細胞単層に機械的刺激によって誘発されるカルシウム波の伝播：ウシ角膜内皮細胞の例

本実験の目的は、初代角膜内皮細胞の単層において、機械的刺激によって誘発される細胞間カルシウム波の広がりを定量化することで、ギャップ結合チャネルおよびHEMIチャネルを介した細胞間通信を研究することである。まず、新鮮な牛の眼から初代角膜内皮細胞を単離する。次に、チャンバー付きスライドに播種し2〜3日後、コンフルエントな細胞単層にカルシウム感受性蛍光染料のFluo-4 AMをロードする。その後、単層内の一つの細胞に制御された局所的な機械的刺激を与えて細胞間カルシウム波を誘発し、これを共焦点顕微鏡で可視化する。

結果は、細胞間カルシウム波伝播の広がりに基づいています。最終的に、ギャップ結合チャネルおよびヘミチャネルの阻害を用いることで、ギャップ結合チャネルおよびヘミチャネルを構成する異なるConexおよびpanexアイソフォームの特性と調節機構を明らかにします。機械的刺激によって誘導される細胞間カルシウム波伝播の主な利点は、コネクシンチャネルおよびパネクシンチャネルの寄与と特性を、非侵襲的な方法で簡便かつ確実に調べられることです。

さらに、この手法は、解析対象となる細胞システム内に存在する生理学的シグナル分子およびカスケードに依存しています。最後に、本手法は、一次細胞や、特定のコネクシンまたはPanINアイソフォームを異所性に発現させた細胞モデルを含む、さまざまな細胞システムに容易に適応させることが可能です。この手法を用いることで、内因性コネクシンまたはPanINアイソフォームのsiRNA媒介ノックダウン、およびギャップ junction チャネルおよびヘミチャネルの選択的阻害剤の使用により、コネクシンおよびPanINベースのギャップ junction チャネルおよびヘミチャネルの機能と動的な調節に関する知見を得ることができます。

このシステムは、角膜内皮細胞のみに限定されるものではありません。実質的にあらゆる細胞型や、より複雑な組織にも適応可能です。本手順では、死後5分以内の、生後18ヶ月以下の牛から採取した新鮮な眼球を使用します。

それは、4°CのEarl平衡塩溶液（EBSS）および1%ヨウ素溶液を用いて研究室に運搬されました。まず、眼球を100 mm × 20 mmのペトリ皿に移します。次に、1%ヨウ素を含むEBSSで眼球を洗浄します。

以降は70%エタノール溶液を用いて滅菌してください。操作はクリーンベンチ内で行います。眼球から角膜を慎重に切り出し、上皮細胞層を上にした状態で、EBSSが入った35 mm × 10 mmのペトリ皿に配置します。

角膜に付着している残りの虹彩組織を慎重に除去します。必要に応じて、角膜を内皮細胞層を上にして別のEBSS入りのディッシュに移し、EBSSで2回洗浄します。次に、内皮層を上向きにして角膜をアワーグラスに配置し、増殖培地で満たします。

洗浄するため、吸引ピペットで培地を除去します。0.5 g/Lのトリプシン溶液300 µLを角膜の内皮層に適用します。角膜を入れたアワーグラスを蓋付きペトリ皿に入れ、37 °C、5% CO2のインキュベーター内で30分間静置します。

アワーグラスを回収した後、火あぶりで先端を曲げたガラスパストゥールピペットを用いて、角膜から内皮細胞を慎重に掻き出します。内皮細胞を含む溶液を吸引し、4 mLの培地が入った25 cm²の培養フラスコに加えます。次に、角膜に300 µLの増殖培地を塗布します。

スクレイピングを繰り返し、内皮細胞を含む溶液を培養フラスコに加えます。この操作をもう一度繰り返し、角膜内皮細胞を含む培養フラスコを、増殖培地とともに37°C、5% carbon dioxideのインキュベーター内に置きます。2日後、6 mLの培養液を加え、2日ごとに増殖培地を更新します。

細胞は、分離から継代までの7〜10日以内にコンフルエントになるはずです。まず、培地を吸引し、EBSSで2回洗浄します。次に、2 mLのトリプシン溶液を細胞に加え、フラスコをインキュベーターに3〜4分間置きます。

次に、12 millilitersの増殖培地を加え、ピペッティングを3回繰り返して細胞を分散させます。その後、血球計数器または自動細胞カウンターを用いて細胞数をカウントします。2ウェルのカルチャースライドに、それぞれ165,000個の細胞を播種します。

次に、細胞密度 6,250 cells/cm² で継代するため、75 cm² の四角形培養フラスコを準備し、新鮮な培地を合計 25 mL まで加え、フラスコとチャンバースライドをインキュベーターに入れます。培地は2日ごとに交換し、3〜4日以内に細胞層がコンフルエントに達するようにします。まず、チャンバースライド上の細胞に、10 µM の Fluo-4 AM を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を加え、37 °C で 30 分間、緩やかに揺らしながらインキュベートします。細胞を Fluo-4 AM でインキュベートしている間に、先端径 1 µm 未満のガラスマイクロピペットを piezo-electrics ナノポジショナーに取り付け、マイクロマニピュレーターに装着したアンプに接続します。

ナノポジショナーの電圧を0.2から1.5 Vの間に設定します。4:00 AM溶液を除去します。次に、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を5回洗浄し、測定前に室温で少なくとも5分間、PBSを用いて細胞をインキュベートします。

アルゴンレーザーを用いて488 nmで励起し、ビームスプリッターHFT 48を使用します。ピンホールを最小に設定し、ロングパスエミッションフィルターLP 505を用いて530 nmの蛍光放出を収集します。ここでは油浸40倍対物レンズを使用しています。チャンバースライドを共焦点顕微鏡のステージに置き、細胞がコンフルエントになっている領域を探します。

次に、マイクロマニピュレーターを操作して、ガラス製マイクロピペットが細胞膜に45度の角度で接触するように配置します。マイクロマニピュレーターを操作し、ガラス製マイクロピペットで単一細胞の細胞膜の1%未満に短時間接触させ、細胞に1秒間の機械的刺激を与えます。その後、共焦点顕微鏡を用いて機械的刺激後のカルシウムイオン濃度の空間的変化を測定し、画像を収集して保存します。

最後に、共焦点顕微鏡のソフトウェアを使用して、反応細胞の総表面積を定義するための多角形の関心領域（ROI）を描画します。ウシ角膜内皮細胞におけるコントロール条件下での機械的刺激誘発性カルシウム一過性変化を、代表的な擬似カラー蛍光画像で異なる時間経過とともに示しており、最初の画像には刺激前の蛍光強度が表示されています。2枚目の画像の白い矢印は、機械的に刺激された細胞を示しています。

カルシウム波は隣接する6層の細胞層まで伝播し、波が到達した細胞の総面積による有効面積は62,870 µm²となります。折れ線グラフは、機械的に刺激された細胞（msと表記）における正規化蛍光値（NF）の時間経過と、隣接する1層目から5層目の細胞層（グラフ上のMB 1からMB 5と表記）におけるNFの平均値を示しています。これらの画像は、左側のグラフに示す外因性ヌクレオチド処理後および右側のグラフに示すエクトヌクレオチダーゼ阻害剤処理後の、細胞間カルシウム波の広がりの有意な変化を詳細に示しています。具体的に、左側のグラフは、ウシ角膜内皮細胞に外因性のApyrase 6およびApyrase 7を処理した結果、ATPおよびADPが加水分解され、これによりペリクリン細胞間通信経路が抑制されたことで、有効面積が有意に減少したことを示しています。

アスタリスクは、aceの存在下と不在下におけるP値が0.001未満であることを示します。右側のグラフは、BCECを選択的外細胞外ヌクレオチド阻害剤であるA RL 6 7 1 56で処理した後、活性領域が有意に増加し、これによりペリクリン細胞間通信経路が強化されたことを示しています。アスタリスクは、a RLの存在下と不在下におけるP値が0.001未満であることを示しています。習得後。

適切に実施すれば、1つの条件下での1回の実験につき、この手法は5分から10分で完了します。異なる条件を比較し、統計的な結論を導き出すための一連の実験を行うには、1日を要します。また、異なる日に、異なるバッチの単離細胞を用いて行われた独立した実験の結果を用いる必要があります。

細胞内カルシウム波の伝搬を測定および定量化することで、ギャップ結合チャネルやヘミチャネルなどの異なるコネキシンおよびインネクシンアイソフォームの細胞生物学的調節を同定し、特徴付けることができます。また、この手法は単独で機能するのではなく、ダイ transferからTP放出、電気生理学に至るまで、他の分子生物学的および機能的なアプローチによって補完されるべきであることも強調しておきます。