Name: 抗生物質耐性ブドウ球菌の細菌の検出のためのバイオセンサー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-08T09:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: 学ぶ 溶菌性ファージバイオセンサーを用いたMRSAとMSSAの識別法。水晶振動子マイクロバランスセンサーに固定した修飾ファージが、メチシリン耐性ブドウ球菌を迅速に検出し、DNA抽出を不要とする革新的診断技術を示す。

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ここに報告された作品は、オーバーン大学AUDFSとUSAF CRADA 07から277-60MDG-01からの補助金によって支えられて。この記事の見解は著者のものであり、アメリカ空軍、国防総省、または米国政府の公式政策や立場を反映するものではありません。

1。ステージの設定<ol><li>型株S.を得る球菌 ATCC 12600、S.球菌 ATCC 27690及び枯草菌 ATCC 6051。 S.のメチシリン耐性株黄色ブドウ球菌 - MRSA1、MRSA 2、MRSA 5、MRSA 13、MRSA 26、MRSA 34、MRSA 45、B.炭疽スターン、 ネズミチフス菌 LT2、 赤痢菌、エルシニアenterocolotica、プロテウス·ミラビリス、肺炎桿菌 13882;溶菌ファージ12600。 </li><li> PBP 2aは抗体共役ラテックスビーズを入手します。 </li><li> 21に記載されているようNZY培地を準備します。 </li><li>食塩水（PBS）をリン酸緩衝を得る。 </li><li>ラングミュア·ブロジェット（LB）単分子層堆積のためのサブフェーズとして脱イオン水を準備します。 </li></ol> 2。バクテリオファージの伝播と滴定<ol><li> Sの一晩培養を5mlをインキュベート球菌 ATCC 12600ファージを500μl（3×10 9 &lt;と（3.6×10 8コロニー形成単位（CFU）/ ml）を/ 37℃で一晩振盪インキュベーターで2 Lフラック500ミリリットルNZY培地で）&gt; PFU / mlの（商標）。 </li><li> 4℃で10分のために4,424 xgで文化を遠心</li><li> 4℃で10分間、11,325×gで再遠心上清℃で</li><li> 0.22μmのミリポアフィルターを通してフィルター上澄み。 </li><li> 1.5時間75395 xgでろ液を遠心分離します。 </li><li>蒸留水100μlのペレットを溶解する。 </li><li> NZY培地でファージ懸濁液の10倍希釈液を調製する。 </li><li> Sの（ON）一晩培養のプレート1ミリリットルすべての表面が覆われていることを確認するためNZY寒天と2プレートの各々の上に黄色ブドウ球菌 ATCC 12600を。文化の過剰を削除し、30分間、表面が乾燥してみましょう。 </li><li>プレートの表面に適当なファージ希釈のサンプル（10μL）を発見し、18から24時間、37°C ​​のでインキュベート。 </li><li>プラークの形成を調べ、ファージ力価を計算します。バクテリオファージ力価（T）は、ウェブ数に基づいて推定されるファージサスペンションと希釈係数（F）10μlの体積（V）ごとに形成laques（N）。 。Tは= N /（VXF）たとえば、希釈10 -7でのプラーク数75と体積10μlの（10×10 -3 ml）のために、力価が75 /等しいです：力価は、次の式により算出した（10×10 -3×10 -7）= 7.5×10 10プラーク形成単位（PFU）あたりのmlの懸濁液。 </li></ol> 3。ゴールド固定化ファージ<ol><li> 10分間アルゴンのプラズマエッチングによってクリーンゴールドコーティングされた水晶片（60ミリメートル2）した後、滅菌キャビネットにUV光の下で6時間殺菌する。 </li><li>滅菌シャーレ内の各部分の金表面に1×10 9 PFU / mlのファージ懸濁液の50マイクロリットルを追加し、室温で湿潤チャンバー内で一晩インキュベートする。 </li><li>残りファージ懸濁液を取り出して、滴定。 </li><li>アンバウンドを除去するためにPBSで結合したファージと片5回洗浄ファージ。 </li></ol> 4。乾燥した表面上に固定化されたファージ感染のテスト<ol><li> NZY寒天プレート上にS。球菌 ATCC 12600のO / N文化を広げ、乾燥させることができます。 </li><li>板面上に固定化したファージとゴールドピースを下に置きます。 </li><li>感染性を示している℃で37℃で12時間インキュベートした後溶解のゾーンを守ってください。 </li><li>対照実験のないファージを金覆わ片を使用してください。 </li></ol> 5。液体中の遊離と結合したファージの溶解活性のテスト<ol><li> S.のON文化を追加4 300ミリリットルサイドアームフラスコ（各フラスコに6×10 6 CFU / ml）を毎におけるNZYのブドウ球菌 ATCC 12600〜10ミリリットル。 </li><li> 2フラスコ2×10 6 PFU /遊離ファージmlのアドイン。 </li><li>コントロールとして他の二つのフラスコを使用してください。 </li><li> S.の経時変化を監視するすべてのフラスコを30分間隔で光学密度測定（OD 600）により、570分間球菌細胞溶解。</li><li> 24時間での最終的な測定を行います。 </li><li>手順5.1から5.5を繰り返しますが、コントロールフラスコのないファージを金結合したファージの代わりに自由にファージと片、金の部分を使用しています。 </li></ol> 6。インキュベーション中に結合したファージの損失<ol><li>室温で一晩湿気のチャンバー内に配置されたペトリ皿中の滅菌金片の表面に1×10 9 PFU / mlのファージ50μlのを追加します。 </li><li>金表面と力価から非結合ファージとサスペンションを取り外します。 </li><li> 8時間37℃で5 PBSで倍と場所シェーカー·インキュベーター、15 mlチューブに、1mlのNZY溶液中の結合したファージとの金の部分を洗う。 </li><li> 2で説明したように切 ​​り離されたファージの力価を決定します。 </li></ol> 7。ファージスフェロイドの準備<ol><li> 1ミリリットルバイアルで分光等級のクロロホルム等量と在庫ファージ12600懸濁液400μlの（10 11 PFU / ml）を組み合わせる室温で加えた。 </li><li>優しくボルテックス1分持続オーバーファージ - クロロホルムサスペンション5-6回（5秒間隔）。 </li><li>懸濁液を30秒間安定化させ、次いでスフェロイドを含む上相をピペットで単層の準備のためにオフにピペッティングした。 </li><li>伝送および走査型電子顕微鏡用スフェロイドサスペンション数マイクロリットルを取る。 </li><li>バイオセンサー製造の残りの回転楕円体サスペンションを使用してください。 </li></ol> 8。バイオセンサーの準備<ol><li> 10分PDC-32G Harrickプラズマクリーナー、アルゴンのプラズマエッチングによってクリーンQCM-Dセンサー。 </li><li>任意の有機不純物を除去するためにヘキサンでセンサーを洗浄します。 </li><li> 22で説明したように、フィルムバランスのトラフを準備し、清掃してください。 </li><li>副相溶液とLBトラフを記入し、20℃±0.1℃をトラフ障壁とそれをきれいにし、トラフを安定</li><li>水性suspensiにおけるファージ12600300μlのアリコートを広げLBサブフェーズへ（10 11 PFU / ml）を上に。 </li><li>部分的に副相22,23に浸漬する傾斜水和ガラス棒を下に実行するためにファージ12600水性懸濁液（10 11 PFU / ml）を300μlのアリコートを可能にすることにより、LBサブフェーズ·ソリューションにファージ単層を準備します。 </li><li> 10分間準備された単層を安定化した後、定圧19 N / mのが達成されるまで30 50mm /分（44 cm 2で/分）の速度でそれを圧縮する。 </li><li>連続して単層のうちに7回センサーを浸漬することにより4.5ミリメートル/分の速度で垂直に配置QCM-Dセンサに垂直成膜を実行します。細菌試料への曝露の前に堆積ファージ単層の電子顕微鏡は、層が均質で連続であることを示し、均一（データは示さず）。 </li><li>繰り返し3で調製されたファージ回転楕円体懸濁液を用いて4.5から4.8を繰り返します。 </li><li> MRSA検出、電子のために製造されたファージのバイオセンサーを使用して、顕微鏡、およびエリプソメトリ。 </li></ol> 9。バイオセンサーテスト、メチシリン耐性および感受性黄色細菌の識別<ol><li>このプロトコルでは、未変性および変性ファージとファージスフェロイドを有するバイオセンサが用意されている。 4つのセンサ流室を有する水晶振動子マイクロバランスがQCMセンサー表面に固定化ファージを細菌の結合を監視するために使用される。 PBP 2aは抗体共役ラテックスビーズは、メチシリン耐性（MRSA）および感受性黄色ブドウ菌を区別するために利用される。すべての測定は5 MHzでフローモード（50μL/分）で行われる。 </li><li>水中でQCMセンサ（〜30分）のベースラインの共振周波数を確立する。 </li><li>テストセルを通る水でのライブメチシリン感受性黄色細菌細胞（10 9 CFU / ml）の懸濁液を描画します。 </li><li>連続的に第一の倍音、USIのためのセンサの共振周波数とエネルギー散逸の変化を監視ngのQ-ソフトソフトウェア。 </li><li>センサの共振周波数及び損失の変化が飽和レベルに達したときに、周波数及び損失の連続監視中に流れるようにPBP抗体共役ラテックスビーズの懸濁液（6.77×10 10粒子/ ml）を加える。 </li><li>繰り返しメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の細菌細胞（MRSA）が9.2から9.5を繰り返します。 </li><li> Cは質量感度が一定である（5 MHzでC = 17.7 ngのX cm -2のX Hzで-1 Sauerbrey方程式24,25 量Δf=-ΔmをXN / C、による結合細菌に起因する質量変化を通じて、周波数変化を定義）、mは質量であり、nは倍音の数（n = 1）である。 </li><li>記録からのエネルギー散逸変化（ΔD）を定義する振動の指数関数的減衰（周波数および振幅は振動の一周期の間に消費されると、蓄積されたエネルギーの定量化を可能にする、減衰、それぞれ、Eは 散逸し、Eが 格納されている ：ΔD = E 消散 / 2πEを 格納 。 ΔDは放熱ユニット（DU）は1 DU = 10 -6相対単位）で測定される。 </li></ol>

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<li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+Laboratory+Techniques%3A+Plating+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods.</a> J. Vis. Exp. (63), e3064(2012).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

それはよくファージを細菌性病原体28バイオセンサープローブとして使用できることが知られている。急速な差別抗生物質耐性および感受性株：これは、PBP 2aの抗体と一緒にファージは、古い問題を解決するために利用できることは、この研究で実証されている。 しかしながら、それらの正常な未変性ブドウ球菌ファージは、彼らが細菌に結合するにもかかわらず、QCM装置​​との細菌検出には適していないが判明した。ファージ尾部は、音響波がファージ尾の末端に結合したバクテリアを &quot;到達&quot;ことができないほど長い。この状態は、（ 図3Aおよび図3B）EM画像によって示された&quot;欠けているマス&quot;効果29と有意な結合にもかかわらず、共振周波数と放熱変更を登録することができないことをもたらした。この問題は簡単にスフェロイドと無傷ファージ、クロロホルム - 水処理によって変更されたファージを交換することで解決しました。この治療法は、完全に機能するPをもたらし、短く太く、非柔軟尾（ 図2E ...

黄色ブドウ球菌のメチシリン耐性株は、本質的な感染症や院内アウトブレイク4-8の要因として示唆されている。このようなディスク拡散オキサシリン寒天スクリーンテスト、または微量液体希釈としてメチシリン耐性の認識の一般的な方法は、耐性の発現量を高めるために合わせた培養条件に依存している。変化は、成長培地に30または35でオキサシリン、インキュベーションの活用°Cではなく37℃以上、およびNaClのインクルージョンが含まれています。さらに、これらの種類の技法が正しい検出のため、24時間の代わりに16〜18時間の長い潜伏期間が必要である。メチシリン耐性を同定するための感度の適切な（&gt; 96％）レベルの急速な技術は、バイテックGPS-SAカード、ラピッドATB黄色ブドウ球菌システム、及び3-11時間後に結果を生成する高速マイクロスキャンパネルシステムのような自動化された微量希釈法を含む9-11。クリスタルMRSA IDシステムは、Sの成長の認識に基づいて迅速な方法である2％NaClおよび酸素感受性蛍光センサー付リットルあたりオキサシリン4mgの存在下での黄色ブドウ球菌 。 91から100パーセントの間で感度の範囲は、インキュベーション12-14の4時間後に主張した。これらの表現型の方法は、異種の抵抗を発現普及している菌株の影響によりその精度が制限されている。したがって、メチシリン耐性の認識のための最高の広く受け入れられている方法はmecAの遺伝子15のPCRまたはDNAハイブリダイゼーションである。しかしこの手法は、精製されたDNAを必要とし、細胞の破片16を含む様々な混和剤（不純物）に非常に敏感です。 さらに、これらの技術は実行するのに長い時間を必要とする。 mecAの遺伝子産物、蛋白質PBP 2aとの認識戦略は抵抗を決定するために利用することができ、標準試験法17に比べて信頼性があってもよい。 1,2,18を有するものを含む黄色ブドウ球菌株の認識プローブとして利用することができることが示された。本研究ではこのようなリアルタイムでMRSAのコンフォメーションと一緒に細菌の認識などのMRSAの特異的認識と検出における新規手法を提案した。この特定の目的のためのS.タンパク質に対するモノクローナル抗体と組み合わせたホストの広いスペクトル（MRSA株を含む）と黄色ブドウ球菌バクテリオファージは、（PBP 2a）が使用されている。 PBP 2aは、細胞壁タンパク質であり、それはMRSAの抗生物質抵抗性の原因である。しかしPBP 2aの抗体は、S.のために固有のものではありませんいくつかの他の細菌から黄色ブドウ球菌は、PBP 2A 19,20に配列類似性と抗生物質結合タンパク質を持っている。そこで本研究では、S. PBP 2aの蛋白質に対する黄色ブドウ球菌バクテリオファージおよび抗体が使用されている。納入仕様にバイオセンサーを開発することができるようにする的に二段階のアクションが利用されていると、デバイスを検出し、MRSAを識別します。最初のステップは、Sを使用センサプローブとして球菌バクテリオファージ単層、2番目のステップはPBP 2A特異的な抗体を用いている。したがって、人はS.を認識し、手順黄色ブドウ球菌の細菌は、他の一人としての抗生物質結合タンパク質に敏感になります。二つのステップから受信された信号が正である場合には、MRSAの特異的検出を示す。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS) </td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>分光光度クロロホルム </td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>154733</td><td>(99.8% A.C.S.) </td></tr><tr><td>Hexane-Anhydrous </td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>29609-0</td><td>(95%)</td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol </td><td>Pharmco products Inc. Brookfield, CT</td><td>64-17-5</td><td>190 Proof</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>PBP 2a antibody conjugated latex beads</td><td>株式会社電化製研株式会社, 東京, 日本</td><td>MRSA-Screenテスト</td><td></td></tr><tr><td>S. aureus ATCC 12600、S. aureusATCC 27690およびBacillus subtilis ATCC 6051 アメリカン</td><td>タイプカルチャーコレクション(バージニア州マナッサス)から。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRSA1、MRSA 2、MRSA 5、MRSA 13、MRSA 26、MRSA 34、MRSA 45、B. anthracis Sterne、サルモネラチフス菌LT2、Shigella flexneri、Yersinia enterocolotica、Proteus mirabilis、Klebsiella pneumoniae 13882;溶解性ファージ12600</td><td>オーバーン大学、オーバーン、アラバマ</td><td></td><td></td>州の培養コレクション</tr><tr><td>遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>オプティマL-90K 超遠心分離機</td><td></td></tr><tr><td>KSV 2200 LBフィルムバランス</td><td>KSVケミカルズ、フィンランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光学顕微鏡光学系 </td><td>CitoViva Technology Inc.、オーバーン、AL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QCM-D</td><td>Q-Sense AB、V&#228;ストラFr&#246;lunda, Sweden</td><td>E4</td><td></td></tr><tr><td>走査型電子顕微鏡 (SEM)</td><td>JEOL USA Inc., Peabody, MA</td><td>JEOL-7000F SEM</td><td></td></tr><tr><td>送信電子顕微鏡 (TEM)</td><td>JEOL USA Inc., Peabody, MA</td><td>JEOL, JEM 2010</td><td></td></tr><tr><td>Stericup, Presterilized</td><td>Millipore Corporation, Billerica, MA</td><td>SCGPU05RE</td><td>0.22 &mu;m, GP Express PLUS membrane</td></tr><tr><td>Bio-Assay dish</td><td>NUNC A/S, Denmark</td><td>240835</td><td>寸法(mm), 245 x 245 x 25</td></tr><tr><td>ピペット</td><td>Gilson, Pipetman, France</td><td>P100, P200, P1000</td><td></td></tr><tr><td>C24 Incubator Shaker</td><td>New Brunswick Scientific, CT</td><td>Classic C24</td><td></td></tr><tr><td>Gold-coated quartz pieces</td><td>Auburn University, AL</td><td></td><td>Homemade</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>フィッシャーブランド、米国</td><td>0875713</td><td>100 mmX15 mm </td></tr><tr><td>SterilGard III Advance</td><td>The Baker Company、ME</td><td>SG403</td><td></td></tr><tr><td>培養成長フラスコ</td><td>Corning Incorporated、NY</td><td>4995</td><td>PYREX 250 ml Erlenmeyer フラスコ </td></tr><tr><td>光学分光計</td><td>Genesys 20.サーモスペクトロニック、米国。</td><td>4001</td><td></td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>Harrick Plasma, USA</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Millipore water purification system</td><td>Millipore</td><td>Direct-Q</td><td></td></tr><tr><td>Imaging Ellipsometer</td><td>Accurion, USA</td><td>nanofilm_ep3se</td><td></td></tr><tr><td>Software </td><td>Q-Sense AB, Sweden</td><td>QSoft, QTools</td><td></td></tr></tbody></table>

抗生物質耐性ブドウ球菌の細菌の検出のためのバイオセンサー

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

黄色ブドウ球菌株の広い宿主範囲およびペニシリン結合タンパク質（PBP 2a）の抗体共役ラテックスビーズは、メチシリン耐性（MRSA）および感受性（MSSA）Sの識別用に設計されたバイオセンサーを作成するために利用されているを有する構造的に形質転換された溶菌バクテリオファージ。ブドウ種 1,2。溶菌ファージは、水 - クロロホルムインタフェースとの接触によりファージスフェロイドに変換されている。ファージスフェロイド単層をラングミュア·ブロジェット（LB）法3でバイオセンサー表面上に移動されました。作成されたバイオセンサーは、細菌ファージの相互作用を評価するための放熱追跡と水晶振動子マイクロバランス（QCM-D）によって検討されている。細菌スフェロイド相互作用が減少し、共振周波数とMRSAとMSSA株の両方の消費エネルギーの上昇につながった。細菌結合した後、これらのセンサは、さらにペニシリン結合タンパク質抗体ラテックスビーズにさらされているS。 MRSAで分析センサーは2A抗体ビーズをPBPに応え、MSSAで検査センサーが応答を与えませんが。この実験的な区別は、メチシリン耐性と敏感S.間に明確な区別を決定黄色ブドウ球菌株 。同じようにバインドされ、バインドされていないバクテリオファージは、表面上、水懸濁液中の細菌の増殖を抑制する。溶菌ファージをスフェロイドに変更されると、彼らは強力な溶解活性を保持し、高い細菌の捕獲能力を示しています。ファージとファージスフェロイドは、抗生物質耐性微生物のテストおよび滅菌のために利用することができる。他のアプリケーションは、バクテリオファージ療法および抗菌面での使用を含むことができる。

ファージは、Sのすべてのテストされた株に対して溶菌活性を示しとしてファージスポット試験によって示さMRSA株、 黄色ブドウ球菌を含む、。プラークサイズは、通常5〜15 mmの範囲であった。活動は、他の試験培養物（ 表1）に対して、見つかりませんでした。 S.の正常な成長球菌 ATCC 12600は37℃シェーカー·インキュベーターでNZY培地で°Cは、 図1A（白丸でラベル曲線）で示されている。細菌の数が×10 8 CFU / mlの。 図1A（黒丸によってラベル曲線が）同時にで追加された2.0×10 6 PFU / mlの無料ファージの共培養の結果を示している4.0から3.2×10 6から増加S.同じ濃度球菌 ATCC 12600。金表面上に固定化されたファージは、懸濁液中のファージの活動（ <strong...

溶菌ファージバイオセンサーと抗体ビーズメチシリン耐性（MRSA）と敏感ブドウ球菌の細菌を区別することができます。ファージを水晶振動子マイクロバランスセンサーの表面上にラングミュア·ブロジェット法で固定し、広範囲のブドウ球菌プローブとして働いていた。抗体ビーズはMRSAを認識しています。

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

本実験の総合的な目的は、特異的に選択された改変溶菌性バクテリオファージを用いて、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）株とメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（MSSA）株を判別することである。細菌が溶菌性ファージの長く柔軟な尾部に付着すると、付着した細胞とセンサー表面との距離がQC mの音響波の浸透深さよりも大きくなる。そのため、結合イベントによる信号は生成されない。無傷のファージをスフェロイドに置換すると、短い尾部を持つ完全に機能的なファージが得られます。これにより、QC-Mの音響波の浸透深さ内にある細菌と結合し、ファージスフェロイドがA-Q-C-M-D結晶上に堆積され、混合細菌懸濁液にさらされた際の周波数変化および散逸変化に寄与します。これらはstaphylococcus aureusのMRSA株とMSSA株の両方に結合しますが、他の細菌には結合しないため、結晶表面上でstaphylococcus aureusを他の細菌から分離させます。最終的に、MRSA特異的なPPP two A抗体結合ビーズを添加すると、staphylococcus aureusのMRSA株が存在する場合に信号が生成されます。PCRなどの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、DNA抽出を必要とせず、エンピリックスの影響を受けないことです。この手法は黄色ブドウ球菌（staphylococcus aureus）のスクリーニングや消毒に関する知見を提供しますが、他の薬剤耐性菌にも適用可能です。バイオセンサの作製には精密さ、正確さ、そして根気が求められるため、本手法を視覚的に提示することが重要です。まず、金コーティングされた石英片をArgonneで10分間プラズマエッチングして洗浄し、次いで滅菌キャビネット内でUV光を照射して6時間滅菌します。滅菌後、滅菌済みのシャーレ内で各石英片の金表面にファージ懸濁液を50 µL滴下し、加湿チャンバー内で室温にて一晩インキュベートします。翌朝、タイター測定用に残ったファージ懸濁液を除去し、その後、結合していないファージを取り除くため、結合したファージを持つ各石英片をPBSで5回洗浄します。乾燥表面における固定化ファージの感染性を試験するには、まず黄色ブドウ球菌（staphylococcus aureus）の overnight 培養液を NZY eRate プレートに塗布し、懸濁液を乾燥させます。次に、ファージを固定化した金コーティングクオーツ片を、固定面を下にしてプレート上に配置します。37 °C で 12 時間後、感染性を示す溶菌環（zone of lysis）が観察されます。これにより、液体中における遊離ファージの溶菌活性を試験することができます。まず、4本の300 mLサイドアームフラスコそれぞれに、10 mLのNZYと黄色ブドウ球菌（staphylococcus aureus）の overnight 菌液を加えます。次に、そのうちの2本のフラスコに、2×10⁶ PFU/mLの遊離ファージを加えます。その後、各フラスコについて、30分間隔で吸光度を測定し、570分間、黄色ブドウ球菌の細胞溶解のタイムコースをモニタリングし、最終的に24時間後に測定を行います。液体中における結合ファージの溶菌活性を試験するには、先ほど示した手順を繰り返しますが、遊離ファージの代わりに、ファージを結合させた金粒子を実験用フラスコに加えます。ファージステロイドを調製するには、まず、室温で1 mLバイアルに400 µLのストックファージ 1 2600懸濁液と等量の分光光度計グレードのクロロホルムを混合します。次に、ファージクロロホルム懸濁液を、1分間にわたって5秒間隔で5〜6回、穏やかにボルテックスします。懸濁液を30秒間静置して安定させた後、ステロイド懸濁液を含む上層分画を回収します。透過電子顕微鏡および走査電子顕微鏡観察用に、ステロイド懸濁液を数µL、500µLバイアルに移します。残りのステロイド懸濁液は、バイオセンサ作製用に1mLバイアルに保存します。バイオセンサーを調製するには、まずプラズマクリーナーを用いてアルゴン中で10分間プラズマエッチングを行い、QCMDセンサーを洗浄します。次に、ヘキサンでセンサーをすすぎ、有機不純物を除去します。続いて、OlsonらによってJournal of Microbiological methodsに記載された方法に従い、フィルムバランスのトラフを洗浄します。LBトラフにサブフェーズ溶液を満たし、トラフバリアを用いて洗浄します。次に、トラフを20 °Cで10分間安定させます。次に、サブフェーズ溶液に部分的に浸した傾斜ガラス棒を用いて、ファージ1 2600水懸濁液 300 µLを慎重に滴下し、LBサブフェーズ溶液上にファージ単分子層を形成させます。単分子層を10分間安定させた後、19 N/mの一定圧に達するまで、30 mm/minの速度で単分子層を圧縮します。垂直薄膜堆積はこの手順の中で最も困難な工程です。成功させるには、この手順で使用するすべてのコンポーネントが清潔であることを確認し、単分子層堆積パラメータを最適化する必要があります。次に、センサーを単分子層の中に7回連続で浸漬・抽出させ、4.5 millimeters per minuteの速度で垂直薄膜堆積を行います。垂直に配置されたQCMDセンサー上に行います。垂直薄膜堆積により、無傷のファージをバイオセンサー表面に結合させます。最後に、作製したファージバイオセンサーを用いてMRSA検出を行い、遊離ファージおよび結合ファージの両方について電子顕微鏡観察および電子オプトメトリーを実施します。qof Tソフトウェアを使用して、水中でQCMセンサーのベースライン、共振周波数およびエネルギー散逸を測定することからこのステップを開始します。約30分後、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（MSSA）の生菌細胞の水懸濁液をテストセルに流します。青色の線は周波数の値を、赤色の線はエネルギー散逸のレベルを示しています。水平線はベースラインの確立を示しています。画面中央の数字の2は、イベントがセンサーに関連していることを示しています。4つのうち2つの番号で、表示されている第1倍音におけるセンサーの共振周波数とエネルギー散逸の変化を継続的にモニタリングしています。細菌がテストセルを通過した後の変化がここに示されています。センサーの共振周波数と内部エネルギー散逸の変化が、PVP抗体結合ラテックス懸濁液の流速に対して飽和レベルに達すると、周波数の低下とエネルギー散逸の増加には数秒しかかからないことに注意してください。そして、周波数と散逸の連続的なモニタリングを継続します。ここに示されているのは、ベースラインの確立、細菌添加後の数秒間における周波数とエネルギー散逸の変化、飽和、そして最終的なビーズ添加後の変化を含む、検出プロセス全体です。この表は、ファージスポットテストによって示されたMRSA株を含むすべてのS reus試験株に対する、実証されたファージ溶菌活性を示しています。プラークのサイズは概して5〜15 mmの範囲でした。他の試験培養株に対しては、活性は認められませんでした。ここでは、37 °Cの振盪インキュベーター内におけるNZ Y培地でのstaphylococcus Urus A TCC 1 2600の正常な増殖を示しており、細菌数は3.2 × 10⁶から4.0 × 10⁸ CFU/mLまで増加しています。約24時間後、金表面に固定化されたファージは、懸濁状態のファージと同等の溶菌活性を示しました。固定化されたファージは、24時間の増殖実験に使用され、数回の洗浄を経て、4 °CのPBS中で6日間保存された後でも、新鮮な細菌への感染において感染性を維持していました。この画像では、金片の周囲に溶菌現象が観察されており、固定化されたファージが細菌細胞を溶菌させることが可能であることを示しています。したがって、ここで示されているように、細菌と固定化ファージの共培養で見られる細菌増殖の効果的な抑制は、水懸濁細菌と結合ファージの一次的な相互作用の結果です。ここでは、金基板表面上の完全な溶菌性ファージ 1 2600 の透過電子顕微鏡像および走査電子顕微鏡像を示しています。ファージ懸濁液にクロロホルム処理を施すと、ファージの尾部の長さが短縮して太くなり、多角形の頭部が丸みを帯びるかステロイド状になります。大幅な構造変化が見られたものの、プラーク数によって測定されたステロイドの溶菌活性は、クロロホルム処理の結果、変化しませんでした。溶菌性ファージを固定化したQCMセンサーをMRSAにさらした際、共振周波数またはエネルギー散逸に有意な変化は見られず、MRSAとファージの相互作用による質量変化はなかったことが示されました。しかしながら、QCMによれば、アッセイ後のバイオセンサーの電子顕微鏡写真において、センサー表面に顕著な細菌の結合が認められました。ファージステロイドバイオセンサーを用いたフローセルにMRSA懸濁液を注入すると、周波数の大幅な減少と散逸の増加が観察されました。ファージスフェロ細菌MRSAの結合相互作用の後、アッセイセンサーをBBP two A抗体結合ラテックス速度懸濁液にさらしました。これらのMRSAアッセイバイオセンサは、BPP two A抗体結合ラテックスビーズ懸濁液に対して応答し、周波数のさらなる低下と散逸の増加が観察されました。MSAとファージプローブおよびPPP two A抗体結合ラテックスビーズとの結合は、走査電子顕微鏡観察を用いて確認されました。ファージステロイドバイオセンサをMSSAに曝露したところ、ファージステロイドとMSSAの結合相互作用に伴い、周波数の大幅な低下と散逸の増加が観察されました。その後、アッセイセンサにPPP two A抗体結合ラテックスビーズ懸濁液を添加しました。当初、MSSAアッセイバイオセンサーでは、MSSAとPPP 2A抗体結合ラテックスビーズの相互作用後、数分間で周波数の上昇と散逸の低下という短期間の過渡的な変化が見られました。しかし、周波数はPVP 2A抗体導入後のレベルに戻り、一方でエネルギー散逸は増加しました。その後、走査電子顕微鏡を用いてMSSAのファージプローブへの結合を解析しましたが、MSSAとPPP 2A抗体結合ラテックスビーズとの間の結合は観察されませんでした。ここでは、溶菌性ファージのエリプソメトリックな厚さプロファイルと3D厚さマップを示します。厚さマップ上に線を引くことで、厚さプロファイルを作成しました。最後の画像は、A-Q-C-M-Dセンサの金表面に結合したファージによって捕捉されたMRSAの代表的なCCD光学カメラ画像と、10⁸ CFU/mLおよび10⁹ CFU/mLの濃度でファージを固定化したガラス基板上のMRSAの3D強度プロファイルを示しています。それぞれの円は単一の細菌を表しています。液体懸濁液中の細菌濃度を 10⁸ CFU/mL から 10⁹ CFU/mL に増加させると、3D強度プロファイルにおいて捕捉された細菌数が著しく増加することが明らかです。最上層の白いピークの数は捕捉された細菌数に比例しており、予想通り、細菌の曝露量を 10⁸ から 10⁹ CFU/mL に増やすと、ピークの密度が大幅に増加します。最下層の濃い青色の層は、金基板に接触しているファージ層に対応しています。より多くの細菌が捕捉されるにつれ、ファージが細菌に結合することで光学特性が変化し、より濃く、より強烈な青色になります。この手順に従うことで、開発後のファージと細菌の相互作用を理解するために、細菌捕捉効率を定義することができます。この手法は、細菌ファージ療法の分野の研究者が、動物およびヒトにおける病原体の抑制を探索するための道を開くものです。病原性細菌を用いて有機溶媒を扱う作業は非常に危険である可能性があるため、厳格な規制に従うことが極めて重要であることを忘れないでください。

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