人間の3次元の組織工学 in vitroで腫瘍テストシステム

この手順の全体的な目標は、脱細胞化した生物学的足場上に初代細胞を用いた3D腫瘍検査システムを構築することです。これは、最初に、ブタのalセグメントに脱細胞化溶液をポンプで送る脱細胞化プロセスを使用して足場を準備することによって達成されます。2番目のステップは、標準的な分離プロトコルを使用して、患者の生検から初代ヒト細胞を単離することです。

次に、管状の小腸粘膜下組織を片側に開いて切断し、2つの金属リングの間に固定し、腫瘍細胞と関連する間質細胞を所定の細胞密度で播種することにより、腫瘍検査システムを設定します。最後のステップは、静的または動的条件下で適切なセットアップで細胞負荷コンストラクトを培養することです。最終的に、免疫組織化学顕微鏡法を使用して腫瘍増殖の特性を評価します。

TT腫瘍検査システムのような既存の方法と比較した場合、この手法の主な利点は、この方法を使用すると、一般的な2Dモデルよりも正確に腫瘍のin vivo条件をシミュレートする3D組織モデルを作成できることです。動的培養の利点は、細胞特異的な特性が維持されることである。この方法は、がん細胞が3D環境で細胞細胞や細胞マトリックスの相互作用をどのように形成するかなど、腫瘍生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ち、腫瘍の進行や転移などのがん関連プロセスの解明に役立ちます。

この腫瘍検査システムで使用される生物学的血管新生足場またはバイオバは、ブタのジャールセグメントに由来します。ブタの血管系と腸管腔をカニューレ挿入された動脈アクセスを介してPBSですすいでください。完全にきれいになるまで繰り返します。

直径200mmのガラスタンクに4つのアダプターを用意し、シリコンチューブを介してペリスタルティックポンプに接続します。圧力制御ユニットは、滅菌済みの使い捨てドームに接続された圧力センサーを介して監視できます。リザーバーボトルに脱細胞化またはDZ溶液を充填します。

チューブシステムに気泡がないか確認してください。腸内腔をケーブルタイでガラスコネクタに接続し、光流を確保します。500ミリリットルのDZ溶液を血管系の赤い動脈アクセスに送り込みます。

15分ごとにポンピングプロセスを中断して、腸内腔全体を手動で押し出します。脱細胞化プロセス中に緩衝液の圧力を監視することが重要です。圧力は、自然血圧をモデルにした 80 から 100 ミリメートルの水銀柱である必要があります。

バイオバに細胞の残骸がなくなり、血管構造が完全に白くなるまで、バイオバをPBSで洗浄します。この手順は、メスで皮膚生検を幅2〜3ミリメートルのストリップに切断し、PBS溶液で3回すすぐことから始めます。組織をdisbe溶液でインキュベートした後、2本のピンセットを使用して表皮を真皮から分離します。

PBSで満たされたペトリ皿に両方を別々に移して、一次真皮微小血管内皮細胞またはMV eecsは、真皮ストリップにEDTA溶液で10ミリリットルのトリップを追加し、真皮ストリップに37°Cで40分間インキュベートします。1%FCSで酵素反応を止め、スキンストリップをvascuの生命で満たされたシャーレに移します。メスで各ストリップを両側に8回引っ掻き出し、少し圧力を加えて細胞懸濁液を生成します。

続いて細胞懸濁液を遠心分離し、蘇生し、血管寿命で細胞ペレットを懸濁します。線維芽細胞を単離するため。まず、メスを使って真皮ストリップを細かく刻みます。

真皮片をFalconチューブに移し、摂氏37度で45分間インキュベートした10ミリリットルのコラゲナーゼ溶液を加えます。次に、溶液を遠心分離し、上清を慎重に取り除きます。DMEMと10%FCSと1%ペン溶連菌でペレットを洗浄します。

遠心分離後、上清を慎重に除去し、ペレットを培地に再懸濁し、T 75培養フラスコに移して、静的条件下で組織から細胞が増殖できるようにします。腫瘍検査システムを設定するには、まず、管状の小腸粘膜下組織またはSIS粘膜を切断し、片側を開いて2つの金属リングの間に固定します。これらの自己構築セルクラウンの直径は10ミリメートルです。

翌日、SIS muを細胞培養培地で一晩覆い、一次MVE CSをSISの基底後の表面に播種し、前者はCI.摂氏37度、二酸化炭素5%で3時間インキュベートします。3時間後、ウェルに培地を充填して、培養物を水中に確保し、インキュベーターに戻します。内皮細胞を3日後に3日間接着させます。

静的培養システムを180度反転させ、12ウェルプレートに移します。次に、SISの頂端表面に初代真皮線維芽細胞と腫瘍細胞の混合物を観察します。以前のルーメンの側面。

細胞を3時間接着させます。培養培養物、37°C、さらに14日間5%二酸化炭素の静的条件下で腫瘍試験システムを浸すために培地をウェルに充填し、動的培養のために2〜3日ごとに培養培地を交換します。2 つの金属リングの間に SIS mu を固定し、前に示したようにプライマリ MV eecs をシードします。

3日後、金属リングからSIS muを取り出し、シリンジとカニューレでメンブレンをフローリアクターに挿入します。一次真皮線維芽細胞と腫瘍細胞をバイオリアクターのマトリックスに塗布します。細胞を3時間接着させてから、翌日にバイオリアクターシステムに培養培地を充填し、バイオリアクターを自作のインキュベーターシステムに入れ、蠕動ポンプに接続します。

このセットアップにより、圧力調整された拍動性の流れまたは一定の流れのいずれかで動的培養が可能になります。この実験では、毎分3.8ミリリットルの一定の媒体流量が使用されます。動的培養を14日間保持し、7日後に培地を変更します。

実験終了後、組織を固定、パラフィン、包埋、染色した後、逆顕微鏡でイメージングします。代表的な結果をこちらに示します。パネルAは、ヘマットトリンで染色した2D単培養における静的培養されたS4 62腫瘍細胞株の概要を示しています。

このHおよびe染色画像は、SIS MUおよびMVECの頂端側における腫瘍細胞S 4 62および初代線維芽細胞の三重培養を示しています。基底の外側では、矢印が内皮細胞を示しています。パネルCに示されているMVECを標識するフォン・ヴィレブランド因子やパネルDに示されているP 53などの細胞型特異的マーカーを染色することにより、異なる細胞型を同定することができ、P53陽性のS4 62細胞はP53陰性の初代線維芽細胞と区別することができ、細胞の3D分布も同様に分析することができる。

動的培養されたトリプルカルチャーパネルAは、矢印が内皮細胞を示すHおよびE染色画像で、異なる細胞型を識別することができる。パネルBはvon Willebrand因子の免疫組織学的染色を示し、パネルCはこの手順後のP 53の染色を示しています。新しいがん治療法を見つける方法や、腫瘍形成における重要なシグナル伝達経路の分析など、追加の質問に答えるために、薬物検査などの他の方法を実行できます。

また、初代細胞を使用して、個々の患者に最適な個別化治療を定義することができます。