Name: 人間の3次元の組織工学 in vitroで腫瘍テストシステム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-06T08:56:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: 学ぶ脱細胞化バイオスカフォールドを用いた3次元腫瘍テストシステムの構築法。原代人細胞を用いてin vivo環境を模擬し、腫瘍進行や転移の研究に貢献する革新的な組織工学アプローチを探索する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者らは、バイオリアクターやバイオリアクター培養器を開発するために彼の技術的なサポートのために月ハンスマン（フラウンホーファーIGB、シュツットガルト）に感謝したいと思います。

1。 BioVaScの脱細胞化<ol><li>カニューレを挿入し、動脈アクセスおよびPBSで腸管腔経由でブタ空腸セグメントの血管系をすすい- 。それが完全にきれいになるまで繰り返します。 </li><li> 4アダプタと200ミリメートル直径のガラス水槽を準備し、蠕動ポンプ（Ismatec）にシリコンチューブを経由して接続してください。制御部圧力は、無菌使い捨てドーム（ 図1参照）に接続された圧力センサを介して監視することができる。 </li><li>脱細胞化（DZ）溶液とリザーバーボトルを記入し、可能な気泡のための配管システムをチェックします。 </li><li>管腔フロー用のガラスコネクタにケーブルタイで腸管腔を接続します。血管系の赤い動脈アクセスします（ 図1B）に500ミリリットルDZ液ポンプ。全体を手動腸管腔を押してすぐにポンププロセスごとに15分を中断します。 </li><li> decellularizati中に自然に血圧をモデルにした100 mmHgで、 - プロセスに、緩衝液の圧力は80の間でなければなりません。 </li><li> PBSでBioVaScを洗う-それは、細胞残骸から外れるまで（「完全に白」）。 </li><li> DZ液で完全にBioVaScを記入し、それがシェーカーロッキングに4℃で一晩DZ液に沈めインキュベートする。 </li><li>ステップ1.6を​​繰り返します。 </li><li> DNase溶液中BioVaScを置き、シェーカーロッキングに4℃で一晩インキュベートする。 </li><li> DNase溶液を外し、洗浄緩衝液ですすいでください。 </li><li> 25kGyのγ-殺菌</li></ol> 2。異なる細胞型初代ヒト皮膚微小血管内皮細胞（低継代数のMVEC）および線維芽細胞の単離2.1 <ol><li> 2の短冊状に皮膚生検（好ましくは包皮）をカット-メスで3mmの幅と、それらをPBSで3回すすいでください-ソリューション。 </li><li>ディスパーゼ溶液で組織をカバーし、16のためにそれを培養する - 14℃で8時間</li><li>独立した2ピンセットで真皮から表皮とは、PBS +で満たさペトリ皿に、両方を別々に転送。 </li><li>リンス真皮はベルセンで1Xを取り除きます。 </li><li>真皮ストリップに10ミリリットルのトリプシン/ EDTA溶液を加え、40分間インキュベーター内でインキュベートする。 </li><li> 1％FCSですぐに酵素反応を停止。 </li><li> VascuLifeで満たされたペトリ皿に皮膚ストリップを転送し、それぞれの側8Xメスで、各ストリップを傷、少しの圧力を加える。 </li><li>遠心チューブにセルストレーナーを介して生成細胞懸濁液を転送し、VascuLifeでセルストレーナーの3回すすいでください。 </li><li> 5分間1200×gでチューブを遠心分離し、VascuLifeで細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>線維芽細胞を単離するために、チョップ真皮はメスを用いて小さな破片に取り除きます。 </li><li>真皮片をコラゲナーゼ溶液10mlを加える。 </li><li>インキュベーター内で45分間静置してから遠心分離し、慎重にSUを削除pernatant。 </li><li> DMEM +10％のFCS +％PenStrep、遠心分離機それにペレット1Xを洗浄し、慎重に上清を除去します。 </li><li>培養液中にペレットを再懸濁し、細胞が組織の外に成長することができるように、T75培養フラスコに移す。 </li></ol> 2.2腫瘍細胞株S462 （親切に博士ニコラHoltkamp、シャリテ大学医学部ベルリン提供）腫瘍細胞株S462は、遺伝性腫瘍素因症候群神経線維腫症1型9と女性患者の悪性末梢神経鞘腫瘍から生成されました。 S462は、10％FCSを補充したDMEM中で培養する。 3日 - 中は、すべての2に変更する必要があります。週に一度のセルを分割する必要があります。 3。腫瘍試験システム：静的培養条件バイオリアクターシステムの動的な文化との比較<ol><li>管状SIS-MUCが片側に開いて、二つの金属リング（細胞クラウン、直径10mm、自己cの間に固定するカットonstructed）。一晩細胞培養培地中のSIS-MUCをカバーしています。 </li><li> SIS（モノ - もしくは共培養セットアップ）の片面または両面上に定義された細胞数のシード単離された細胞（以下を参照）。 <ol><li>シードSIS（旧漿膜）の基底外側表面に全量100μlの一次低継代数の8,000個/ cm 2。 3時間後に水没文化を確実にするための媒体とよくを埋める。 </li><li>内皮細胞は3日間、接着させる。 180度の静的培養システムを裏返して12ウェルプレートに移す。 </li><li> SIS（旧ルーメン側）の先端面上に500μlの総容積内で一次皮膚線維芽細胞（8,000細胞/ cm 2）及び腫瘍細胞（15,000細胞/ cm 2）の混合物に播種する。 </li><li>細胞は3時間付着し、メディアとうまく埋めるために許可する（沈め文化、中：10％FCSを添加した50％Vasculife +50％のDMEM）。 </li><li>腫瘍試験システムは、静的条件aの条件下で培養されるトン37°C、さらに14日間インキュベーター中5％CO 2。 3日 - 2日毎の培地を変更します。 </li></ol></li><li>ダイナミックな文化のために、2の金属リングとの間で、SIS-MUCを修正し、3.2.1で説明したように、一次低継代数をシード。 3日後の金属リングからSIS-MUCを削除し（ 図2C及び2Dを参照）、フロー反応器内に膜を挿入します。バイオリアクター内でマトリックス上にシリンジおよびカニューレを有する一次皮膚線維芽細胞および腫瘍細胞を適用し、細胞を培地でバイオリアクターシステムを充填する前に、3時間付着させる。 </li><li>翌日、一定の媒体流（3.8 ml /分、37℃及び5％CO 2）を用いて動的培養条件を開始することができる。動的培養物を14日間維持され、培養培地を7日後に変更される。 </li><li>動的テストのセットアップは、ポンプや必要な温度とCO 2を介してメディアフローを提供し、自己構築インキュベーターで培養する</sub&gt;内容。 </li></ol> 4。分析のための特性評価方法 4.1固定及びシードされたコラーゲンマトリックスのパラフィン包埋<ol><li> （免疫）組織学的特徴付けのために、培地を除去し、2時間、4％パラホルムアルデヒドで組織を固定します。 </li><li> 4％パラホルムアルデヒドを除去して組織包埋カセットに金属インサートからSISを転送します。残りの固定液を除去し、パラフィン浸透のために脱水するために組織を水</li><li>パラフィンブロックに埋め込む前に、2にSISをカット - 3スライスと切断面が下に向くようにパラフィンを充填した金属ベース金型内に配置します。バックアップなどの金型の上に組織カセットを追加します。 </li><li> 5μmのスライスをカットし、矯正のための40℃の水浴上に浮遊し、その後、適切なガラススライド上にスライドをマウントします。コー​​ティングされていないスライドをH＆E汚れの付着を改善するための免疫組織学的染色のためのポリリジン被覆スライドに使用される。スライスは完全に乾燥させます。 </li><li>パラフィンを溶かし、キシレンでそれを削除し、染色を次のスライスを再水和。 </li></ol> 4.2染色<ol><li>再水和スライスは、標準化された概要染色としてのヘマトキシリン​​/エオシンで染色することができる。 </li><li>免疫組織学的染色のために、固定し、パラフィン浸潤組織切片は、抗体が認識し、その特定のエピトープに結合することができるように、抗原回復を受けなければならない。したがって、脱パラフィンし、再水和したスライドを20分間加熱し、クエン酸緩衝液（pH6.0）で蒸気調理器内に配置される。 </li><li>染色溶液のための必要量を最小限にするPAPペンで洗浄緩衝液（0.5 M TBS緩衝液+ 0.5％ツイーン）と円スライスへの転送を摺動する。 </li><li>水分室でスライドを置きます。抗原 - 抗体結合の特異的西洋ワサビペルオキシダーゼ媒介性の可視化を確保するために、内因性ペルオキシダーゼを3％過酸化水素で飽和されなければならない。 </li><li>原発antibODY希釈は、スライスに適用RTで1時間インキュベートし、注意深く洗浄緩衝液で洗い流す。 </li><li>特定の抗原抗体バインディングの検出用超視覚Quanto検知システム、HRP、DAB（サーモサイエンティフィック）が推奨プロトコルに従って使用されている。 </li><li>核を、1分間ヘマトキシリン​​で対比されている。 </li><li>スライドは、水性媒体を搭載し、乾燥し、逆顕微鏡を用いて撮像される。 </li></ol>

<ol><li>Schenke-Layland, K., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+human+tissue+models--moving+towards+personalized+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">In vitro human tissue models--moving towards personalized regenerative medicine.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 63, 195-196 (2011).</li>
<li>Pusch, J., Votteler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiological+performance+of+a+three-dimensional+model+that+mimics+the+microenvironment+of+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The physiological performance of a three-dimensional model that mimics the microenvironment of the small intestine.</a> Biomaterials. 32, 7469-7478 (2011).</li>
<li>Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularised+human+tissue+models%3A+a+new+approach+for+the+refinement+of+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research.</a> J. Biotechnol. 148, 56-63 (2010).</li>
<li>Lanza, R., Langer, R., Vacanti, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLanza%2C+R+%22Principles+of+tissue+engineering%22">Principles of tissue engineering</a>. , 3rd, Elsevier Academic Press. Burlington, MA. (2007).</li>
<li>Barron, V., Lyons, E., Stenson-Cox, C., McHugh, P. E., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreactors+for+cardiovascular+cell+and+tissue+growth%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Bioreactors for cardiovascular cell and tissue growth: a review.</a> Ann. Biomed. Eng. 31, 1017-1030 (2003).</li>
<li>Martin, I., Wendt, D., Heberer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+bioreactors+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The role of bioreactors in tissue engineering.</a> Trends Biotechnol. 22, 80-86 (2004).</li>
<li>Mertsching, H., Walles, T., Hofmann, M., Schanz, J., Knapp, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+vascularized+scaffold+for+artificial+tissue+and+organ+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Engineering of a vascularized scaffold for artificial tissue and organ generation.</a> Biomaterials. 26, 6610-6617 (2005).</li>
<li>Linke, K., Schanz, J., Hansmann, J., Walles, T., Brunner, H., Mertsching, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+liver-like+tissue+on+a+capillarized+matrix+for+applied+research%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineered liver-like tissue on a capillarized matrix for applied research.</a> Tissue Eng. 13, 2699-2707 (2007).</li>
<li>Holtkamp, N., Atallah, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP-13+and+p53+in+the+progression+of+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">MMP-13 and p53 in the progression of malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Neoplasia. 9, 671-677 (2007).</li>
<li>Weaver, V. M., Petersen, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li>
<li>Hutmacher, D. W., Horch, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+tissue+engineering+technology+platforms+into+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Translating tissue engineering technology platforms into cancer research.</a> J. Cell. Mol. Med. 13, 1417-1427 (2009).</li>
<li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li>
<li>Yang, S. -T., Zhang, X., Wen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbioreactors+for+high-throughput+cytotoxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Drug+Discov.+Devel%22%5BJournal%5D)">Microbioreactors for high-throughput cytotoxicity assays.</a> Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 11, 111-127 (2008).</li>
<li>Schultheiss, D., Gabouev, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+vascularized+matrix+for+bladder+tissue+engineering%3A+matrix+preparation%2C+reseeding+technique+and+short-term+implantation+in+a+porcine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Biological vascularized matrix for bladder tissue engineering: matrix preparation, reseeding technique and short-term implantation in a porcine model.</a> J. Urol. 173, 276-280 (2005).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

<html>腫瘍研究における2Dおよび3D培養系を比較すると、3Dシステムは、より高価なアプローチであるにもかかわらず、良好な生物学的微小環境における条件を模倣することが証明されている。これは、いくつかの腫瘍細胞は、腫瘍内の実際の状況に応じた一般的な2D培養12日よりも3D培養においてはるかに遅く成長することを示すことができた。ビッセルらは発癌性乳癌細胞の挙動をより正確にマトリックス内の3D培養が細胞-ECM相互作用を提供するとき、細胞形態およびシグナル伝達などのin vivoでの状況を反映していることを自分の仕事にあった。さらに、それらは、環境の相互作用の変化が正常な表現型に悪性細胞の復帰につながっていることを実証することによって、3Dで細胞外環境の重要性を強調した。さらに、最も重要なことは、これらの結果はまた、10,11 インビボ動物モデルにおいて確認することができた。 ontent &quot;&gt; in vivo動物実験およびインビトロでの組織モデルでの直接比較は、両方のシステムに利点と欠点を明らかにしている。in vitroモデルの一つの利点は、はるかに優れたリアルタイムまたは顕微鏡による固定撮像の許可である。制限があるそれらは、免疫応答をホスト、 インビボ系しばしば進行のに対し、血管系および小分子の正常な輸送の現在の不足を静的または短期的条件を模倣、及び他の細胞-細胞相互作用は、in vitroモデル12のさらなる欠点であるため、3Dを本研究で提示されvitro系で動物実験に有望な追加を提供しています。彼らは、人間の生物に良い比較を提供するため、実験的な誤解を最小限に抑える。バイオミメティックvivoモデル系では、それゆえ癌および転移性の広がりに依存するどのように勉強し、より関連性の高いとなりますtumorigを規制する微小環境条件にenesis 11。 我々の研究は、SIS-MUCによって提供される3D環境は、共通の2D細胞培養では観察されない複数の腫瘍細胞の様組織の形成、（ 図3Aを参照）をもたらすことを示している。また、腫瘍生検由来の初代細胞の使用は、個別化医療、患者の個々のニーズに応じて、最善の治療を特定することを目的と規律に向けた非常に重要なステップです。生検材料から単離された一次患者特有の腫瘍細胞を組み込むことは、治療戦略のインビトロ試験において可能にする。そのような試験システムにより、時間とコスト削減ハイスループットスクリーニングにおけるその異なる薬剤との組み合わせを調査することであろう。さらに、この研究で示されるように、腫瘍関連間質細胞の集積は、腫瘍の微小環境に影響を与える腫瘍進行13は 、パーソナライズされたアプローチのために重要であると証明するかもしれないようSUITABル·治療標的。 代替的にパーソナライズされたアプローチには、我々の腫瘍モデルを確立し、腫瘍形成性細胞株の取り込みによって一般化された腫瘍試験システムとして機能するように修飾することができる。これは、基本的な研究目的のための有望な適応したものです。薬物検査の両方のために血管構造の存在が治療物質の分布および取り込みをテストするために必要とされて近づく。 SIS-MUC行列がバリア取り込み研究のために、一次MVECと側底播種を可能にする、BioVaScの保存の血管構造の再シードはさらに、薬物送達の研究を改善します。 組織モデルを作成するために、3次元生分解性マトリックスは、異なる細胞型14の共培養のためのフレームワークとして使用することができる。このような3次元マトリックスの使用は、多くの場合、機能的血管新生が存在しないことによって制限される。この問題は、保存血管strを提供BioVaScの使用によって解決することができるuctures、その内皮細胞で再播種することができる。さらに、BioVaScは、細胞の接着性を確保し、組織の分化を促進する細胞外成分を提供する。また、バイオ人工3D組織7,8,15の長年の組織特異的機能を可能にします。機能的血管代替物のエンジニアリングのための前提条件は、人間の生理的および生体力学的条件の模倣である。従って、 インビトロでこれらの要件を実現することができるバイオリアクターシステムは、生物学的な腫瘍モデルを作成するための極端な関心がある。 BioVaScの組み合わせは、バイオリアクター技術および異なる細胞型の共培養は、例えば血管新生および転移などの癌の進行に関連するメカニズムの研究を可能にする血管新生した腫瘍組織を生成するための非常に有望な方法である。我々は同等を提供することで、動物実験を補完するための有望なアプローチとして、腫瘍モデルを見るヒト腫瘍生理機能。

新薬は、その品質、安全性、市場の承認の前に有効性に関して検証する必要があります。現在までに、動物実験は、薬物テストと検証のための標準的な方法である。しかし、種特異的な違いのために、動物実験では、多くの場合、総合的に、人間1の化合物の効果を評価しない。このため、新たな薬剤および物質のin vitro試験のために使用することができるヒト組織モデルを生成することが重要である。 私たちのグループの焦点の一つは、私たちの生物学的に血管新生足場（BioVaSc）2,3 を用いたin vitro試験モデルを作成することです。 BioVaScは、静的または動的3Dマトリックス系として使用することができる。静置培養のために、脱細胞化ブタ空腸のセグメント（小腸粘膜下組織SIS-MUC）は、細胞の再シードに金属インサートに配置されます。例えば、癌細胞および内皮細胞のような種々の細胞は、足場上で培養することができる。 <pダイナミックな文化のためのクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;、BioVaScは血管系全体または足場の表面を横切って流れを適用するバイオリアクターシステムに取り付けられている。現在のバイオリアクターは、細胞4の分化や増殖に作用する、生物学的、機械的、または電気的刺激を実施する。組織工学の分野におけるバイオリアクターについては、基本的なコンセプトは、人体内の条件をシミュレートすることである。ここで、細胞は、それらが互いにおよびその周囲の細胞外マトリックスと相互作用することができる自然環境が提供される。 インビトロ試験系または移植片の製造のために、適切なキャリア構造およびバイオリアクターシステムを用いて細胞の自然環境を模倣する能力は重要で5である。そのため、より複雑で技術的に要求のデバイスは、これらのタスク6を満たすために開発されなければならない。 それはestablすぐ足場を使用することも可能である原因栄養動脈、静脈、および接続毛細血管床を含む保存管状構造への血管化モデルのishment。すべてのブタ細胞は、化学的、機械的および酵素的脱細胞、および足場ガンマ線滅菌によって除去する必要がある。復元された管状の血管構造は、その後、例えば、pH、温度、圧力、栄養供給と廃棄物除去6と生体力学的および/ ​​または生化学的パラメータを模倣する再循環灌流バイオリアクター7を用いて、ヒト微小血管内皮細胞で再播種することができる。管状構造の再内皮化は、コラーゲン性足場3,7内で、人間の血管と同等に作成されます。次のステップでは、前者の管腔（粘膜）の表面には、共培養3,7,8を確立するために、初代ヒト細胞を接種することができます。 本研究では、3D腫瘍テストシステムは、原発STと腫瘍細胞株を共培養することで設定されているSIS-MUC上の静的および動的条件下romal細胞。

<table><tbody><tr><td>コラゲナーゼ溶液</td><td>SERVA</td><td>17454</td><td>(500 U/ml)</td></tr><tr><td>ディスパーゼ溶液</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>(2.0 U/ml)</td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース</td><td>PAA</td><td>G0001,3010</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>ROCHE</td><td>10104159001</td><td>200 mg を 500 ml PBS+ + 1% PenStrep</td></tr><tr><td>DZ solution</td><td>Roth</td><td>3484.2</td><td>34 g ナトリウムに溶解デソキシキレート、1 L入り 超純水</td></tr><tr><td>FCS</td><td>LONZA</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP</td><td>DCS</td><td>PD000KIT</td><td></td></tr><tr><td>医療用圧力トランスデューサ</td><td>MEMSCAP</td><td>SP844</td><td></td></tr><tr><td>モノクローナルマウス 反ヒト フォン・ヴィレブランド 因子</td><td>DAKO Cytomation</td><td>M0616</td><td>クローン F8/86 0.12 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>マウスモノクローナル抗ヒトp53</td><td>DAKOサイトメーション</td><td>IS616</td>クローン<td>DO-7 すぐに使える</td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌使い捨てドーム</td><td>MEMSCAP</td><td>844-28</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン/EDTA溶液</td><td>PAA</td><td>L11-003</td><td>0,05%</td></tr><tr><td>VascuLife (VEGF-MV)</td><td>Lifeline</td><td>LL-0003</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>ギブコ</td><td>15040-033</td><td></td></tr></tbody></table>

人間の3次元の組織工学<em&gt; in vitroで</em&gt;腫瘍テストシステム

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

がんは、世界中の主要な死亡原因の一つである。現在の治療戦略は、主に不十分なin vivoでの生理的条件を反映した2次元培養系で開発されています。生物学的な3Dマトリックスは、組織の組織および細胞分化の研究を可能にする、細胞に細胞が自己組織化することができる環境を提供する。そのような足場は、直接3D細胞 - 細胞相互作用を研究するために、異なる細胞型の混合物を用いて播種することができる。癌腫瘍の3次元の複雑さを模倣するために、我々のグループは、3D in vitroでの腫瘍のテストシステムを開発しました。 我々の3D組織検査システムモデル我々は、生物学的に血管新生足場（BioVaSc）由来の我々の脱細胞化ブタの空腸セグメントとの間で確立悪性末梢神経鞘腫瘍（MPNSTs） のin vivoの状況。我々のモデルでは、初代線維芽細胞、微小血管内皮細胞（BioVaScで修飾マトリックスを再播種低継代数のMVEC）およびS462の腫瘍細胞株。静置培養のために、BioVaScの血管構造が除去され、残りの足場は1辺（小腸粘膜下組織SIS-MUC）に切り開かれている。得られたマトリックスは、2つの金属リング（セル冠）との間に固定されている。 別のオプションは、せん断応力に細胞を公開するフローバイオリアクターシステムで培養するために細胞を播種し、SIS-MUCです。ここで、バイオリアクターは、自己構築インキュベーター内蠕動ポンプに接続されている。コンピュータは、例えば、血圧、温度、流量などのパラメータを介して、動脈酸素および栄養の供給を調節する。このセットアップでは、圧力調整拍動または一定流量のいずれかで、動的な文化が可能になります。 本研究では、成功しMPNSTsのための静的および動的な3次元培養システムの両方を確立することができる。より自然な3D環境内癌腫瘍をモデル化する機能を発見、テスト、および検証を可能にします人間のようなモデルでは、将来の医薬品。

図1Bに示すように、我々は毛細血管網の保存管状構造で（長さ及び直径20mmで、約2メートル）ブタの空腸セグメントを脱細胞。化学的、酵素的および機械的な脱細胞化の後、我々は3次元細胞培養に使用することができ、コラーゲンI / III足場を得る。フォイルゲン試験は、マトリックスの純度（無DNAレムナント）（データは示していない）を実証するために実施した。 図2Aおよび2Bは、細胞の冠で固定さSIS-MUCの静置培養を示しています。我々は、動的培養のために、社内に設計されたバイオリアクター（ 図2C）にSIS-MUCを修正しました。 図2Dは ​​、バイオリアクターのチャンバーを通してシミュレートされた動的な流れを示している。バイオリアクターは、自己構築さインキュベーターシステムに入れ、蠕動ポンプに接続されている。このセットアップでは、圧力調整拍動流またはCのいずれかで、動的な文化を可能にする<html> onstant流れ。 図3は、2D単一栽培（ 図3A）および三次元共培養（ 図3B-3D）での静置培養S462の腫瘍細胞株の概要について説明します。 図3Bは、SISの頂端側に腫瘍細胞S462および一次線維芽細胞のトリプル文化を示しています-MUC（旧内部ルーメン側）と側底側のMVEC（旧漿膜側）。異なる細胞型の同定は、MVEC（ 図3C）を標識するために、例えばフォン·ヴィレブランド因子のような細胞型特異的マーカーを染色することによって可能である。 p53の陽性S462細胞は、p53陰性初代線維芽細胞（ 図3D）から区別することができ、細胞の3次元分布を分析することができる。動的培養三重培養の図3を図4染色同等の図 。 <html> 0460/50460fig1.jpg &quot;/&gt; 図1。脱細胞化のセットアップ。 （A）パソコンで監視BioVaScを脱細胞化するためのバイオリアクター、ポンプセットアップ、（B）脱細胞化BioVaScガラスタンク内。内腔および動脈入口アダプタに接続されている。 。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig2.jpg" /> 図2。異なる培養なセットアップのビュー上に。フローバイオリアクターの上蓋の動的培養のための静置培養のためのマイクロタイターウェルプレート、（B）の金属インサートの静的培養系の（A）のCAD断面図、（C）の媒体流シミュレーション（速度場[M /秒]） 、（D）は蠕動ポンプに接続し、動的培養のためのフローバイオリアクター。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig2large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> ENT &quot;FO：キープtogether.withinページを=&quot;常に &quot;&gt; <img alt="図3" fo:content-src="/files/ftp_upload/50460fig3highres.jpg" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig3.jpg" /> 図3。静的な3D腫瘍モデルの免疫組織学的特性化の概要。パーマスライド上のS462細胞の静置培養2Dモノ文化の（A）ヘマ ​​トキシリン染色、静置培養3Dトリプル文化の（B）、H＆E染色、矢印は、フォンヴィレブランド因子（C）免疫組織染色、（D内皮細胞をマークp53のための）免疫組織染色。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig3large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> <img alt="図4" fo:content-src="/files/ftp_upload/50460fig4highres.jpg" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig4.jpg" /> <st栄&gt;図4。ダイナミックな3D腫瘍モデルの免疫組織学的特性化の概要。 （A）を動的に培養された3Dのトリプル文化のH＆E染色、矢印は内皮細胞、（B）をマークし、フォンヴィレブランド因子に対する免疫組織染色、p53のための（C）の免疫組織染色。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig4large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a>

試験系として、ヒトの3D腫瘍組織を作成するための方法が記載されている。これらの技術は、脱細胞化生体血管柄足場（BioVaSc）、初代ヒト細胞およびフローバイオリアクターにおける動的条件下で、ならびに、静的条件下で培養することができる腫瘍細胞株に基づいている。

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

本手順の全体的な目的は、脱細胞化された生物学的スキャフォールド上に初代細胞を用いて、3D腫瘍試験システムを構築することである。これは、まず、ブタのalセグメントに脱細胞化溶液をポンプ注入する脱細胞化プロセスを用いてスキャフォールドを調製し、次に、標準的な分離プロトコルを用いて患者の生検試料からヒト初代細胞を分離することによって達成される。次に、管状の小腸粘膜下層を片側から切り開き、2つの金属リングの間に固定し、規定の細胞密度で腫瘍細胞と関連間質細胞を播種して、腫瘍試験システムを構築します。最後のステップは、細胞を導入した構築物を、静的または動的な条件下で適切なセットアップにて培養することです。最終的に、免疫組織化学顕微鏡を用いて腫瘍成長の特性を評価します。TT腫瘍試験システムなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、一般的な2Dモデルよりも正確に腫瘍のin vivo条件をシミュレートした3D組織モデルを作成できることです。ダイナミック培養の利点は、細胞特有の特性が維持されることです。本手法は、3D環境においてがん細胞がどのように細胞間および細胞-マトリックス間の相互作用を形成するかといった、腫瘍生物学分野における重要な疑問への回答に寄与し、腫瘍の進展や転移などのがん関連プロセスの解明に役立ちます。この腫瘍試験システムで使用される生物学的血管化スキャホールド（biova）は、ブタの空腸セグメントから作製されています。カニュレートした動脈アクセスを介して、ブタの空腸セグメントの血管系および腸管腔をPBSで洗浄してください。完全にきれいになるまでこれを繰り返します。4つのアダプターを備えた直径200 mmのガラス水槽を用意し、シリコンチューブを介してペリスタルティックポンプに接続します。圧力制御ユニットは、滅菌使い捨てドームに接続された圧力センサーを通じて監視することが可能です。リザーバーボトルに脱細胞化溶液またはDZ溶液を満たします。チューブシステムに気泡が混入していないか確認します。腸管腔をケーブルタイでガラスコネクターに接続し、腔内フローを確保します。血管システムの赤色動脈アクセスからDZ溶液500 millilitersをポンプで注入します。15分ごとにポンプ操作を短時間中断し、腸管腔内を完全に手動で圧搾してください。脱細胞化プロセス中は、緩衝液の圧力を監視することが重要です。圧力は、自然な血圧を模して 80 to 100 mmHg に維持してください。細胞の残渣がなくなり、血管構造が完全に白色になるまで、PBSでバイオバ（biova）を洗浄します。まず、メスを用いて皮膚生検組織を幅2～3 mmの帯状に切り、PBS溶液で3回すすぎます。組織をdisbe溶液でインキュベートした後、2本のピンセットを使用して表皮を真皮から分離します。一次真皮微小血管内皮細胞（MV eecs）を分離するため、それぞれをPBSを満たしたペトリ皿に個別に移します。真皮ストリップを酵素で1回リンスし、EDTA溶液10 millilitersを真皮ストリップに加え、37 °Cで40分間インキュベートします。1% FCSで酵素反応を停止させ、皮膚ストリップをVascu Lifeを満たしたペトリ皿に移します。メスで各ストリップの両面を8回ずつ、少し圧力をかけながら掻き出し、細胞懸濁液を作成します。続いて、細胞懸濁液を遠心分離し、細胞ペレットをvascu lifeで再懸濁します。線維芽細胞を単離するために、まずメスを用いて真皮ストリップを細かく刻みます。真皮片をFalconチューブに移し、37 °Cで45分間インキュベートしたコラゲナーゼ溶液10 millilitersを加えます。次に、溶液を遠心分離し、上清を注意深く取り除きます。ペレットをDMEM、10% FCS、1% pen strepを含む溶液で洗浄します。遠心分離後、上清を注意深く取り除き、ペレットを培地で再懸濁させてからT 75培養フラスコに移し、静置条件下で培養して組織から細胞を増殖させます。腫瘍試験系の構築にあたり、まず管状の小腸粘膜下層（SIS muc）を切断して片側を開き、2つの金属リングで固定します。こうして作製したセルクラウンの直径は10 mmとなります。SISメンブレンを細胞培養液で一晩浸し、翌日に一次培養したMVE CSをSISの基底面（元のCI側）に播種します。37°C、5% carbon dioxideの条件下で3時間インキュベートします。3時間後、ウェルに培地を満たして浸漬培養とし、インキュベーターに戻します。内皮細胞を3日間接着させます。静置培養システムを180度回転させ、12ウェルプレートに移します。次に、SISの頂端表面（元々のルーメン側）に、初代皮膚線維芽細胞と腫瘍細胞の混合液を確認します。細胞を3時間静置して接着させます。ウェルに培地を満たして培養物を浸し、静止条件下、37°C、5% 二酸化炭素でさらに14日間、腫瘍試験システムを培養します。動的培養の場合は、2〜3日ごとに培養液を交換してください。SISを2つの金属リングの間に固定し、前述の方法に従って初代MV eecsを播種します。3日後、SIS muを金属リングから取り外し、シリンジとカニューラを用いてメンブレンをフローリアクターに挿入します。バイオリアクター内のマトリックス上に、初代真皮線維芽細胞と腫瘍細胞を播種します。細胞を3時間静置して接着させた後、翌日にバイオリアクターシステムを培地で満たし、自作のインキュベーターシステムにバイオリアクターを設置して、ペリスタティックポンプに接続します。このセットアップにより、圧力調節された拍動流または定常流による動的培養が可能です。本実験では、3.8 milliliters per minuteの一定の培地流量を用います。動的培養を14日間維持し、7日目に培養液を交換してください。実験の完了後、組織を固定し、パラフィン包埋および染色を行い、倒立顕微鏡を用いて撮影します。ここに代表的な結果を示します。パネルAは、ヘマトキシリンで染色した2D単一培養におけるS 4 62腫瘍細胞株の静的培養の概要を示しています。3D共培養の様子をパネルB、C、およびDに示します。このH&amp;E染色画像は、SISの頂端側に腫瘍細胞S 4 62と初代線維芽細胞、基底外側側にMVECを配置した三重培養を示しています。基底外側において、矢印は内皮細胞を示しています。パネルCに示されるMVECのラベル付けのためのvon Willebrand factorや、パネルDに示されるP 53など、細胞型特異的マーカーを染色することで、異なる細胞型を識別できます。P 53陽性のS 4 62細胞はP 53陰性の初代線維芽細胞と区別でき、同様の方法で細胞の3D分布を解析することが可能です。動的に培養されたトリプルカルチャーにおいて、異なる細胞型を識別できます。パネルAはH&amp;E染色画像であり、矢印は血管内皮細胞を示しています。パネルBはフォン・ヴィレブランド因子（von Willebrand factor）の免疫組織化学的染色を示し、パネルCはP 53の染色を示しています。この手順に続き、新しいがん治療法の探索や、腫瘍形成における重要なシグナル伝達経路の解析など、追加の課題に応えるために薬物テストなどの他の手法を実施することが可能です。また、初代細胞を用いることで、個々の患者に最適なパーソナライズされた治療法を定義することが可能です。

tissue-engineering-of-a-human-3d-in-vitro-tumor-test-system

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

この動画では、3次元ヒトバイオゲルを用いて患者由来の腫瘍細胞から微小腫瘍を作製しています。これらの微小腫瘍は、in...

微小腫瘍の生成:薬物治療に対する反応を解析するための3D微小腫瘍を培養するIn vitro培養技術

周囲の正常組織への浸潤は、悪性腫瘍の決定的な特徴です。ここでは、進行したヒトがんの多くのモデルで例示されている天然の3Dバイオマトリックスへの浸潤のシンプルな半自動マイクロプレートアッセイを提供します。...

三次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

この原稿は、生産、特性評価および正常な初代ヒト食道線維芽細胞および脱細胞化ブタの足場内に播種した扁平上皮細胞から調製した組織工学3D食道構造物の潜在的な用途を説明しています。結果は、正常なヒトの食道に似成熟重層上皮の形成を実証します。...

生産、特性評価および3D組織工学ヒト食道粘膜モデルの使用可能性

私たちは、非小細胞肺がん(NSCLC)標的治療に対する感度を研究するために、生物学的コラーゲン足場に基づく3次元(3D)肺がんモデルを提示します。増殖指数、アポトーシス、および上皮間葉転換(EMT)の状態を決定するためのさまざまな読み出し技術を示します。収集されたデータは、薬物感受性の予測のためにin...

操作された複合三次元組織<em&gt;インビトロ</em&gt; /<em&gt;インシリコ</em具体的な突然変異背景に薬物の有効性を予測するための&gt;肺腫瘍モデル

患者由来の多形性膠芽腫の異種移植片は、3Dヒトバイオゲル培養システムを使用して生きた微小腫瘍に小型化することができます。このin vivo様3D腫瘍アッセイは、薬物反応試験やキノミクス解析を含む分子プロファイリングに適しています。...

Kinomicプロファイリングと薬物反応検査のための3D人間バイオゲル培養システムと患者由来の神経膠芽腫細胞を用いた微小腫瘍の発生

私たちは、腫瘍微小環境（TME）を模倣するために透過性の微多孔質膜インサートを適応させました。このモデルは混合細胞培養で構成されており、蛍光標識や細胞選別を使用せずに、高度に濃縮された個々の細胞集団の簡易な生成を可能にし、正常またはストレス条件下でTME内の細胞間コミュニケーションを研究することができます。...

濃縮細胞集団を生成し、細胞間コミュニケーションを調べるための簡単​​な方法：腫瘍微小環境のミミック

本論文では、三次元(3D)胸腺培養系により腫瘍抗原特異的誘導多能性幹細胞由来の甲状腺系(iTE)を生成する新しい方法について説明する。iTEは、増殖、記憶形成、腫瘍抑制の能力を有するナイーブT細胞と密接に関連するT細胞の均質なサブセットである。...

マウス誘導多能性幹細胞由来腫瘍抗原特異的胸腺移民を生成する三次元胸腺培養システム

腫瘍の微小環境は、がんの成長と侵攻の不可欠な部分です。癌腫の進行を模倣するためには、生物学的に関連したヒトマトリックスが必要である。このプロトコルは、ヒト平滑筋腫ベースのマトリックスを適用することによって in vitro...

三次元スフェロイド浸潤アッセイにおける完全ヒト腫瘍ベースマトリクス

このプロトコルの目的は、多細胞スフェロイドとして乳房上皮細胞を、薬物スクリーニング研究に使用できる3D乳房内皮共培養モデルを迅速に作成するために、多細胞性スフェロイドとして直接バイオプリントすることです。...

内皮ネットワーク上の3D多細胞乳房スフェロイドの直接バイオプリンティング

このアッセイは、3Dコラーゲンゲルで培養した胚様体に分化したマウス胚性幹細胞を利用して、 in...

インビトロ 血管疾患モデリングおよび薬物検査のためのマウス胚性幹細胞を用いた血管新生の三次元発芽アッセイ

このプロトコルは、ハイスループットの基礎およびトランスレーショナルヒトがん研究を実行し、薬物スクリーニング、疾患モデリング、および個別化医療アプローチを進歩させるための生理学的に関連性のある腫瘍オンチップモデルを提示し、ローディング、メンテナンス、および評価手順を説明します。...

がん研究のための生理学的ヒト血管新生微小腫瘍モデルの確立

学ぶ脱細胞化バイオスカフォールドを用いた3次元腫瘍テストシステムの構築法。原代人細胞を用いてin vivo環境を模擬し、腫瘍進行や転移の研究に貢献する革新的な組織工学アプローチを探索する。

人間の3次元の組織工学

さらに動画を探す