Name: 細胞単層に機械的刺激によって誘発されるカルシウム波の伝播：ウシ角膜内皮細胞の例 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 学ぶ機械刺激誘発カルシウム波伝播の定量化法。ウシ角膜内皮細胞単層を用いて、ギャップ結合チャネルとヘミチャネルの細胞間コミュニケーションを共焦点顕微鏡で可視化する技術です。

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実験室で行われる研究活動は、研究財団からの補助金によって支えられて - フランダース（FWO、助成番号G.0545.08とG.0298.11）、大学間の観光極プログラム（ベルギーの科学政策、助成番号P6/28とP7/13）とFWOでサポートされている研究コミュニティに埋め込まれています。フランダース（FWO） - CDHは研究財団の博士研究員である。著者は、分子·細胞内シグナル伝達（KUルーベン）、博士SPスリニバス（検眼、米国インディアナ大学）博士Leybaert（ゲント大学）との研究室の研究室のすべての現在および元メンバーに非常に感謝しています有用な議論を、最適化された手順やコネキシンヘミチャネルの研究のためのツールの開発に関与していたが提供博士Vinken（VUB）。

1。角膜内皮細胞の分離始める前にした場合：目をenucleating後できるだけ早く、地元の屠殺場から入手した、新鮮な目から細胞を分離します。目が最大18ヶ月、5分死後とアールの平衡塩類溶液中で保存の牛から、摘出されたことを確認してください - 4で1％ヨウ素溶液実験室への輸送のための°C。 <ol><li> 1％ヨウ素溶液をペトリ皿（100×20㎜）に置く - アールの平衡塩溶液の目を取り出します。 </li><li> 70％エタノールを含有する溶液と目を殺菌し、1％のヨウ素が含まれているアールの平衡塩類溶液で洗い流してください。 </li><li>でこの手順から、無菌フードで働く。注意深く目から角膜を解剖し、上向き上皮細胞層とアールの平衡塩類溶液を含むペトリ皿（35×10mm）で、中に入れてください。慎重に残っ虹彩組織のSTIを削除必要に応じて角膜に付着う。 </li><li>上向きの内皮細胞層とペトリ皿を含む別のアールの平衡塩類溶液に角膜を転送し、アールの平衡塩類溶液で2回すすいでください。 </li><li>カップ状の皿です砂時計に上向き内皮層と角膜を移し、増殖培地でそれをカバーしています。増殖培地は、25 mMグルコース、10％ウシ胎児血清、6.6％L-グルタミン、2.5μgの/ mlのアムホテリシン-Bと1％抗生物質 - 抗真菌剤混合物を10,000単位を含む/ mlペニシリン、10,000アンピシリンを含有するダルベッコ変法イーグル培地から成りストレプトマイシン/ mlで、25μgの/ mlのアムホテリシンBを</li><li>吸引ピペットで培地を除去。 </li><li>角膜の内皮層（トリプシンを含むすべてのステップが同じ濃度を使用して行われています）にトリプシン溶液（0.5グラム/ L）を300μlを適用します。 </li><li>覆われたペトリ皿に角膜を含む砂時計を置き、株式会社に入れ37℃で30分間ubator℃、5％CO 2。 </li><li>優しく無菌フード内火災研磨フック状のガラスパスツールピペットを用いて角膜から内皮細胞をこすり取る。 </li><li>内皮細胞を含む溶液を吸う、培養培地4mlを含有する培養フラスコ（25cm 2の ）に追加する。 </li><li>角膜に増殖培地300μlのを適用し、スクレイピングを繰り返し、培養フラスコに内皮細胞を含む溶液を追加します。 </li><li>もう一度、この最後のステップ（1.11）を繰り返します。 </li><li>培養物を配置し、37℃インキュベーター内で増殖培地℃、5％CO 2で角膜内皮細胞を含有するフラスコ。 </li><li> 2日後、培養培地を6 mlを加える。 </li><li>毎秒一日成長培地をリフレッシュします。 </li></ol> 2。細胞培養<ol><li>培地を取り出して、到達したコンフルエントアールの平衡塩類溶液、（アブー内で細胞を2回洗浄する分離後のtは10日）。 </li><li>それらをデタッチし、3〜4分間インキュベーター（37℃、5％CO 2）でフラスコを配置する細胞に1.5ミリリットルトリプシン溶液を加える。 </li><li>増殖培地12ミリリットルを追加します。細胞を分散させ、細胞をカウントするために内と外培地三回ピペット。 </li><li>シード細胞密度に応じて可変の端数を持つ細胞と培養器に入れます。 165,000細胞の細胞数（1cm 2当たりの細胞密度39286）を持つ2つのウェルチャンバースライドを（4.2 cm 2との面積を持つ）を準備します。 1cm 2当たり6,250の密度で新しい道を80 cm 2と培養フラスコを準備し、25ミリリットルの合計ボリュームに新鮮な培地を追加します。 </li><li> 2日ごとに培地をリフレッシュします。 </li><li>細胞層の密集度は、3〜4日後に到達する。実験のためにセルを使用。 </li><li>ときフラスコ内の細胞層の密集度に達している、2.6に手順2.1を繰り返します。通路2までの細胞培養物をfを用いることができるまたは実験。 </li></ol> 3。誘導カルシウムウェーブのために機械的刺激<ol><li>静かに振とうしながら10μMのFluo-4とチャンバースライドで細胞をロードするには、AMで37℃で30分間のためにリン酸緩衝生理食塩水。 </li><li>フルオ-4ソリューションAM削除、リン酸緩衝生理食塩水で細胞を5回洗って、リン酸緩衝生理食塩水で細胞をインキュベートし、測定前に室温で少なくとも5分間細胞を残す。 </li><li>アルゴンレーザーと使用ビームスプリッタHFT 488と488 nmで励起し、ロングパス発光フィルターLP 505を使用して530 nmで蛍光発光を収集するには、最低でもピンホールを設定します。油浸40X対物レンズ（エア、1.2 NA）を使用します。 ARL-67156を用いた実験では、10倍の対物レンズ（エア、0.3 NA）を使用します。 </li><li>細胞は共焦点顕微鏡に合流されているフィールドを検索します。 </li><li>それは位置チャンバースライドに対しては45°であり、細胞膜に触れるように、ピペットを。単一のセルに短い（≈1秒）機械的刺激を引き起こす。機械的な刺激が簡潔ですアンプを通して運営圧電結晶ナノポジショナに結合ガラスマイクロピペット（先端直径&lt;1μm）を持つ細胞膜の1％未満に触れることにより、細胞の急性、短期的な変形で構成されていますマイクロマニピュレータに取り付け。ガラスマイクロピペットは、微小電極プラーで作られています。ナノポジショナが機械的刺激の間に0.2〜1.5 Vの間の電圧によって運営されていることを確認してください。 1.5 V以上の電圧は、セルの損傷につながることができます。各セルタイプと条件については、細胞の損傷なし機械的刺激のための最適な電圧を慎重ハイ（1.5V）電圧（0.2 V）が低いから始まる一連の電圧を印加することによって決定されなければならない。この電圧が細胞膜に適用される機械的応力および歪みを決定するので、電圧は、刺激の力の尺度である。ザ機械的刺激の力は領域で機械的応力を掛けることによって算出することができる。領域（&lt;3.14ミクロン2）および機械的応力の両方が非常に低いので、機械的な刺激の力が低い。 （細胞が損傷したときに、セルとセルの外蛍光漏れが暗くなりますので注意してください。） </li><li>共焦点顕微鏡での[Ca 2 +] iの次の機械的な刺激の空間的な変化を測定する。 </li><li>画像を収集し、保管してください。 </li><li>共焦点顕微鏡のソフトウェアを使用して応答性の細胞（アクティブエリア、AA）の総表面積を定義するには、興味のある多角形領域を描画します。 </li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

本稿では、マイクロピペットを使用して、ローカライズされた、制御された機械的刺激を提供することにより、プライマリウシ角膜内皮細胞の単層の細胞内のCa 2 +波の伝播を測定するための簡単な方法を述べる。機械的に刺激された細胞では、細胞内のCa 2 +波伝播11,67を駆動する本質的な細胞内シグナル伝達分子である、どちらも細胞内のIP 3およびCa 2における局所増加+、で応答します。のCa 2 +ヘミチャネルの開口部とGタンパク質共役P2の活性化を介して隣接セル中のCa 2 +信号をトリガATP 68,69の放出を誘発しながらIP 3を直接、ギャップ結合チャネル5 を介して隣接セルに転送される受容37-40。このプロセスのギャップ結合チャネルとヘミチャネルの相対的な寄与は、Cxの模倣の使用によって特徴付けられるペプチド、ATP分解酵素（ectonucleotida...

細胞間のコミュニケーションとシグナリングは細胞外組織におけるアゴニスト及び全臓器レベル1,2に対応して生理学的プロセスの調整のために不可欠である。細胞間コミュニケーションの最も直接的な方法は、ギャップ結合の発生によって作成されます。ギャップ結合は、隣接するセル3,4（ 図1）の2コネキシン（Cxの）ヘミチャネルの頭に頭ドッキングによって形成されたタンパク性チャネルであるギャップ結合チャネルのプラークです。ギャップ結合は、隣接セル6（ 図2）の細胞内貯蔵から引き起こし、変調のCa 2 +放出のCa 2 +又はIP 3 5を含む1.5未満キロダルトンの分子量を有する小さなシグナル伝達分子の通過を可能にする。ギャップ結合チャネルはしっかりレドックス変形例のように、内および分子間相互作用によって、タンパク質と細胞内シグナル伝達プロセスによって規制されているとリン7。 GJSは、それによって化学的および電気的合胞体として作用し、接続されたセルの協調対応を容易にします。例えば、心房および心室筋細胞全体の心筋活動電位の広がりはCxに基づくGJチャネル85によって媒介される。 CXSはギャップ結合チャネルとしての役割を持っているだけでなく、対ヘミチャネルを形成することにより、定期的なイオンチャネル8-10（ 図1）と同様に膜におけるチャネルとして機能していない。ヘミチャネルは、イントラと細胞外環境との間のイオンとシグナル伝達分子の交換を制御することにより、隣接するセル間のパラクリンシグナリングに参加しています。 多くの細胞型（上皮細胞、骨芽細胞、星状細胞、内皮細胞などのような）及び器官（脳、肝臓、網膜、蝸牛および脈管構造等）において、細胞間のCa 2 +波多細胞応答の調整のための基本となる<suP&gt; 11。特定の細胞内Ca 2 +濃度の増加は、このセルに限定されるものではなく、それによって細胞内のCa 2 +波12,13を確立し 、周囲の隣接セルに伝達されない。これらの細胞内のCa 2 +波合胞体などの細胞層の正常な生理的調節のために重要であり、それらの調節不全は、病態生理学的プロセス11と関連している。角膜内皮および上皮では、私たち自身の25-33を含む異なるグループ14-24は 、細胞間コミュニケーションの仕組みや役割を学んだ。非興奮性細胞では、角膜内皮細胞のように、細胞間コミュニケーションの二つの異なるモードが28,29、すなわちギャップ結合細胞間コミュニケーションとパラクリン細胞間のコミュニケーションを発生する。ギャップ結合細胞間コミュニケーションは、ギャップジャンクション7 を介してシグナル伝達分子の直接交換を伴う。ギャップジャンクショ​​ンtional細胞間の通信は、細胞増殖を制御し、細胞外ストレス10,34,35に同期された応答を確立し、組織の恒常性を維持するために重要である。病状の数は、ギャップ結合の結合が不完全によりCXSに減少し、これによって細胞間のギャップ結合コミュニケーション36に影響を及ぼしている。これは、多細胞生物におけるギャップ結合細胞間コミュニケーションの重要性と影響力を強調している。それは、細胞外拡散性メッセンジャー（ 図2）の放出を伴うため、ギャップ結合細胞間の通信とは対照的に、傍分泌細胞間の通信は、細胞-細胞同格に依存しない。シグナル伝達分子の異なるタイプのシグナリング細胞によって細胞外空間に放出される。分子は、それが特定の受容体タンパク質によって検出される標的細胞に輸送される。その後、受容体シグナル複合体はどの細胞応答を誘導信号、不活化又は脱感作を除去することによって終了する。リリース脂溶性の細胞外シグナル伝達の使者は膜を貫通し、細胞内の受容体に作用。対照的に、親水性の使者が応答細胞の原形質膜を通過しないが、その後、細胞内環境への信号を中継する表面発現受容体タンパク質に結合するリガンドとして作用する。細胞表面受容体タンパク質の三大家族がこのプロセスに参加：イオンチャネル連結、酵素、およびGタンパク質結合した。解放メッセンジャー分子は、近接標的細胞（パラクリン）上、または循環系（内分泌）を必要とする遠隔標的細胞に、同一セル（自己分泌）の受容体に作用することができる。 角膜内皮28,29を含む多くの細胞型において、ATPは、細胞間のCa 2 +波37-40の伝播を駆動する主要な親水性、パラクリン要因の一つである。 DURる種々の薬剤による機械的変形、低酸素症、炎症または刺激ATPは44,45を膨潤せん断応力、伸張、又は浸透圧に応答して41-44健常細胞から放出させることができる。別のATP放出メカニズムは、同様に、小胞のエキソサイトー44、例えばATP結合カセット（ABC）トランスポーター、形質膜電位依存性アニオンチャネル46、P2X7受容チャネル47,48などのトランスポートメカニズムの過多を含む、仮定されている コネキシンのヘミチャネル49-52とpannexinのヘミチャネル43,49,53。細胞外ATPはADP、AMPに急速に加水分解されると細胞外環境に存在するectonucleotidasesで54,55をアデノシンができます。細胞外に放出されたATP及びその代謝ADP 56は拡散によって広がっていく。隣接するセルでプリン受容体とこれらのヌクレオチドのその後の相互作用は、pに関与している細胞内のCa 2 +波28,37,51のropagation。プリン受容体の二つの異なるクラスが存在している：両方のプリン（ATP、ADP）とピリミジン（UTP、UDP）ヌクレオチドが最もP2-57プリン受容体に作用しながら、アデノシンは、P1-プリン受容体の主要天然リガンドである。 細胞間のコミュニケーションは、スクレープ負荷、移染、IP 3およびCa 2 +、機械的刺激、 等のようなアゴニストのローカルアンケージングなどの異なる方法で調査することができる。ここでは、+波の伝播は、単一セルの機械的刺激によって誘発されるのCa 2の研究を説明します。機械的刺激によってのCa 2 +波伝播を研究することの利点は、時間をかけてのCa 2 +波の広がりを定量化する簡単なツールを提供し、それは定量的に細胞の異なる前処理とを比較可能にすることである。角膜内皮において、これらの細胞内のCa 2 +波共同を可能にする単層からコーディネートの応答は、ここに眼内手術中に細胞外の応力に耐えられるように内皮を助ける非再生角膜内皮の可能性の防御機構として機能しているか、免疫拒絶またはブドウ膜炎58,59間に炎症性メディエーターに暴露される。

<table><tbody><tr><td>Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (カールスルーエ、ドイツ)</td><td>14155-048</td><td></td></tr><tr><td>Iodine</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td><td>38060-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン (Glutamax)</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (カールスルーエ、ドイツ)</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin-B</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-antimycotic mixture</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (カールスルーエ、ドイツ)</td><td>14190-091</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (カールスルーエ、ドイツ)</td><td>F14217</td><td></td></tr><tr><td>ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-ジブロモメチレン-D-ATP) </td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)Sigma-Aldrich (</td>Deisenhofen, Germany)<td>A265</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase VI</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td><td>A6410</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase VII</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Gap26 (VCYDKSFPISHVR)</td><td>Custom peptide synthesis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gap27 (SRPTEKTIFII)</td><td>Custom peptide synthesis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Control Peptide (SRGGEKNVFIV)</td><td>Custom peptide synthesis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA1 Cx43 (sense: 5'GAAGGAGGAACU-CAAAdTdT) </td><td>Annealed siRNA was purchased atEurogentec (Luik, Belgium)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA2 Cx43 (sense: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) </td><td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)siRNA</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) </td><td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)</td><td>Thermo Electron (Ulm, Ulm,ドイツ)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) </td><td>Thermo Electron (Ulm, Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Two chambered glass slide</td><td>Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark)</td><td>155380</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡 </td><td>Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany)</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>ピーツ&#8211;レクトリッククリスタルナノポジショナー(ピエゾフレクシャーナノポジショナー)</td><td>PI Polytech(カールスルーエ、ドイツ)</td><td>P-280</td><td></td></tr><tr><td>HVPZT-amplifier</td><td>PI Polytech(カールスルーエ、ドイツ)</td><td>E463 HVPZT-amplifier</td><td></td></tr><tr><td>ガラス管(ガラス交換3.5ナノリットル)</td><td>World Precision Instruments, Inc. サラソタ、フロリダ州、米国</td><td>4878</td><td></td></tr><tr><td>Micr&#8211;レクトローデプーラー </td><td>Zeitz Instrumente (ドイツ・ミュンヘン)</td><td>WZ DMZ-Universal Puller</td><td></td></tr></tbody></table>

細胞単層に機械的刺激によって誘発されるカルシウム波の伝播：ウシ角膜内皮細胞の例

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

細胞間のコミュニケーションは、脳、肝臓、網膜、蝸牛と血管系を含む、臓器や組織の様々な細胞間の生理学的プロセスの調整のために不可欠です。実験的な設定では、細胞内のCa 2 +波単一セルに機械的刺激を印加することによって誘発することができる。これは、細胞内シグナル伝達分子のIP 3およびCa 2のリリースにつながる+隣接セルへの機械的刺激を受けた細胞から+波同心円状のCa 2の伝播を開始すること。細胞内のCa 2 +波の伝播を制御する主要な分子経路は、IP 3の直接転送を通って、ATPの放出を通じてヘミチャネルによってギャップ結合チャネルによって提供されます。プロパティと異なるコネキシンおよびギャップ結合チャネルとヘミチャネルとしてpannexinアイソフォームの規制の同定と特徴付けはquantificatioで許可されているnは細胞内のCa 2 +波は、siRNA、およびギャップ結合チャネルとヘミチャネルの阻害剤の使用の広がり。ここでは、結果として細胞内のCa 2細胞の急性、短期的な変形によって引き起こさ制御およびローカライズされた機械的刺激に応答しFluo4-AMでロードプライマリー角膜内皮細胞の単層で+波を測定するための方法を説明1μm未満の先端径を有するマイクロマニピュレータ制御されたガラスマイクロピペットで細胞膜に触れる。また、+波ATPの放出を通じて細胞内のCa 2のための駆動力としてCx43の-ヘミチャネルの活性を評価するためのモデル系として、一次ウシ角膜内皮細胞およびその使用の単離を記述している。最後に、我々は、使用、利点、制限およびギャップ結合チャネルとヘミチャネル研究の文脈におけるこの方法の選択肢を議論する。

すべての実験は、関連するすべてのガイドライン、規制、規制機関に準拠して実行され、実証されているプロトコルは、KUルーベンの動物のケアと使用委員会の指導と承認の下で行われる。 ウシ角膜内皮細胞（BCEC）で、機能的なギャップ結合を発現させ、ギャップ結合細胞間コミュニケーションとパラクリン細胞間通信の両方は、インタラクティブな方法で細胞間のコミュニケーションに大きく貢献するが、主な経路はによって仲介パラクリン細胞間の通信経路であることが示されているされているCx43のベースヘミチャネル28,29を通じてATP放出。 ATPとADPはectonucleotidase E-NTPD1（ectonucleoside三リン酸ジホ1、CD39 ATPジホ）により一リン酸（AMP）をアデノシンために加水分解され、その後、5&#39;-ectonucleotidase CD73 28,29によってアデノシンする。 ATPとADPはに貢献P2Y1およびP2Y2受容体28,29に結合することによりCa 2 +の波の伝...

細胞間のCa<sup&gt; 2 +</sup&gt;波は、ギャップ結合チャネルとヘミチャネルによって駆動される。ここでは、細胞間のCaを測定するための方法を説明<sup&gt; 2 +</supローカル単細胞機械的刺激とプロパティとギャップ結合チャネルとヘミチャネルの規制を調査するために、そのアプリケーションに応じて、細胞単層で&gt;波。

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

本実験の目的は、初代角膜内皮細胞の単層において、機械的刺激によって誘発される細胞間カルシウム波の広がりを定量化することで、ギャップ結合チャネルおよびHEMIチャネルを介した細胞間通信を研究することである。まず、新鮮な牛の眼から初代角膜内皮細胞を単離する。次に、チャンバー付きスライドに播種し2〜3日後、コンフルエントな細胞単層にカルシウム感受性蛍光染料のFluo-4 AMをロードする。その後、単層内の一つの細胞に制御された局所的な機械的刺激を与えて細胞間カルシウム波を誘発し、これを共焦点顕微鏡で可視化する。結果は、細胞間カルシウム波伝播の広がりに基づいています。最終的に、ギャップ結合チャネルおよびヘミチャネルの阻害を用いることで、ギャップ結合チャネルおよびヘミチャネルを構成する異なるConexおよびpanexアイソフォームの特性と調節機構を明らかにします。機械的刺激によって誘導される細胞間カルシウム波伝播の主な利点は、コネクシンチャネルおよびパネクシンチャネルの寄与と特性を、非侵襲的な方法で簡便かつ確実に調べられることです。さらに、この手法は、解析対象となる細胞システム内に存在する生理学的シグナル分子およびカスケードに依存しています。最後に、本手法は、一次細胞や、特定のコネクシンまたはPanINアイソフォームを異所性に発現させた細胞モデルを含む、さまざまな細胞システムに容易に適応させることが可能です。この手法を用いることで、内因性コネクシンまたはPanINアイソフォームのsiRNA媒介ノックダウン、およびギャップ junction チャネルおよびヘミチャネルの選択的阻害剤の使用により、コネクシンおよびPanINベースのギャップ junction チャネルおよびヘミチャネルの機能と動的な調節に関する知見を得ることができます。このシステムは、角膜内皮細胞のみに限定されるものではありません。実質的にあらゆる細胞型や、より複雑な組織にも適応可能です。本手順では、死後5分以内の、生後18ヶ月以下の牛から採取した新鮮な眼球を使用します。それは、4°CのEarl平衡塩溶液（EBSS）および1%ヨウ素溶液を用いて研究室に運搬されました。まず、眼球を100 mm × 20 mmのペトリ皿に移します。次に、1%ヨウ素を含むEBSSで眼球を洗浄します。以降は70%エタノール溶液を用いて滅菌してください。操作はクリーンベンチ内で行います。眼球から角膜を慎重に切り出し、上皮細胞層を上にした状態で、EBSSが入った35 mm × 10 mmのペトリ皿に配置します。角膜に付着している残りの虹彩組織を慎重に除去します。必要に応じて、角膜を内皮細胞層を上にして別のEBSS入りのディッシュに移し、EBSSで2回洗浄します。次に、内皮層を上向きにして角膜をアワーグラスに配置し、増殖培地で満たします。洗浄するため、吸引ピペットで培地を除去します。0.5 g/Lのトリプシン溶液300 µLを角膜の内皮層に適用します。角膜を入れたアワーグラスを蓋付きペトリ皿に入れ、37 °C、5% CO2のインキュベーター内で30分間静置します。アワーグラスを回収した後、火あぶりで先端を曲げたガラスパストゥールピペットを用いて、角膜から内皮細胞を慎重に掻き出します。内皮細胞を含む溶液を吸引し、4 mLの培地が入った25 cm²の培養フラスコに加えます。次に、角膜に300 µLの増殖培地を塗布します。スクレイピングを繰り返し、内皮細胞を含む溶液を培養フラスコに加えます。この操作をもう一度繰り返し、角膜内皮細胞を含む培養フラスコを、増殖培地とともに37°C、5% carbon dioxideのインキュベーター内に置きます。2日後、6 mLの培養液を加え、2日ごとに増殖培地を更新します。細胞は、分離から継代までの7〜10日以内にコンフルエントになるはずです。まず、培地を吸引し、EBSSで2回洗浄します。次に、2 mLのトリプシン溶液を細胞に加え、フラスコをインキュベーターに3〜4分間置きます。次に、12 millilitersの増殖培地を加え、ピペッティングを3回繰り返して細胞を分散させます。その後、血球計数器または自動細胞カウンターを用いて細胞数をカウントします。2ウェルのカルチャースライドに、それぞれ165,000個の細胞を播種します。次に、細胞密度 6,250 cells/cm² で継代するため、75 cm² の四角形培養フラスコを準備し、新鮮な培地を合計 25 mL まで加え、フラスコとチャンバースライドをインキュベーターに入れます。培地は2日ごとに交換し、3〜4日以内に細胞層がコンフルエントに達するようにします。まず、チャンバースライド上の細胞に、10 µM の Fluo-4 AM を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を加え、37 °C で 30 分間、緩やかに揺らしながらインキュベートします。細胞を Fluo-4 AM でインキュベートしている間に、先端径 1 µm 未満のガラスマイクロピペットを piezo-electrics ナノポジショナーに取り付け、マイクロマニピュレーターに装着したアンプに接続します。ナノポジショナーの電圧を0.2から1.5 Vの間に設定します。4:00 AM溶液を除去します。次に、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を5回洗浄し、測定前に室温で少なくとも5分間、PBSを用いて細胞をインキュベートします。アルゴンレーザーを用いて488 nmで励起し、ビームスプリッターHFT 48を使用します。ピンホールを最小に設定し、ロングパスエミッションフィルターLP 505を用いて530 nmの蛍光放出を収集します。ここでは油浸40倍対物レンズを使用しています。チャンバースライドを共焦点顕微鏡のステージに置き、細胞がコンフルエントになっている領域を探します。次に、マイクロマニピュレーターを操作して、ガラス製マイクロピペットが細胞膜に45度の角度で接触するように配置します。マイクロマニピュレーターを操作し、ガラス製マイクロピペットで単一細胞の細胞膜の1%未満に短時間接触させ、細胞に1秒間の機械的刺激を与えます。その後、共焦点顕微鏡を用いて機械的刺激後のカルシウムイオン濃度の空間的変化を測定し、画像を収集して保存します。最後に、共焦点顕微鏡のソフトウェアを使用して、反応細胞の総表面積を定義するための多角形の関心領域（ROI）を描画します。ウシ角膜内皮細胞におけるコントロール条件下での機械的刺激誘発性カルシウム一過性変化を、代表的な擬似カラー蛍光画像で異なる時間経過とともに示しており、最初の画像には刺激前の蛍光強度が表示されています。2枚目の画像の白い矢印は、機械的に刺激された細胞を示しています。カルシウム波は隣接する6層の細胞層まで伝播し、波が到達した細胞の総面積による有効面積は62,870 µm²となります。折れ線グラフは、機械的に刺激された細胞（msと表記）における正規化蛍光値（NF）の時間経過と、隣接する1層目から5層目の細胞層（グラフ上のMB 1からMB 5と表記）におけるNFの平均値を示しています。これらの画像は、左側のグラフに示す外因性ヌクレオチド処理後および右側のグラフに示すエクトヌクレオチダーゼ阻害剤処理後の、細胞間カルシウム波の広がりの有意な変化を詳細に示しています。具体的に、左側のグラフは、ウシ角膜内皮細胞に外因性のApyrase 6およびApyrase 7を処理した結果、ATPおよびADPが加水分解され、これによりペリクリン細胞間通信経路が抑制されたことで、有効面積が有意に減少したことを示しています。アスタリスクは、aceの存在下と不在下におけるP値が0.001未満であることを示します。右側のグラフは、BCECを選択的外細胞外ヌクレオチド阻害剤であるA RL 6 7 1 56で処理した後、活性領域が有意に増加し、これによりペリクリン細胞間通信経路が強化されたことを示しています。アスタリスクは、a RLの存在下と不在下におけるP値が0.001未満であることを示しています。習得後。適切に実施すれば、1つの条件下での1回の実験につき、この手法は5分から10分で完了します。異なる条件を比較し、統計的な結論を導き出すための一連の実験を行うには、1日を要します。また、異なる日に、異なるバッチの単離細胞を用いて行われた独立した実験の結果を用いる必要があります。細胞内カルシウム波の伝搬を測定および定量化することで、ギャップ結合チャネルやヘミチャネルなどの異なるコネキシンおよびインネクシンアイソフォームの細胞生物学的調節を同定し、特徴付けることができます。また、この手法は単独で機能するのではなく、ダイ transferからTP放出、電気生理学に至るまで、他の分子生物学的および機能的なアプローチによって補完されるべきであることも強調しておきます。

mechanical-stimulation-induced-calcium-wave-propagation-cell

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JoVE Journal

Biology

生物学

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学ぶ機械刺激誘発カルシウム波伝播の定量化法。ウシ角膜内皮細胞単層を用いて、ギャップ結合チャネルとヘミチャネルの細胞間コミュニケーションを共焦点顕微鏡で可視化する技術です。

細胞単層に機械的刺激によって誘発されるカルシウム波の伝播：ウシ角膜内皮細胞の例

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