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光学顕微鏡は、多くの実験で利用される装置であり、サンプルを1000倍まで拡大して観察することができます。最も単純な顕微鏡は、サンプルを拡大するための透明なレンズとサンプルに照射するための光源で構成されますが、実験で使用する光学顕微鏡の構造はもっと複雑です。多くの光学顕微鏡には、対物レンズや接眼レンズをはじめ精密に空間を調節できる精巧なレンズが内蔵されています。このビデオでは、光学顕微鏡の基本パーツやその使い方と機能について詳しく解説し、また、倍率、焦点、分解能などの基本原理を紹介しています。基本的な光学顕微鏡の操作は、サンプルに光を照射し、質の高い画像を得るために光源の強さや方向を調節することから始めます。次に、サンプルを適切に拡大し、観察ポイントにピントを合わせます。光学顕微鏡は多用途であり、染色の有無にかかわらず細胞や組織の観察するとき、サンプルの細部を解剖するときなどに使用されます。さらには手術中に目的領域を拡大し細かく複雑な作業を円滑に進めるためにも光学顕微鏡が活躍しています。
光学顕微鏡は、サンプルを拡大して観察するための装置です。光学顕微鏡を利用するとサンプルを１０００倍まで拡大して観察することができ、非常に有用な解析ツールとなります。光学顕微鏡の操作は簡単で、多くの実験に用いることができる優れものです。
名前からも分かるように光学顕微鏡には光源があり、コンデンサレンズを用いることでサンプルに焦点を当てることができます。
サンプルに照射された光は、対物レンズに達し倒立の拡大像が作り出されます。接眼レンズによりさらに拡大された像が作られ、それを観察することができます。光路にさらなる光学部品を配置することで正しい向きの像を観察できます。このように複数のレンズが組み合わされた顕微鏡のことを複合顕微鏡と呼びます。
複合顕微鏡の倍率は、対物レンズの倍率と接眼レンズの倍率を掛け合わせた値になります。例えば40倍の対物レンズと10倍の接眼レンズを使用するときの総合倍率は400倍です。
顕微鏡下で物体の大きさを推定するために、視野にスケールを映し出すレチクルを使用します。高倍率にすると、レチクルの一目盛りは、低倍率のときと比べて小さくなります。
倍率に加え、分解能も顕微鏡の重要な要素となります。分解能とは、顕微鏡下で微小な2点を識別可能な最小の距離のことです。これらキャラクターの頭がはっきり見えるほど、分解能が高いと言え、彼らを識別できる最小距離は小さくなります。
光学顕微鏡の基本となるパーツは、対物レンズ、接眼レンズ、サンプルをのせるステージとホルダー、光源、視野絞り、コンデンサと開口絞り、粗野及び微動ハンドルです。
中でも対物レンズは、倍率と分解能を決める最も重要な機器です。回転式のレボルバーに取り付けることで、焦点面を変えずに、つまり焦点を合わせたままでレンズを切り替えることができます。対物レンズには、倍率、対物レンズの開口数すなわちNA、液浸用の液体の種類、使用すべきカバーガラスの厚さ、作動距離つまり焦点を合わせた時のレンズ先端からサンプルまでの距離が記載されています。
開口数又はNAによって、対物レンズがどれだけ多くの光を取り入れられるかが決まります。開口数が大きいほど、広範囲の光を集められ、小さいほど直斜光のみが取り入れられます。対物レンズの分解能は、波長と開口数から求めることができます。
光源、視野絞り、開口絞り、コンデンサによって、サンプルに照射する光が作り出されます。
一般的な光源は、低電圧ハロゲンランプで、光強度を調整することができます。光は様々なフィルターを通過し、視野絞りでサンプルにあたる光の範囲を調整できます。通過した光はコンデンサによって集められ、サンプルに照射されます。照射される円錐状の光はコンデンサを使ってコントロールでき、使用する対物レンズに応じて調整する必要があります。
実際に光学顕微鏡を使ってみましょう。まずはサンプルを顕微鏡のステージの上に置き、観察対象物が対物レンズの真下にくるようにクリップで固定します。
次に、光源のスイッチを入れ、低倍率の対物レンズを選択します。
対物レンズを粗動ハンドルを使ってステージから遠ざける方向に動かしピントを合わせます。次に微動ハンドルを使ってしっかりとピントを合わせます。このときスライドやステージに接触してレンズを破損しないように注意してください。
接眼レンズを覗いて、ハンドルで調整しながらスライドを動かし観察ポイントを見つけ出します。低倍率から高倍率に切り替えると、視野は大幅に狭くなります。低倍率の対物レンズの真下で観察ポイントを決定してから、高倍率の対物レンズに切り替えることで、目的の検体を見つけやすくなります。
低倍率でフォーカスしたあとに高倍率に切り替える方法で、画像を取得してください。
照明を最適化するには、最初に視野絞りを使ってしぼり自体が視野に入り込まないようにセットします。
次に、コンデンサ絞りを調整し、対物レンズの開口数と一致させます。
最後にもう一度ピントを合わせます。このときは微動ハンドルのみを使用して下さい。これで画像が取得できました。
光学顕微鏡は、いろいろなサンプルの観察を可能にする機器であり、用途に応じて最適化された様々な複合顕微鏡があります。
これは手術用顕微鏡での作業準備をしているところです。この顕微鏡は可動式のアームに取り付けられており、立体視観察ができます。また、顕微鏡にはカメラが搭載されています。この手術用顕微鏡は、マウスへの腎移植を行う際に用いられます。
ここでは、研究者が解剖顕微鏡を覗きながら、ショウジョウバエの幼虫を選別しています。その後解剖して体壁筋を完璧に取り出し、神経筋接合部の研究を行います。
これは倒立顕微鏡です。対物レンズはステージの下に配置されており、マイクロインジェクション法に対応できます。体細胞核移植として知られるこの手法は、トランスジェニック動物やクローンを作製するための重要なテクニックです。
ここまでJoVE光学顕微鏡編をご覧いただきました。このビデオでは、光学顕微鏡の概要、使用方法、構造、調整の仕方、画像の取得方法を紹介しました。ご覧いただきありがとうございました。
光学顕微鏡は、研究用試料を拡大するための装置です。光学顕微鏡は、科学研究者が元のサイズの1000倍で物体を見ることができる可能性を秘めた非常に貴重な分析ツールです。ご覧のとおり、光学顕微鏡はいくつかの非常に基本的な原理で動作しますが、ラボで試料を視覚化するための用途はほぼ無限にあります。
その名前が示すように、光学顕微鏡には光源が必要であり、コンデンサーレンズによってサンプルに焦点を合わせることができる光を生成します。
標本を照らす光は、対物レンズと呼ばれるレンズに到達し、反転または逆さまになった拡大画像が作成されます。接眼レンズ、または接眼レンズは、画像をさらに拡大し、目がそれを受け取ります。光路に追加の光学素子を導入して画像を右に動かし、目が正しい向きで画像を見るようにすることができます。ここで紹介しているような複数のレンズを使用する顕微鏡は、複合顕微鏡と呼ばれます。
複合顕微鏡では、対物レンズの倍率に眼レンズまたは接眼レンズの倍率を掛けることにより、総倍率が計算されます。40倍の対物レンズと10倍の眼レンズを使用すると、合計倍率は400倍になります。
顕微鏡下の物体のサイズを推定するために、画像上に投影されたスケールである接眼レンズレチクルを使用することができます。高倍率では、接眼レンズレチクルの目盛りは、低倍率で表示したときよりも小さな距離を表します。
倍率に加えて、顕微鏡光学のもう一つの側面は解像度です。解像度とは、スコープ内の 2 つのオブジェクト間の最短の解決可能な距離を指します。これらのキャラクターの頭がますます明確になり、解像度が上がると、それらの間の最短観測可能な距離が減少します。
光学顕微鏡の主なコンポーネントには、対物レンズ、接眼レンズ、試料ステージと試料ホルダー、光源、フィールドダイアフラム、コンデンサーと絞り、および粗いフォーカスノブと細かいフォーカスノブが含まれます。
対物レンズは、顕微鏡の倍率と解像度の大部分を占めています。それらは、対物レンズが変更されても焦点面が同じままになるように、回転するノーズピースに取り付けられていますか?パラフォーカリティと呼ばれるプロパティ。対物レンズには、倍率、数値、またはNA、必要な液浸媒体の種類、サンプルをマウントするときに使用するカバースリップの厚さ、および作動距離(レンズエレメントの先端からサンプルの焦点面までの距離)をマークできます。
開口数は、再びNAとして定義され、顕微鏡の対物レンズが光をどれだけうまく集めることができるかの尺度です。北端の高い対物レンズは斜めの角度の光を通過させますが、北端の低い対物レンズはより直接的な光を必要とします。対物レンズの解像度は、光の波長を考慮して、開口数から計算できます。
光源、視野ダイアフラム、アパーチャ、コンデンサーはすべて、光を生成してサンプルに送る役割を果たします。
光源は通常、光の強度を制御するために調整できる低電圧ハロゲン電球です。
その後、光はさまざまなフィルターを通過してフィールドダイアフラムに入り、照射される試料の領域を制御します。
次はコンデンサーで、試料に明るく光を当て、試料の周りの照明の円錐はコンデンサーによって制御され、使用する対物レンズに応じて調整する必要があります。
光学顕微鏡の使用を開始するには、対象領域を含むサンプルを顕微鏡ステージに置き、対物レンズの真上に置き、ステージクリップを使用して所定の位置に固定します。
次に、光源をオンにして、最も低い出力の対物レンズに切り替えます。
次に、粗調整ノブの初期調整を使用して低倍率の対物レンズをz方向に動かし、微調整ノブを回してオブジェクトにピントを合わせます。スライドやステージに対物レンズをぶつけるとレンズが破損する恐れがありますのでご注意ください。
次に、ノブを調整しながらアイピースを覗き込み、スライドをx方向とy方向に動かすことで、関心のある領域を見つけます。視野のサイズは、低倍率から高倍率に移行すると大幅に減少します。
高出力に移動する前に、最も低い出力の対物レンズを対象領域の中央に配置すると、目的の試料を見つける可能性が大幅に高まります。
サンプルが低電力で検出され、焦点が合ったら、画像の取得に使用される高出力対物レンズに移動します。
まず、フィールド ダイアフラムを調整して、ダイヤフラム自体が視野のすぐ外にくるようにして、照明の品質を最適化します。
次に、コンデンサーダイヤフラムを調整して、使用している対物レンズの開口数と一致するように設定します。
最後に、もう一度ピントを調整します。今回は微調整ノブのみを使用します。
これで、標本の画像を撮影する準備が整いました。
光学顕微鏡は、さまざまな試料を可視化する可能性を秘めており、化合物顕微鏡にはさまざまな構成が存在し、さまざまな用途に適しています。
ここでは、手術用顕微鏡下で作業する準備をしている研究者が見えます。これらの顕微鏡は、一般的に可動アームに吊り下げられ、立体視されているため、光を視聴者に通過させ、顕微鏡に取り付けられたカメラも通過させることができます。この手術用顕微鏡は、マウスの腎臓移植手順で使用されています。
このクリップでは、研究者が解剖顕微鏡を覗きながら、さらに解剖に最適なショウジョウバエの幼虫を選び出し、体壁の筋肉を露出させて神経筋接合部を研究できるようにしています。
ここでは、ステージの下に対物レンズがあり、マイクロインジェクション技術の準備が行われている倒立型複合顕微鏡を見ることができます。この手順は体細胞核移植と呼ばれ、トランスジェニック動物を作製し、クローンを作製するための重要な方法です。
JoVEを観たばかりですか?光学顕微鏡の紹介。
このビデオでは、顕微鏡とは何か、顕微鏡がどのように機能するか、その多くのコンポーネント、それらを調整する方法、高品質の画像を取得する方法について説明しました。ご覧いただきありがとうございます!
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