抗生物質耐性ブドウ球菌の細菌の検出のためのバイオセンサー

以下の実験の全体的な目標は、特に選択された抗修飾溶解性細菌ファージにより、黄色ブドウ球菌のメチシリン耐性またはMRSAおよびメチシリン感受性、または黄色ブドウ球菌のMSSA株を区別することである。溶解性ファージの長くて柔軟な尾部に細菌が付着すると、付着した細胞とセンサー表面との距離は、QC mの音波の透過よりも大きくなります。したがって、バインディングイベントの信号は生成されません。

無傷のファージをスフェロイドに置き換えると、短い尾を持つ完全に機能するファージが得られ、QC mの音波の浸透深度内で細菌に結合するため、ファージステロイドがA-Q-C-M-D結晶に沈着し、混合細菌懸濁液にさらされると、黄色ブドウ球菌のMRSA株とMSSA株の両方に結合します。 しかし、黄色ブドウ球菌を結晶表面の他の細菌から分離する他の細菌はそうではありません。最後に、Mr.RSA特異的PPPの2つのA抗体結合ビーズを添加すると、黄色ブドウ球菌のMr.RSA株の存在下でシグナルが生成されます。PCRのような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、この方法がDNA抽出を必要とせず、経験に敏感ではないことです。

この方法は、黄色ブドウ球菌のスクリーニングと消毒に関する洞察を得ることができますが、他の抗生物質耐性菌にも適用できます。バイオセンサーの製造には精度、精度、忍耐力が必要なため、この方法を視覚的に実証することが重要です。まず、アルゴンヌで10分間プラズマエッチングすることにより、金コード化された石英片を洗浄し、その後、滅菌ペトリ皿の各ピースの金表面に50マイクロリットルのファージ懸濁液で滅菌した後、滅菌キャビネット内のUV光の下で6時間ピースを滅菌し、翌朝、室温の湿度の高いチャンバーで一晩インキュベートします。 滴定のために残りのファージ懸濁液を取り除き、次に各石英片を結合したファージでPBSで5回洗浄し、結合していないファージを取り除きます。

乾燥した表面で固定化されたファージの感染性をテストするには、まず黄色ブドウ球菌の培養物をNZY eRateに一晩広げ、懸濁液を乾燥させます。次に、固定化されたファージを下にして金でコーティングされたクォーツ片をプレートに置きます。摂氏37度で12時間後、感染性を示す溶解ゾーンが観察され、液体中の遊離ファージの溶解活性を試験できます。

まず、黄色ブドウ球菌の一晩の細菌培養物を、4つの300ミリリットルのサイドアームフラスコのそれぞれに10ミリリットルのNZYに加えます。次に、遊離ファージ1ミリリットルあたり6PFUに10の2倍をフラスコの2つに加えます。次に、ブドウ球菌細胞溶解の時間経過を、各フラスコの30分間隔での光学濃度測定により570分間監視し、24時間で最終測定を行います。

液体中で結合したファージの溶解活性をテストするには、先ほど示した手順を繰り返しますが、遊離ファージの代わりに結合ファージを含む金片を実験フラスコに追加します。ファージステロイドを調製するには、まず、400マイクロリットルのストックファージ1 2600懸濁液を等量のスペクトル光度グレードのクロロホルムと室温で1ミリリットルのバイアルに組み合わせます。次に、ファージクロロホルム懸濁液を5〜6回、1分間にわたって5秒間隔で穏やかにボルテックスします。

懸 ?? 液を30秒間安定させた後、ステロイド懸 ?? 液を含む上部画分を回収します。.ステロイド懸濁液の数マイクロリットルを500マイクロリットルのバイアルに移し、透過型および走査型電子顕微鏡検査を行います。残りのステロイド懸濁液をバイオセンサー製造用の1ミリリットルバイアルに保存します。

バイオセンサーを準備するには、まず、プラズマクリーナーでアルゴンにプラズマエッチングしてQCMDセンサーを洗浄します。次に、センサーをヘキサンですすいで、有機不純物を取り除きます。次に、Journal of Microbiological methodsでOlson Etalが以前に説明したように、フィルムバランスのトラフをクリーニングします。

LBトラフにサブフェーズ溶液を充填し、トラフバリアで洗浄します。次に、トラフを摂氏20度で10分間安定させます。次に、300マイクロリットルのEloquaのファージ1 2600水性懸濁液を慎重に滴下することにより、LB亜相溶液上にファージ単層を作成し、傾斜した食用ガラス棒を部分的にSOF相に浸します単層を10分間安定させた後、単層を毎分30ミリメートルの速度で圧縮し、1メートルあたり19ニュートンの一定の圧力が達成されるまで

垂直膜の堆積は、この手順の中で最も難しい部分です。成功を確実にするためには、この手順のすべてのコンポーネントがクリーンであり、単層蒸着パラメータを最適化する必要があります。次に、センサーを単層に7回連続して4.5mm/分ずつ浸漬して、垂直膜蒸着を行います。

垂直に配置されたQCMDセンサーの上。垂直膜堆積は、無傷のファージをバイオセンサー表面に結合します。最後に、遊離ファージと結合したファージの両方のMRSA検出電子顕微鏡およびエル検眼に、作製したファージバイオセンサーを使用します。

この手順は、qof Tソフトウェアを使用して、水中のQCMセンサーのベースライン、共振周波数、およびエネルギー散逸を確立することから始めます。約30分後、試験細胞を通して水中の生きたメチシリン感受性黄色ブドウ球菌またはMSSA細菌細胞の懸濁液を引き出します。青い線は周波数値を示し、赤い線はエネルギー散逸のレベルを示します。

水平線は、ベースラインの確立を示します。画面中央の数字の 2 は、イベントがセンサーに関連していることを示します。4つのうち2番目は、最初に示された倍音について、センサーの共振周波数とエネルギー散逸の変化を継続的に監視します。

細菌が試験細胞を通過した後の変化は次のとおりです。センサーの共振周波数と内部エネルギー散逸の変化がPVP抗体の懸濁液で飽和レベルに達すると、周波数が減少し、エネルギー散逸が増加するのに数秒しかかからないことに注意してください。ここに示されているのは、ベースラインの確立、バクテリアを追加した後の周波数とエネルギー散逸の数秒の変化、飽和、そして最後にビーズの追加後の変化を示す検出プロセス全体を示しています。

この表は、ファージスポット試験で示されるMRSA株を含む、S reusのすべての試験株に対する実証されたファージ溶解活性を示しています。プラークのサイズは一般に5〜15ミリメートルの範囲でした。他の試験培養に対する活性は認められませんでした。

ここでは、摂氏37度のシェーカーインキュベーター上のNZ Y培地でのブドウ球菌Urus A TCC 1 2600の正常な増殖が、細菌の数が10の3.2倍から10の6倍、4.0倍、10倍、1ミリリットルあたり8CFUに増加することを示しています。約24時間で、金表面に固定化されたファージは、懸濁液中のファージの活性と同様の溶解活性を示しました。固定化されたファージは、24時間の増殖実験、数回の洗浄、および摂氏4度でのPBSでの6日間の保存で使用した後でも、新鮮な細菌感染に対して感染性を維持しました。

この画像では、金片の周りのリソソームが観察でき、固定化されたファージが細菌細胞を溶解する能力があることを示しています。したがって、ここに示すように、細菌と動員解除されたファージの共培養で見られる細菌増殖の効果的な減少は、水懸濁細菌と結合したファージの主要な相互作用の結果です。ここでは、ファージ懸濁液をクロロホルム処理に供すると、フィージの尾部が長さが収縮して肥厚し、多角形の頭部が丸みを帯びた、またはステロイド状になるときに、金基板表面上の無傷の溶解性ファージ1 2600の透過型および走査型電子顕微鏡写真が示されている。

大幅な構造変更にもかかわらず。プラーク番号で測定されるステロイドの溶解活性は、クロロホルム治療の結果として変化しませんでした。固定化された溶解性ファージを備えたQCMセンサーは、MRSAに曝露されたときに共鳴周波数またはエネルギー散逸に有意な変化を示さず、MRSAファージ相互作用がノム質量変化をもたらしたことを示しました。

しかし、QCMによると、アッセイ後のバイオセンサーの電子顕微鏡写真では、センサー表面に有意な細菌の結合が明らかになりました。MRSA懸濁液をファージステロイドバイオセンサーを使用してフローセルに注入すると、頻度の大幅な減少と散逸の増加が観察されました。ファージスフェロ細菌MRSA結合相互作用に続いて、アッセイセンサーをBBP 2 A抗体標識ラテックス速度懸濁液に曝露しました。

これらのMRSAアッセイバイオセンサーは、BPP 2 A抗体標識ラテックス速度懸濁液に応答し、頻度のさらなる減少と散逸の増加が観察されました。MSAのファージプローブおよびPPP 2 A抗体標識ラテックス速度への結合は、走査型電子顕微鏡法を用いて確認されました。ファージステロイドバイオセンサーをMSSAに曝露したとき、ファージステロイドMSSA結合相互作用に続いて周波数の大幅な減少と散逸の増加が観察され、アッセイセンサーにPPP 2 A抗体標識ラテックス速度懸濁液を投与しました。

最初に、MSSAアッセイバイオセンサーは、MSSAおよびPPPの2つのA抗体結合ラテックス速度相互作用の数分後に、周波数の増加と散逸の減少の短い過渡性を示しました。しかし、頻度はPVP後の2つのA抗体導入レベルに戻りますが、デシエネルギーは増加しました。次に、MSSAのファージプローブへの結合を走査型電子顕微鏡で解析しましたが、MSSAとPPPとの間には結合は観察されず、ここでは2つのA抗体標識ラテックス速度が観察されず、楕円対称的な厚さプロファイルと溶解性ファージの3D厚さマップが示されています。

厚さマップを横切る線を引いて、厚さプロファイルを生成しました。これらの最後の画像は、A-Q-C-M-Dセンサーの金表面に結合したファージによって捕捉されたMRSAの代表的なCCD光学カメラ画像と、1ミリリットルあたり10〜8CFU、1ミリリットルあたり10〜9CFUの濃度でファージ固定化ガラス基板上のMRSAの3D強度プロファイルを示しています。各丸い円は単一の細菌を表します。

液体懸濁液中の細菌濃度が10から8CFU/mlに増加し、10から9CFU/mlに増加すると、3D強度プロファイルで捕捉された細菌が大幅に増加することは明らかです。最上層の白いピークの数は捕捉された細菌の数に比例し、予想通り、細菌の曝露が10から8、10、9CFUに増加すると、ピークの密度は大幅に増加します。下部の濃い青色の層は、金基板と接触するファージ層に対応します。

より多くの細菌が捕捉されると、ファージの光学特性が変化して細菌と結合し、より暗く、より強い青色になります。この手順に従うと、開発後のファージ細菌の相互作用を理解するために、細菌捕捉効率を定義できます。この技術は、細菌ファージ療法の分野の研究者が動物や人間の病原体阻害を探求する方法を示しています 病原性細菌の有機溶媒を扱うことは非常に危険であり、厳格な規制に従うことが非常に重要であることを忘れないでください。