にするダイナミッククランプ記録を実施することである。ダイナミッククランプ法は、セルへの電流の直接注入を可能にし、所定の時間に注入される電流の量はその時1,2,3（レビューのために、7,14を参照）に記録された膜電位に依存します。これは、修正された電流クランプセットアップです記録の下のセルと専用のハードウェアを備えた機器、ソフトウェア間のリアルタイム、高速フィードバックインタラクションコンピュータが達成される。細胞に注入される電流の量はそれに応じて計算される。したがって、この方法の利点は、セルがコンダクタンス波形の異なる組み合わせで刺激することができ、その応答はシナプス入力を媒介受容体の活性を模倣することである。例えば、小さなスポット用興奮コンダクタンスの注入への応答で小さなスポット用の興奮性と抑制コンダクタンスの注入への応答の比較のみ細胞応答に対する阻害の影響に関する情報を提供します。同様に、生理的に記録されたコンダクタンスの他の組み合わせは、スパイクが出力にどのように影響するかを刺激依存性興奮性および/または抑制性コンダクタンスの変化を明らかにするために同時注入することができます。 我々の研究では、動的クランプ技術は、相対振幅および網膜神経節細胞の発火特性にシナプス入力のタイミングの影響を実証するために使用される。さまざまなコンダクタンス制御条件、または薬理学的薬剤の存在下における生理学的実験から得られた入力として用いた。また、アルファ関数に基づく人工コンダクタンスはまた、シナプス入力がニューロンによって一体化されている方法を調査するために使用された。したがって、このコンダクタンスは様々な種類の薬理学的又は計算的に同一の神経節細胞に注入される、いずれかの生理学的に生成され、これらの入力に対する応答のように比較を行うことができることができる汎用性の高い技術である。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent</td></tr><tr><td>イソフルラン吸入麻酔</td>薬 <td>Pharmachem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ames Medium with L-Glutamate (Powder)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium Gluconate, Anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム溶液 (4.9 mol/l)</td><td>Sigma-Aldrich</td> アデノ<td></td><td></td></tr><tr><td>シン 5'-三リン酸 (ATP) 二ナトリウム塩水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グアノシン 5'-三リン酸ナトリウム塩水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エチレングリコール-ビス(2-アミン&#8211;thylether)-N,N,N',N',n'-四酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド粉末, 95%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Preserving Media</td><td>BioFX株式会社ラボラトリーズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>キャピラリーガラスチューブ、炎研磨端部付き(OD = 1.50 mm、ID = 0.86 mm、長さ= 15 cm)</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>64-0794</td><td></td></tr><tr><td>シングルステージガラスマイク&#8211;レクトロードプーラー</td><td>ナリシン 日本</td><td>型 PP-830</td><td></td></tr><tr><td>ミニパルス2</td><td>ギルソン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ミレク-GV 0.22 &mu;m Filter Unit</td><td>Millipore Corporation</td><td>SLGV004SL</td><td></td></tr><tr><td>ルアーロック 再利用可能な皮下注射針:30G</td><td>スミス 甥 (オーストラリア)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シングルインラインソリューションヒーター</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>モデル SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>デュアルオートマチック温度コントローラー</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>オリンパス 実体顕微鏡 SZ61</td><td>オリンパス株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>オリンパス顕微鏡BX50WI:40倍対物レンズ付き</td>オ<td>リンパス株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0-30 V 2.5 ADC電源</td><td>ディックスミスエレクトロニクス</td><td>Q1770</td><td></td></tr><tr><td>デジタル顕微鏡カメラProgResMFクール</td><td>イエナオプティック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーターMP-225</td>サ<td>ッター機器会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パッチクランプアンプEPC 8</td><td>HEKA Elektronik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>InstruTECH LIH 8+8データ収集システム</td><td>HEKA Elektronik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コンピュータ: DELL</td><td>Dell Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウスの網膜神経節細胞におけるシナプスと人工コンダクタンスによるダイナミッククランプの実装

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

神経節細胞は、網膜の出力ニューロンであり、その活性は、特定の神経回路から生じる複数のシナプス入力の統合を反映している。パッチクランプ技術は、電圧クランプ、電流クランプ構成では、一般に神経細胞の生理学的特性を研究し、そのシナプス入力を特徴付けるために使用される。これらの技術の適用は非常に有益であるが、それらは様々な制限をもたらす。例えば、興奮性および抑制性入力の正確な相互作用が応答出力を決定する方法を定量化することは困難である。この問題に対処するために、我々はコンダクタンスクランプ1、2、3とも呼ばれる修正された電流クランプ法、動的クランプを使用し、神経細胞の興奮性に興奮性および抑制性シナプス入力の影響を検討した。この技術は、セルに電流注入を必要とし、その時の膜電位のリアルタイムフィードバックに依存する。 injectedは電流が所定の興奮性および抑制性シナプスコンダクタンス、その反転電位とセルの瞬間的な膜電位から計算される。実験手順の詳細については、ダイナミッククランプ法の全細胞の構成と雇用を達成するために、細胞をパッチクランプは、このビデオの記事に示されている。ここでは、制御条件または薬物の存在下における生理学的実験から得られた様々なコンダクタンスの波形にマウス網膜神経節細胞の応答を示している。さらに、細胞の応答を調べるために、αの関数を用いて生成された人工興奮性および抑制性のコンダクタンスの使用を示す。

神経節細胞応答を阻害する異なる入力源の寄与は、様々なコンダクタンス波形を適用することにより実証される。これらの波形は通常の状態にし、ブロックアクションのみ抑制性網膜ニューロンのサブセットで電位発生。 図2Aはの注入に代表的な反応を示していることTTX、電圧依存性Na +チャネル遮断薬の存在下で異なる輝度の刺激が得られた興奮性と抑制性のコンダクタンス波形は通常の状態で灰色の背景に小さな黒点による刺激に反応して記録した。 TTXの存在下で異なるサイズの黒点で得られたコンダクタンス波形は弱い応答が（ 図2B）が観察された、同一の細胞に注入したとき。 図2Cは、様々な対の注入に別の神経節細胞の応答を示しているコントロール興奮性と抑制性のコンダクタンスの比を（：G INH比 ：午前1時00分〜1:2 G EXC）を操作されたコンダクタンス波形。これは、阻害レベルに減少細胞の応答が増加したことが明らかである。したがって、興奮と...

このビデオの記事では、セットアップの細胞体とどのように全体のマウントマウス網膜における神経節細胞からのダイナミッククランプ記録を実装するにパッチを適用する手順を示しています。この手法は、興奮性と抑制性シナプス入力の正確な貢献の調査、および神経スパイクに対する相対的な大きさとタイミングを可能にします。

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

本実験の全般的な目的は、網膜神経節細胞をモデルニューロンとして用い、興奮性および抑制性シナプス入力の比率や相対的なタイミングの変化がニューロンの発火活動に及ぼす影響を調査することです。まず、生理的なイオン組成に近い細胞内液とルシファーイエローを満たしたガラスピペットを用いて、網膜全層標本中の神経節細胞の細胞体にパッチクランプを行います。ルシファーイエローは、第2ステップで細胞型を形態学的に特定するために使用します。次に、ダイナミッククランプを用いて、一連の興奮性および抑制性のコンダクタンス波形を細胞体に注入し、それに対する応答として膜電位の変化を誘導します。その後、対照条件下または薬剤投与下の生理学的実験から得られたさまざまなコンダクタンス波形を細胞体に注入し、それに対応するニューロン応答を取得します。本結果は、ダイナミッククランプ記録を用いて興奮性および抑制性コンダクタンスで構成される電流を注入し、興奮と抑制の比率の変化が網膜神経節細胞の発火活動に及ぼす影響を示しています。カレントクランプやボルテージクランプなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、興奮性と抑制性のシナプスコンダクタンスの比率や相対的なタイミングをニューロンに注入し、細胞応答への影響を調査できるインタラクティブなツールを提供できる点にあります。この手法は、網膜回路だけでなく、中枢神経系におけるあらゆるニューロンネットワークの機能に関する知見を提供することが可能です。まず、電気生理学的セットアップにおいて、250 millilitersのカルボキシ酸素化Aims溶液を用いて再灌流システムを準備します。次に、灌流チャンバーの底面に真空グリースを薄く均一に塗布します。カバーガラスで密閉し、気密性が確保されていることを確認してください。次に、チャンバーの上下端に少量のグリースを塗布します。グリースはグリッドを固定し、網膜に過度な圧力がかからないようにします。その後、チャンバーをプラットフォームに固定し、両方の開口部を合わせます。イソフルランで麻酔をかけた後、頸椎脱臼により動物を安楽死させます。小型の曲剪を用いて眼球を迅速に摘出します。小型ビーカー内で酸素供給済みの細胞外液を用いて十分に洗浄し、酸素供給済みの細胞外液を満たしたペトリ皿に入れます。実体顕微鏡下で、両眼の角膜縁から約2 mmの位置に、19ゲージの針を用いて挿入孔を作成します。両眼への酸素供給を維持するため、この重要な工程は迅速に行う必要があります。その後、小さなアイリス剪刀を用いて、角膜縁と平行に切除し、片方の角膜を取り除きます。次に、精密ピンセットを用いて虹彩と水晶体を取り除き、もう一方の眼でも同様の手順を繰り返します。眼杯の片方を、カルボキシ酸素化細胞外液が入ったビーカーに移します。メスで眼杯を半分に切り、鈍端の解剖プローブを用いるか、あるいはそっと引き剥がすことで、網膜を色素上皮から慎重に分離させます。次に、剥離した網膜組織の端を微細ピンセットでora serrataの近くに保持し、別の微細ピンセットでora serrataを掴みます。それを網膜の中心に向かって引っ張ります。これは非常に繊細な作業であり、数回の試行が必要な場合があります。成功すれば、毛様体と硝子体が除去され、網膜の湾曲が軽減されます。次に、端をトリミングし、神経節細胞を上に向けて網膜を灌流チャンバーに移します。グリッドをグリースボールの上に配置して、組織を固定します。残りの組織を別のアイカップに入れ、後で使用するためにCarbox酸素化細胞外液で保存し、記録チャンバーを正立顕微鏡下に設置します。直ちに、Carbox酸素化細胞外液を用いて、35.5 °Cで3〜5 mL/minの速度で網膜を連続灌流するように調整し、接地電極が適切に配置されていることを確認してください。次に、顕微鏡の光源を点灯させ、40倍の対物レンズを用いて神経節細胞の細胞体に焦点を合わせます。記録を行うために、ホールマウントの中心を特定します。このステップでは、5〜8 MΩのガラスピペットをホルダーに固定し、40倍の対物レンズ下でマイクロマニピュレーターを使用して顕微鏡の下へ移動させます。内境界膜の表面に小さな窪みができるまで、ピペットをゆっくりと下げます。ピペットを慎重に前方に進め、少量の組織を捉えたところで、上方または側方に動かして小さな穴を開け、神経節細胞の細胞体を露出させます。次に、Lucifer yellowを含むカリウムベースの細胞内液 8～10 µL を、きれいなピペットに充填します。これをアンプリファイアのヘッドステージに取り付けられたホルダーに挿入し、塩化銀電極が浸っていることを確認してください。細胞体が大きい細胞を選択します。正圧をかけながらピペットチップをゆっくりと降ろし、細胞膜の表面に小さな窪みを作ります。その後、圧力を止めて解放し、ギガシールを形成させます。ギガシールが形成されたら、緩やかに陰圧をかけて膜を破裂させ、ホールセルパッチクランプ構成にします。この操作は非常に繊細な工程です。陰圧をかけすぎると、接続部にリークが生じます。量が少なすぎると、膜が維持されたままになります。時間の経過とともに、Lucifer yellowが細胞内に充填され、安定していれば細胞の形態を可視化することができます。このセットアップは30分以上維持されるはずです。次に、Patch Masterを用いて-75 mVから+35 mVまで10 mV刻みで電流-電圧測定を行い、その後の試験へと進みます。これは、1 nAを超えるナトリウム電流が認められた場合のみ実施してください。その後、LabVIEWを開き、独自に作成されたneuro acumaプログラムを実行します。繰り返し回数を8に設定します。次に、興奮性および抑制性コンダクタンスの反転電位を、それぞれ0および-75 millivoltsに設定します。テスト用に興奮性と抑制性のコンダクタンスのペアを1組選択すると、下パネルに緑色の興奮性コンダクタンストレースと赤色の抑制性コンダクタンストレースが表示されます。その後、Patch Masterに戻り、カレントクランプモードを選択します。直ちにNeuro Acumaのアンプをカレントクランプモードに切り替えます。録画ボタンを押してください。上パネルに、活動電位の非周期的なバーストを伴う細胞応答が表示されます。次に、低コンダクタンスの細胞に電流を注入します。まず、応答がほとんど、あるいは全く観察されない場合は、強い応答が得られるまで電流を少量ずつ増加させてください。過剰な電流注入は細胞を死滅させる可能性があります。テストが完了したら、新しいコンダクタンス波形のペアを選択し、生理学的および人工的なすべてのコンダクタンスのペアに対して同様の手順を繰り返します。記録後、細胞体が損なわれないように注意してピペットを後退させます。その後、直ちに組織を4%para formaldehydeで30分間固定し、続いて0.1 molar phosphate bufferで10分間の洗浄を3回行います。その後、冷蔵保存し、翌日または準備が整った1週間以内に抗体染色を行います。Lucifer yellowで充填された神経節細胞に対し、1:10,000に希釈した一次抗体（anti Lucifer yellow rabbit IgG）を用いて、室温で5日間染色します。その後6日目に、二次抗体であるgoat anti rabbit IgGを overnight で反応させ、1/500に希釈して添加します。最後に、蛍光保存液を用いて網膜をウェットマウントします。カバーガラスを載せ、マニキュアで封印します。Leica SPECT two 共焦点顕微鏡を用いて、細胞形態の共焦点画像を取得します。ここでは、興奮性および抑制性コンダクタンスの注入に対する神経節細胞の反応を示します。コントロール実験から得られた波形を、それぞれ緑色と赤色で示しています。また、テトロドトキシンをバスに投与した後に記録したコンダクタンス波形の注入に対する反応をここに示します。さらに、別の神経節細胞における、さまざまなペアのコンダクタンス波形に対する反応をここに示します。興奮性コンダクタンスと抑制性コンダクタンスの比率を、1:0から1:2まで変化させました。抑制の程度が高まるにつれて細胞の応答は減少しました。ここでは、抑制の開始タイミングを変化させた際の、同一レベルの興奮に対する神経節細胞の応答を示します。Delta Tは、抑制性コンダクタンスと興奮性コンダクタンスの開始時刻の時間差を表します。抑制の遅延が減少するにつれて、細胞の応答は弱くなりました。この手順は、ニューロンの出力を生成する興奮性および抑制性シナプス入力間の相互作用を明らかにするのに役立つ強力な手法です。

implementing-dynamic-clamp-with-synaptic-artificial-conductances

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオでは、我々はラット脳スライスにおける全細胞の構成で記録されたドーパミン作動性ニューロンへのコンダクタンスを適用する方法を示します。この手法は、ダイナミッククランプと呼ばれています。...

ダイナミッククランプ法を用いたラット中脳ドーパミン作動性ニューロンにおけるNMDA受容体のコンダクタンスのアプリケーション

この記事では、細かく分析し、マウスで分離された網膜の準備から記録する方法の説明を提供します。特に、我々は、蛍光標識神経節細胞集団からの光の応答を記録し、続いてその形態を特定し分析する方法について説明します。...

遺伝的に標識された網膜神経節細胞からの光は応答を記録するために隔離された網膜の準備

このビデオは、フラットマウントマウス網膜からの電気生理学的記録のための全細胞パッチクランプ技術を示しています。電極付きの薄いガラスピペットを使用して、網膜内のスターバーストアマクリン細胞(SAC)にアプローチします。シールを形成した後、吸引を加えてメンブレンを破裂させ、全細胞パッチクランプ構成を形成します。最後に、SACシナプス受容体を通るイオンの流れは、この構成を使用して測定されます。...

フラットマウントマウス網膜からの電気生理学的記録のための全細胞パッチクランプの確立

このビデオは、暗順応したマウス網膜組織スライス調製物における光誘発後シナプス応答の記録を示しています。網膜切片を記録室に入れ、記録ピペットを使用して網膜神経節細胞との電気的導通を確立する。光パルスを印加して神経節細胞に興奮性のシナプス後電位を生成し、ピペットで記録します。...

マウス網膜切片のニューロンにおける光誘発シナプス後応答

このビデオは、内側前頭前野(mPFC)軸索を光遺伝学的に刺激し、LECの錐体ニューロンの応答を記録することにより、外側嗅内皮質(LEC)のシナプス効率を研究する手順を示しています。この方法は、パッチクランプ記録と光刺激によるシナプス活性化を組み合わせて、シナプスの可塑性を研究するものです。...

ラット脳切片におけるシナプスイベントの光遺伝学的刺激と電気生理学的記録

免疫組織化学プロトコルは、網膜中の特定のタンパク質の局在化を研究するために使用される。カルシウムイメージング技術は、網膜神経節細胞および軸索のカルシウム動態を研究するために使用される。...

ホールマウントラット網膜における免疫組織化学的およびカルシウムイメージング法

閉ループプロトコルは、現代の電気生理学においてますます普及しつつあります。私たちは、デスクトップコンピュータとデジタル取得ボードを使用して、in...

リアルタイム電気生理学：プローブ神経ダイナミクスとその先にクローズド·ループ·プロトコルの使用

このプロトコルは、フラットマウント調製物から網膜ニューロンの全細胞パッチクランプ記録を実行する方法を示しています。...

Deafferentatedマウス網膜のフラットマウントの準備中のスターバーストアマクリン細胞のパッチクランプ記録

ここでは、横性属核を含む急性脳スライスの調製のためのプロトコルと、網膜原生殖器およびコルチコゲニキュレートシナプス機能の電気生理学的調査を行う。このプロトコルは、同じ急性脳スライスの高放出および低放出確率でシナプスを研究する効率的な方法を提供します。...

網膜原生殖器およびコルチコゲン化シナプス機能の電気生理学的調査

電気刺激に応答した網膜ニューロンの挙動を計算的にモデル化するワークフローを要約する。計算モデルは用途が広く、さまざまな生理学的シナリオをシミュレートし、将来の in vivo/in vitro...

視覚補綴物研究のための網膜ニューロンの計算モデリング - 基礎的アプローチ

動的クランプ電気生理学は、ニューロンの発火障害とイオンチャネル機能障害との間の因果関係を確立できます。マウス小脳プルキンエニューロンにおける動的クランプ法とプロトコルについて説明し、有用なリソースと技術的考慮事項に注目します。代表的な研究では、モデル化されたナトリウムコンダクタンスを Tsc1-/-...

自閉症に関連するニューロンの興奮性障害を調査するための動的クランプ法

学ぶマウス網膜神経節細胞におけるダイナミッククランプを用いたシナプス入力の比とタイミングが神経発火に与える影響。この手法は興奮性と抑制性シナプス伝導度をリアルタイムに制御し、網膜回路の機能解明に有用である。

マウスの網膜神経節細胞におけるシナプスと人工コンダクタンスによるダイナミッククランプの実装

さらに動画を探す