Name: 電気生理学および高分解能二光子顕微鏡用マウス前庭感覚上皮の切り抜き半無傷準備 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: 学ぶマウス前庭感覚上皮の半無傷準備法。パッチクランプ電気生理学と高分解能二光子顕微鏡を用いて、前庭毛細胞の膜特性とカルシウムシグナリングを解析する生理学的条件を維持した手法です。

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この仕事のための資金は、R.リムとAJキャンプにガーネットパッシーとロドニーウィリアムズ記念財団プロジェクトの助成金によって提供されていました。

1。動物<ol><li>マウスは、オーストラリアの齧歯類センター（ARC、パース、オーストラリア）から入手し、環境エンリッチメントとノーマルの12時間の明/暗サイクルでシドニーボッシュ動物施設の大学で開催された。記載されたすべての実験は、シドニーの動物倫理委員会の大学によって承認された。 </li><li>この菌株は一般に遺伝子操作の背景として使用され、 野生型 8-9と同等とみなすことができるので、雄と雌のマウス（C57/BL6）は、すべての実験に使用した。 </li></ol> 2。組織標本<ol><li> 26のNaHCO 3、11グルコース、250グリセロール、2.5のKCl、1.2のNaH 2 PO 4、1.2のMgCl 2、及び2.5のCaCl 2から成るグリセロールベースの人工脳脊髄液（ACSF）（単位：mm）300mlのを準備します。 CaCl 2を添加する前に、ガスカーボゲン（95％O 2および5％CO 2）を含む溶液は、APを確立する7.4のHとカルシウム沈殿（曇り）を回避。氷スラリーが形成されるように、45分間-80℃の冷凍庫内の溶液を凍結。 </li><li>深く腹腔内注射を介して、ケタミン（100 mg / kg）を（パーネル、アレクサンドリア、オーストラリア）をマウスにanaesthetize。 </li><li>一度後肢ピンチ反射が鋭いステンレス製のハサミを使用して不在首マウスであり、頭蓋骨を露出するためにカミソリの刃を（＃22を四捨五入）を使用して、矢状皮膚切開を行います。この時点で、2.3から2.8までと手順を通して頭蓋、脳、および基礎となる前庭装置は、組織上の氷冷ACSFの定期的なアプリケーションで、できるだけクールに保つ必要があります。 </li><li>標準パターンのはさみの尖った腕（FST、ノースバンクーバー、カナダ）を使用するとラムダで頭蓋骨に小さな切開をし、矢状縫合に沿ってカット。脳は、このステップの間にせん断刃で &quot;ドラッグ&quot;されていないことを確認してください。 </li><li>慎重に横方向に離れて頭頂骨と後頭骨posterioピールRLY浅い屈曲ピアソン骨鉗子（FST）を用いて。 </li><li>小さなステンレス鋼へらがゆっくり真ん中と後頭蓋窩の表面から脳を持ち上げるために使用され、公開されるvestibulocochlea神経（CNVIII）内耳と細かい虹彩はさみのペアで脳幹の中間をカット。この神経を切断すると、有毛細胞を使用して、プライマリ求心性とその接続の軸索上の過度の緊張を最小限に抑えることができます。 </li><li> CN VIIIの離断の後脳トトで除去される。 </li><li>前庭迷路蝸牛は前内側方向に指して、今では中頭蓋窩にはっきりと見える。そっと前方半規管を把持し、横方向に引っ張って切除する前に前庭迷路の両側に骨鉗子。 </li><li> 2.1節で説明した氷のように冷たい、連続毒ガスACSFを含む解剖皿に切除迷路（ 図1）を浸します。実体顕微鏡下に迷路を保持蝸牛を把持によって料理のベース。前半規管の膨大部を覆う骨で離れてスクラッチする細かい鉗子を使用してください。骨に小さな穴が達成されたら離れて膨大部から骨をフリックし始める。注意これは、基礎となる膜迷路と感覚上皮への損傷を引き起こす可能性がありますように骨を通して鉗子をプッシュしないように注意してください。前方および隣接水平半円膜ダクトと膨大部の両方が（ 図2）が露出されるまでこの手順を続けます。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig1.jpg" /> 図1。隔離されたマウス前庭迷路。A.左パネル）孤立マウス前庭迷路の概略図。前庭感覚上皮にアクセスするための基準の重要なポイントは、蝸牛、前方、および水平半規管は、ラボであるELED。アスタリスクは、前庭感覚上皮を含む半規管の膨大部を示している。B.右パネル）1ヶ月齢のマウスから単離された前庭迷路の顕微鏡写真。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig2.jpg" /> 図2。膜性前庭迷路の露出。前方と水平半規管の膨大部を覆う骨はブラック/ブラウンの斑点の膜膨大部と関連する膨大部神経（CNVIII）を明らかにするために離れて傷れています。下のパネルの回路図は、顕微鏡写真のハイライト領域内の構造を表しており、膨大部とCNVIIIに半規管ダクトの関係を示しています。 <ol start="10"><li>細かい鉗子を使用して、静かに確実に、骨迷路から離れて膨大部および関連卵形嚢を持ち上げその膨大部の中心領域（コンタ）感覚上皮をiningが破損していない。いくつかのケースでは半円形膜管の近位部は、骨から膨大部を解放するためにアイリスハサミでカットする必要があるかもしれません。 </li><li>リーボビッツのL-15培地（Sigma-Aldrich社、セントルイス、MO）で満たされたペトリ皿に2膨大部と卵形嚢を含むトライアドを転送します。 &quot;バックライト&quot;組織への光ファイバを使用してください。これは、膨大部内感覚上皮を含む稜の明確な可視化を可能にします。 </li><li>注意深く細かいアイリスはさみで卵形嚢の斑点 &quot;屋根&quot;で切開を行います。前方の屋根、その後水平膨大部を通じて、この切開を続ける。それ（ 図3A）に接触することなく、できるだけ感覚上皮の端の近くに切開を加えます。感覚上皮（ 図3B）を覆う膜のない部分が存在しないことを確認してください</li><li>小さなGLASに孤立半無傷準備を転送L-15メディアでいっぱいの底記録室。平坦化されたU字状の白金線（ 図3B）に固定された微細なナイロン繊維のグリッドを使用して調製を圧迫。理想的には、グリッドの繊維は感覚上皮を覆うべきではありません、しかし、より多くの安定性が必要とされるいくつかのケースでは、多分好ま感覚上皮を横断する単繊維。 </li></ol><img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig3.jpg" /> 図3。半無傷準備と電極構成の前庭感覚上皮。A.回路図表現の孤立半無傷準備 。稜を覆う膨大部は、感覚上皮（緑）の表面を露出するために&quot;デ屋根&quot;となっています。B.前方を示す半無傷&#39;トライアド&#39;準備の顕微鏡写真（AC）と水平（HC）稜（卵形嚢こと隠さ後肢AC）。記録室のベースに準備を保護するために使用されるナイロン繊維に注意してください。スケールバー：100μmのC.個々の前庭有毛細胞上に位置する記録電極。スケールバー：15μmで。 3。電気生理学<ol><li>継続的に酸素L-15培地で半無傷準備を灌流。メディアは録音を通してモニターされるべきである培地のpH指示薬（フェノールレッド）と色が含まれています。酸素とpHは7.3から7.4であると赤の色に対応する必要があります。 </li><li>達成するために、マイクロピペットプラー（ナリシゲ、日本、モデルPP-830）上：;：ツーステップ·プロトコル（50および熱ステップ2 72ヒートステップ1）を用いて1.5ミリメートル（1.19ミリメートルのID）ホウケイ酸ガラスからの記録ピペットを準備3-4MΩの最後のインピーダンス。 </li><li>含まれているカリウムフッ化物系内部溶液（単位：mm）110 KF、12のKCl、27 KOH、1のNaCl、10 HEPES、10 EGTA、1.8のMgCl 2、3-4 mmにピペットのシャンクを埋める3 D-グルコース、および2のNa-ATP; KOHでpH 7.4。 </li><li>ピペット2-3回のシャンクをラップし、限りダウン電極を絶縁し、ピペット容量を低減するためにパラフィルムの薄いストリップできるだけ先端まで。 </li><li>正立顕微鏡（オリンパスBX51）で低消費電力の倍率（5倍）の下で感覚上皮の上にピペットを置きます。ハイパワー（40X）に切り替えて、付属のCCDカメラで、個々の前庭有毛細胞を可視化する。 </li><li>マニピュレーター（サッター·インスツルメンツ、カリフォルニア、USA）を用いて可視化有毛細胞（ 図3C）の膜上の位置ピペット。ギガオームシールが達成されると、破断ピペットホルダに吸引口を介して印加される負圧少量の細胞膜。 </li><li>標準的な技術を8-9を用いて全細胞電圧クランプ記録を行います。 </li></ol> 4。二光子顕微鏡<ol><li> 5mMのオレゴングリーンを含む0.9％生理食塩水を準備488 BAPTA-1（OGB-1;六カリウム塩、Invitrogen社、ドイツ）。 </li><li>感覚上皮が上から障害物がないことを保証する;まだ水没しながら、ろ紙の小片（ミリポア、ドイツ4X4ミリ、厚0.8μm）の上に &quot;デ屋根の&quot;半無傷トライアドの準備を配置。 </li><li>パルス発生器と広帯域増幅器の組み合わせからなるエレクトロの生理食塩水覆われ、ベース白金電極（7μl）を上にろ紙および準備を転送し、合成カルシウムの5 mMの溶液をさらに5μlのカバーインジケータ染料オレゴングリーン488 BAPTA-1（ 図4）。 </li></ol><img alt="図4" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig4.jpg" /> 図4。バルクエレクトロ。A.エレクトロポレーション構成の断面を模式的に示す。半無傷の調製は、（*）カルシウムdyの中に浸漬濾紙上に配置される電子（オレゴングリーン488 BAPTA-1）と電流が2白金電極間に印加する。 Briggmanとオイラー、2011年10から適応。 <ol start="4"><li>オレゴングリーン488 BAPTA-1溶液が行われるとの接触時の準備の向きを妨害しないように注意して、約2mmの距離でベース電極と上部白金電極を平行に持参。 </li><li> 10-11;準備（+13 V、10ミリ秒のパルス幅は、1 Hzの周波数、10方形波パルス電流のパラメータ）を越え短い電流パルスを渡します。 </li><li> L-15培地で満たしたガラス底の記録室の底に、再び感覚上皮は上から障害物がないことを確実に、その上にシリコンオイルと位置の小軽く半無傷準備を配置。 （ポイント2.13を参照）上記のように画像全体の安定性を確保するために、準備上のナイロングリッドを交換してください。 </li><li>自発の光学録音を行う二光子顕微鏡を用いて標準撮像プロトコール10-11を使って感覚上皮（ 図7）でジニアスカルシウム活動。 </li></ol>

<ol><li>Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otoferlin+is+critical+for+a+highly+sensitive+and+linear+calcium-dependent+exocytosis+at+vestibular+hair+cell+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).</li>
<li>Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell. Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, , (2009).</li>
<li>Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation. Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, , (2009).</li>
<li>Chatlani, S., Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+recordings+from+calyx+endings+in+the+turtle+posterior+crista%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista.</a> 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, , (2010).</li>
<li>Songer, J. E., Eatock, R. A. Transduction in the mammalian saccule. 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, , (2010).</li>
<li>Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vestibular+primary+afferent+activity+in+an+in+vitro+preparation+of+the+mouse+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear.</a> J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).</li>
<li>Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+accumulation+between+type+I+hair+cells+and+calyx+terminals+in+mouse+crista%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista.</a> Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).</li>
<li>Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+synaptic+transmission+differs+in+mouse+type+A+and+B+medial+vestibular+nucleus+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro.</a> J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).</li>
<li>Camp, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuated+glycine+receptor+function+reduces+excitability+of+mouse+medial+vestibular+nucleus+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons.</a> Neuroscience. 170, 348-360 (2010).</li>
<li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).</li>
<li>Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiring+specificity+in+the+direction-selectivity+circuit+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina.</a> Nature. 471, 183-188 (2011).</li>
<li>Rennie, K. J., Streeter, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-dependent+currents+in+isolated+vestibular+afferent+calyx+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals.</a> J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).</li>
<li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+voltage-+and+ion-dependent+conductances+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog%2C+Rana+catesbeiana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> J. Physiol. 400, 237-274 (1988).</li>
<li>Rennie, K. J., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+currents+in+isolated+vestibular+hair+cells+from+the+guinea-pig+crista+ampullaris%5BTitle%5D)+AND+%22Hear.+Res%22%5BJournal%5D)">Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris.</a> Hear. Res. 51, 279-291 (1991).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

バランス感覚のメカニズムは、視覚と聴覚のシステムを、たとえば 、他の感覚系と比較して限定され注目を集めている。前庭やバランス機能の変化を調べた研究のうち、ほとんどはバランス前庭有毛細胞自体の基本的なビルディングブロックの不完全な知識で、前庭動眼反射を含む行動の対策に焦点を当てている。彼らのネイティブ環境から削除急性孤立有毛細胞を用いたので、有毛細胞に集中しているこれらの研究は、ほとんど常に行っている。この記事では、これらの基礎研究を発展させ、マウス前庭感覚上皮の半無傷の準備を示しています。 前庭有毛細胞は比較的堅牢ですが、半無傷準備のユーティリティは切除の速度に決定的に依存しています。一般的に、準備はカンガルーで実行可能なままになります切除後約2-5時間の期間のためのM温度。したがって、動物が記録に安楽死されたときからの時間を最小限に抑えることが重要です。切除は、3週齢のマウス（5-7分合計）のために、比較的簡単かつ迅速であるが、高齢動物（最大9ヶ月齢のマウスでは25分まで）に徐々に、より困難になることができます。これらの古い動物では、解剖の温度が重要な決定要因で...

私たちの日常生活への前庭系の重要な貢献にもかかわらず、加齢に伴う前庭機能の観察された減少の責任のプロセスを明確に理解することは、とらえどころのないまま。知識の欠如のための一つの理由は、その前庭機能の低下がほぼ独占的に前庭動眼反射（VOR）、外因性前庭機能の正確な指標を含む行動のアッセイを使用して検討されているですが、本質的な構成要素の変更に限定された洞察力を提供しています。これは、健康、病気、あるいは老化に前庭有毛細胞機能の理解への大きな障害である。 個々の前庭有毛細胞の多くの研究が行われてきたが、主要な欠点​​は、有毛細胞、さらには萼求心端子は、機械的および/または酵素的処理により、通常の環境から除去される急性有毛細胞調製物、に依存している。このようなアプローチinevitaブライ有毛細胞や萼、及び有毛細胞と支持細胞との間の微妙なマイクロアーキテクチャを混乱させる。半無傷の準備1-5、及び孤立マウス迷路の準備6の発展に伴い、より密接に、生体内でそれらの似ている条件の下でシナプスのコミュニケーションの様々な形態を勉強する機会が用意されました。実際、林ら （2011）I前庭有毛細胞は神経上皮内に埋め込 ​​まれて残ったものに比べて急性孤立型から記録された全細胞電流の著しい差が認められた。具体的には、カリウム有毛細胞と求心萼間の間隙内に蓄積すると考えられ、著しく有毛細胞応答7を変化させる。この種の情報は、ここで説明した前庭感覚上皮の半無傷準備なし得ることは不可能であろう。我々はマウス稜3の半無傷準備を実証および全細胞パッチ電気生理学から得られた代表的な結果、2光子カルシウムイメージングを示す。

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Leibovitz medium L-15</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4386-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA-1-oregon green</td><td>Invitrogen</td><td>O6806</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT </td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>A60S</td><td></td></tr><tr><td>Upright microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>二光子顕微鏡</td><td>オリンパス/ラビジョン</td><td>BX51WI/ TriMScope II</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #5 SF鉗子</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>フリードマン・ピアソン ロンガース</td><td>FST</td><td>16221-14</td><td></td></tr><tr><td>スタンダードパターンハサミ</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>インストラテック A-Dコンバーター</td><td>HEKA</td><td>ITC-18</td><td></td></tr><tr><td>サッターマイクロマニピュレーター</td><td></td><td>Sutter MP-225/M</td><td></td></tr><tr><td>マルチクランプアンプ</td><td>Axon Instruments</td><td>700B</td><td></td></tr><tr><td>データ収集ソフトウェア(電気生理学)</td><td>Axograph</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Imspector データ収集ソフトウェア(2光子)</td><td>Max Planck innovation</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

電気生理学および高分解能二光子顕微鏡用マウス前庭感覚上皮の切り抜き半無傷準備

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

理解前庭有毛細胞は、正常な条件の下で機能する、またはどのように外傷、疾患、およびこの機能を混乱させる老化、予防的アプローチ、および/または新たな治療戦略の開発に重要なステップです。しかし、異常な前庭機能を見て研究の大半は、細胞レベルではなかったが、このような歩行分析と前庭動眼反射性能として前庭機能障害の行動アッセイに主に焦点を当てた。この作品は物事がうまくいかないときに何が起こるかについての貴重なデータが得られているが、少し情報が障害の根本的な原因に関して収集されます。前庭機能の基礎となる細胞および細胞内のプロセスに焦点を当てている研究のうち、ほとんどは彼らのシナプス接続と支持細胞環境を欠い急性単離し有毛細胞、に頼ってきた。したがって、主要な技術的課題は、準備中で絶妙に敏感前庭有毛細胞にアクセスしている少なくとも生理的に、中断されaration。ここでは、有毛細胞/一次求心錯体を含む地元の微小環境を保持マウス前庭感覚上皮の半無傷の準備を示しています。

前庭有毛細胞の電気生理学的特性は、それらが07埋め込 ​​まれている内に複雑なマイクロアーキテクチャに依存している。 図半無傷の前庭上皮製剤は、タイプI有毛細胞（ 図5A）、タイプIIの有毛細胞を区別するために使用することができることを図5 （ 図5B）、そして特徴的な全細胞コンダクタンスに基づい萼一次求心（ 図5C）。これらの特性は、脱分極とI型有毛細胞、および（ 図5Cの矢印）萼一次求心で活動電位を表す過渡内向きナトリウム電流の存在下で大規模な&quot;崩壊&quot;のテール電流の間に顕著な&quot;たるみ&quot;が含まれています。 製剤は、個々の前庭有毛細胞型に老化の影響を定量化するために使用することができる。 図6は、コンダクタンス（Fを比較若者と高齢マウスで負静止電位からの...

前庭有毛細胞機能の解析は頭蓋骨の最も困難な部分の奥深くの位置、側頭骨錐体によって複雑になる。最も機能有毛細胞研究は、急性単離された有毛細胞を使用している。ここでは、電気生理学的および二光子顕微鏡研究のためのマウス前庭上皮の半無傷の準備について説明します。

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

本手順の全体的な目的は、前庭有毛細胞の基本的な細胞および細胞内プロセスを研究するために使用できる、ほぼ正常な状態のマウス前庭感覚上皮標本を得ることであります。これは、まず頭蓋骨から骨性前庭迷路を分離することによって達成されます。次のステップとして、微細ピンセットを用いて骨性迷路を慎重に削り、下層にある膜性迷路を露出させた後、骨格から完全に除去します。次に、微細な虹彩剪刀を用いて上層の膜を切り除き、前庭感覚上皮を露出させます。最終ステップとして、半完損の状態である感覚上皮標本をガラス底チャンバーに載せ、重りの付いたナイロンネットで固定します。最終的に、パッチクランプ電気生理学および二光子顕微鏡を用いて、それぞれ各タイプの前庭有毛細胞および一次神経の固有膜特性とカルシウムシグナリングプロファイルを特性解析します。単離毛細胞調製を含む既存の手法に対する本手法の主な利点は、毛細胞とその一次求心性ニューロンの配置を、可能な限り正常に近い状態で維持できる点にあります。これにより、生理的条件に近い状態で、かつこれらの測定を同時に行うことが可能になります。本手法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。というのも、前庭器官が頭蓋骨の側頭骨の深部に包まれていること、また感覚上皮自体が非常に小さく、解剖中に損傷しやすいため、この解剖操作を習得するのが非常に困難だからです。エレクトロポレーションおよび2光子励起の手順を実演するのは、私の研究室で共同研究を行っている同僚のStefano DeMarcoです。地域の機関および政府のガイドラインに従ってC 57 black sixマウスを深く麻酔し、断頭して頭蓋骨を露出させます。ラムダ点に小さな切開を入れ、矢状縫合に沿って切断します。その際、シアブレードで脳を引っ張らないように注意してください。このステップでは、組織を冷却するために氷冷したA CSFを脳に適用し、次に浅い曲げのPearson ursを用いて、頭頂骨を外側へ、後頭骨を後方へと慎重に剥離します。ここで再度、氷冷したA CSFを適用してください。次に、小型のステンレス製スパチュラを用いて、中頭蓋窩および後頭蓋窩の表面から脳をそっと持ち上げます。これで、蝸牛が向いた状態で、中頭蓋窩に前庭迷路が明確に現れます。氷冷したA CSFを内側に加え、前庭迷路の両側を洗浄します。次に、前半規管を掴んで外側に引くことで、前庭迷路を慎重に切り出します。切り出した迷路を、氷冷液を入れた解剖皿に浸します。ステレオ顕微鏡下に置かれた、ガスを通し続けた A CSF。この図は切除された迷路の詳細を示しています。次に、ステレオ顕微鏡下で、微細ピンセットで蝸牛を掴み、迷路をディッシュの底に固定します。2本目のピンセットを使用して、前半円管膨大部を覆っている骨を削ります。骨に小さな穴が開いたら、膨大部から骨を弾き飛ばすようにして除去し始めてください。ピンセットを骨に押し込まないよう注意してください。骨を押し込むと、その下にある膜迷路や感覚上皮を損傷させる可能性があります。ここに示すように、前半規管および隣接する水平半規管の膜、管、および球部が露出するまでこの手順を続けます。次に、微細鑷子を用いて、球部および関連する卵形嚢を骨迷路から慎重に持ち上げ、感覚上皮を含む球部の中央領域が損傷しないように注意します。2つの球部と卵形嚢を含むこの三つ組みの組織を、Lebovitz L 15 培地を満たしたシャーレに移します。ファイバーオプティクスを用いて組織を背面から照らし、嚢（pul）内の感覚上皮を含むクリスタ（Krista）を明確に可視化します。次に、微細虹彩剪刀を用いて、膨大部（amp）の斑点のある屋根部分を慎重に切開します。感覚上皮に接触しない範囲で、可能な限り上皮の縁に近い位置で切開してください。ここに示されているように、感覚上皮の上に膜の破片が残っていないことを確認してください。この模式図は、最終的な標本の形状と記録電極の配置を示しています。単離された半完存標本を、L 15培地を満たした小さなガラス底の記録チャンバーに移します。平坦化したU字型の白金線に固定された微細なナイロン繊維のグリッドを用いて、標本を固定します。これで、電気生理学的記録を行う準備が整いました。半維持標本を、継続的に酸素供給したL 15培地で灌流します。培地が赤色を維持していることを確認し、酸素存在下でのpHが7.3から7.4であることを示します。手順の合間に、内径1.5 mmおよび1.19 mmの記録用ピペットを準備します。マイクロピペットプラーを用いて2段階のプロトコルでケイ酸ガラスを抽出し、最終インピーダンスを3～4 MΩに調整します。ピペットのシャンクに、フッ化カリウムベースの内部溶液を3～4 mm充填します。その後、電極を絶縁しピペット容量を低減させるため、パラフィルムの細い帯で、シャンクのチップに近い位置まで2～3回巻き付けます。正立顕微鏡を用い、低倍率の5xで感覚上皮の上にピペットを配置します。その後、40xの高倍率に切り替え、CCDカメラを用いて個々の前庭有毛細胞を可視化します。マイクロマニピュレーターを使用して、可視化した有毛細胞の細胞膜上にピペットを配置します。ギガオームシールが形成されたら、ピペットホルダーの吸引ポートから少量の負圧をかけて細胞膜を破裂させ、2光子顕微鏡法の標準的な手法を用いてホールセルボルテージクランプ記録を行います。デルーフィング（屋根除去）後の状態を半分維持してください。標本を浸し、小さなフィルターペーパーの上に移動させます。感覚上皮の上方に遮蔽物がないことを確認します。フィルターペーパーと試料を、生理食塩水で覆われたエレクトロポレーターの底部白金電極の上に置きます。試料の向きが変わらないように注意しながら、上部白金電極を底部電極と平行にし、約2 mmの距離まで近づけます。Oregon Green 4 88 baftaと接触させた後、この画像に示すように溶液を調製します。準備した試料に短い電流パルスを印加します。L 15培地を満たしたガラス底記録チャンバーの底に、シリコンオイルを少量塗布します。次に、感覚上皮が上から遮られないように注意しながら、半維持標本を再びその上に配置します。イメージングの間、安定性を確保するために、標本の上にナイロン製グリッドを戻します。その後、2光子顕微鏡を用い、標準的なイメージングプロトコルに従って、感覚上皮における自発的なカルシウム活性の光学記録を行います。この画像は、タイプ1前庭有毛細胞から記録されたホールセル電流を示しており、矢印で示された大きな崩壊性テイル電流が特徴的です。また、タイプ2前庭有毛細胞からもホールセル電流が記録されました。テイル電流が存在しないことに注目してください。この画像は、-120 mVの負の静止電位からの脱分極後に、矢印で示される一過性のナトリウム介在性電流によって特徴付けられる、calyx一次求心性神経からのホールセル記録を示しています。すべての細胞は-60 mVに保持されました。この図は、脱分極時間の延長に対する応答として記録された、若齢マウスおよび高齢マウスのタイプ2有毛細胞のIV関係を示しています。これらのヒストグラムは、100ミリ秒のIV曲線に基づいた、若齢および高齢マウスにおけるタイプ2有毛細胞の平均コンダクタンスと活性化率を示しています。これら2つの二光子顕微鏡写真は、上段では通常のL 15 PERFU 8に対して、下段では100ミリモーラーの塩化カリウムを含むL 15に対して、BAFTA 1 Oregon Greenカルシウム活性化が起こった様子を示しています。矢印は、塩化カリウム添加前後の同一の個々の有毛細胞を示しています。このプロットは、前の画像で矢印で示された個々の細胞のカルシウム蛍光プロファイルを示しています。この感覚上皮の2光子顕微鏡写真では、個々の有毛細胞にOregon Green 488 BTA-1がロードされています。挿入図は、矢印で示されたタイプ1有毛細胞の細胞質、または二重矢印で示されたタイプ1有毛細胞を囲むカリックス一次求心性線維におけるカルシウムの細胞内局在を示しています。熟練すれば、この解剖は10分以内に完了させることができます。このビデオを視聴することで、前庭感覚上皮をどのように単離し、形態を維持し、電気生理学的記録および2光子カルシウムイメージングに向けて生存性を維持させるかについて、十分に理解できるはずです。

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神経科学

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電気生理学および高分解能二光子顕微鏡用マウス前庭感覚上皮の切り抜き半無傷準備

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