Name: 生殖様細胞に新生マウス皮膚由来幹細胞の分化インビトロ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 学ぶ新生マウス皮膚由来幹細胞から卵母細胞様細胞への分化誘導法。定義培地で培養し、卵母細胞特異的マーカー発現をPCRで評価する技術を解説。生殖生物学研究に有用です。

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PWDは、ウエスタン大学のジェラルドM.キダーにヘルスリサーチフェローシップ（CIHR）とCIHR助成のカナダの協会によってサポートされています。著者はまた、ここで提示されたプロトコルの開発を支援するためのゲルフ大学でJulang李を承認したいと思います。

1。メディアの準備<ol><li>実験が行われる細胞培養インキュベーターで緩めキャップを使用し、場所の前にメディア2-3時間を準備します。現在のプロトコルで使用されるメディア： <ol><li> 1×B27、40 ngの/ mlのbFGFを、および20 ngの/ mlのEGFを補ったDMEM/F12から成る細胞培地を食い止める準備。 </li><li> 0.05 IUのFSH、0.03 IU LH、3 mg / mlのBSA、5μL/ mlのITS、0.23 mMのピルビン酸ナトリウム、1 mg / mlのフェツイン、および1 ngの/ mlのEGFを補ったM199から成る生殖細胞分化培地を準備します。全ての添加剤から構成されるが、FSHを省く基本培地は、LHおよびEGF℃で最大一週間のために準備し、4℃で保存することができます。 </li></ol></li></ol> 2。細胞培養の準備を食い止める<ol><li>以前に12を説明したように生まれたばかりの仔マウスから幹細胞を分離します。 インビトロ生殖細胞分化のための通路2-4で幹細胞を利用する。の効率OLC形成を直接開始幹細胞の質に関連している。それは、すぐに人口が通路2付近で、一般的になっている清潔で健康な表示される分化を開始するのが最善です。一節過去さらに培養幹細胞2悪影響OLC形成効率を（未発表結果）に影響します。 </li><li>従来のサブ培養幹細胞を分化を開始する48時間。すべて中断球状細胞凝集体を取り外し、血清ピペットを用いて、培養皿からメディアを費やし、、15 mlチューブで開催。それだけでサスペンド球状の細胞の集合体ではなく自発的に差別されているお皿の底に付着した細胞を回収することが重要です。 </li><li>ペレットを5分間500 xgで細胞。、上清を捨て、新鮮な幹細胞培地を500μlに再懸濁し、37℃に温め優しく部分の細胞を解離する凝集体をピペット。積極的に細胞をピペッティングしないでくださいこのようなsが細胞生存率が低下します。低アタッチメント10センチ細胞培養皿に新鮮予め温めておいた幹細胞培地の9.5ミリリットルに部分的に解離された細胞を洗浄します。 </li><li>分化の開始前に48時間37℃、5％CO 2細胞培養インキュベーターに細胞を返す。 </li></ol> 3。 OLC分化<ol><li>を15mlチューブに培養皿と場所から幹細胞を除去する血清用ピペットを使用して、接続されているすべてのセルを残す。ペレットを500μlの滅菌PBSで500×gで再懸濁しの細胞。活発なピペット広いを用いて細胞は10〜20セルより大きくない塊に1,000μlの先端を産んだ。定期的に解離の際、細胞の小さな量を削除し、集約された細胞が10〜20個々の細胞の塊である確認のため白色光顕微鏡下で確認してください。解離にわたり減少、細胞の生存率になります。 </li><li>解離細胞は9.5 mlのPBSを加え、1を追加細胞計数のために血球計数器にこの細胞懸濁液5μlの。 5分間500×gでペレットは、細胞。 </li><li> 1.32X10 6細胞/分化培地におけるmlの濃度で細胞を再懸濁する。 </li><li> 500μlのウェルあたりに平底24ウェルサスペンション皿を追加することにより、プレートの細胞を。 </li><li> 48時間、5％CO 2で37℃細胞培養インキュベーターに24ウェルディッシュ°Cを置きます。それに応じてラベル1.5mlチューブで各ウェル場所から250μlの培地を除去。各ウェルに250μlの新鮮な分化培地を追加します。 5分間500 xgで過ごした培地を遠心分離。し、上清を捨てる。 50μlの新鮮な分化培地における任意のペレット化した細胞を再懸濁しと分化プレートにうまく対応する文化に戻ります。 </li><li>すべての48時間は、分化の12日目に半分の培地を変更してください。 </li></ol>

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</ol>

利害の衝突は宣言されていない。

官能OLCsを最新の状態にすると、in vitroアッセイを使用して完全に開発されていない。最近、林らによる研究は、in vitroで形成されており、さらなる開発14 インビボで導入細胞PGC-等から子孫を産生することができた。それらはインビボで移植後に回収し、細胞のようPGCを形成することができたES細胞または人工多能性細胞で始まるが、成熟受精、および子孫14を生成するために使用することができた。これは、様々なソースからの幹細胞は、卵母細胞の機能を形成する可能性を、適切な条件下で、持っていることを示している。 培養システムの特定の側面は、それが機能するために重要である。幹細胞を単離するために利用されたマウスの歪みが非常に重要である。このプロトコルは、ジャクソンラボ（在庫＃008214）からB6マウスと開発され、使用されました。これらのマウスは、VIは許可のOct4-EGFP遺伝子を運ぶEGFPタンパク質を介してのOct4を発現する細胞のualiza...

初期胚発生時には、配偶子形成は性腺尾根の始原生殖細胞（PGC）の形成、移行、および最終的に植民地化を含む一連の段階を介して行われます。この時間の間のPGCがますます成熟配偶子1に増殖および分化を受ける。始原生殖細胞は胚の後腸に尿膜のベースから、最終的には最終的には性腺尾根に定着背壁に沿って移動しているという事実には、2を勉強するには、それらを非常に困難になります。分野における進歩にもかかわらず、PGCの形成および分化を理解しようとする研究は、その限られた数、位置、渡り鳥自然3,4によって妨げてきた。 近年、胚性幹細胞は、 インビトロ 5,6 の生殖細胞を形成する電位を有することが示されている。同様に、いくつかの体性幹細胞は、生殖細胞のfollのを形成する可能性を有することが示されている体外培養7-11 のおかげ。最近生まれたばかりのマウスの皮膚から単離された細胞を幹生殖細胞様細胞と初期段階の卵母細胞12にin vitroで分化させた。分化中のOct4を発現する幹細胞のサブセットが増加し、構造が類似している卵丘 - 卵母細胞複合体を形成した。卵母細胞様細胞（OLCs）培養物から採取し、天然の卵母細胞と比較することができる。 40-45程度を測定するこの培養方法のOLCsを使用して得られるようGdf9b、VASA、そしてDAZLなどの卵母細胞に発現する類似のマーカー。現在までに生じOLCsが成熟することができないまま、12を受精する。 OLCsは、これらのOLCsを形成するために使用されるプロトコルは、依然として内の初期段階の生殖細胞の形成と発展を研究するためのアッセイとして有用性を有することができる機能することができないままであるが、インビトロ系で閉じた。そうからOLCsの形成を議論初版発行マチック幹細胞は、幹細胞源8として胎児のブタ皮膚を利用した。分化誘導時に早期に形成されたPGC様細胞は、OCT4としてOLCsと急行などPGCマーカーにVASA、STELLA、C-KIT、及びDAZL 13の前駆体であることが示されたその研究に拡大。このデータは、in vitroでの生殖細胞の形成と分化を研究するために、このシステムを利用する可能性をサポートしています。新生児マウスの皮膚からOLCsを形成するために利用プロトコルはこのビデオの記事で実証される。このプロトコルは、in vitroモデルにおけるそれらの増殖および分化に重要な要素を明らかにするための手段を提供することができる生殖細胞の発達を研究するために提供する。

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12500</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0266</td><td></td></tr><tr><td>ITS</td><td>Invitrogen</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-6003</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td></td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Fetuin</td><td>Sigma</td><td>F3385</td><td></td></tr><tr><td>FSH</td><td>Sioux Biochemicals</td><td>915</td><td></td></tr><tr><td>LH</td><td>Sioux Biochemicals</td><td>925</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Invitrogen</td><td>31100-035</td><td></td></tr><tr><td>24 well plates</td><td>Nunc</td><td>144530</td><td></td></tr><tr><td>10 cm dishes</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>15 mlチューブBD</td><td></td><td>352095</td><td></td></tr></tbody></table>

生殖様細胞に新生マウス皮膚由来幹細胞の分化<em&gt;インビトロ</em

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

生殖細胞の形成と分化を研究することは、伝統的に低い細胞数と途上胚奥深くその場所のために非常に困難であった。 試験管ベースのシステムで 、 &quot;クローズド&quot;の可用性は、配偶子形成の我々の理解のための貴重な証明することができた。新生児マウス皮膚から単離された体性幹細胞から卵​​母細胞様細胞（OLCs）の形成が実証されており、このビデオプロトコルで可視化することができる。結果OLCsはそのようなのOct4、ヴァーサ、BMP15、そしてSCP3として卵母細胞と一致し、様々なマーカーを発現する。しかし、彼らは成熟や減数分裂を完了するために、障害のために受精を受けることができないままです。このプロトコルは、より成熟した配偶子に生殖細胞の初期段階の形成と分化を研究するために有用であるシステムを提供します。初期の分化の間のOct4（電位生殖細胞様細胞）を発現する細胞の数をfしかしながら、現在、約5％に達するOLCsのormationは比較的非効率的なままです。特別な注意を出発細胞集団の健康と早いパッセージであることを確認するために取られるべきであるにもかかわらずプロトコルは比較的単純です。

最初に細胞が培養皿の底に付着すると広がる。分化小さな浮遊OCT4陽性細胞に42から72時間後に形成し、増殖する（ 図1A）。まもなくこれらの細胞の可視化後大半が消え、付着した細胞は、培養底に密集コロニー凝集体を形成します。数日の後、これらの凝集体は、培養表面からデタッチします。これらの凝集体のいくつかにおいて大きなセル（ 図1bおよび図1c）を観察することができる。初期視覚化されると細胞は直径〜35μmとなります。継続的な文化とOLCsは直径〜45ミクロンに達するために成長します。これらはOLCsあるとサポート細胞を採取したり（ 図1d）が付属し、他のセルなしでOLCsを得るためにトリプシン処理することができます。 OLCsは自然卵母細胞と同様の転写物を発現することを確認するためには、OLCsために収集し、試験することができるZPC、SCP3、CMOSのOct4、BMP15、とヴァーサのようなマーカーの発現。 ...

近年、インビトロ培養法において用い生殖細胞の形成は、体性幹細胞のいくつかの異なるタイプを使用して実証されている。この記事では、視覚的に早期の卵母細胞様細胞に新生マウス由来幹細胞の分化を紹介します。

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

本実験の全体的な目的は、体細胞である皮膚由来の幹細胞を用いて卵母細胞様細胞を形成することです。これは、新生マウスの皮膚から得られた、分化していないクリーンな幹細胞を利用することで達成されます。第2段階として、幹細胞を単一細胞に解離させ、分化に向けた準備を行います。次に、幹細胞を規定の分化培地に播種します。生殖細胞形成を誘導し、セミクオンティタティブ（半定量）リアルタイムPCRに基づいて卵母細胞特異的マーカーの発現を示す結果を得ます。この手法は、生殖生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。生殖細胞、eSightの形成および発生を研究するための閉鎖系を提供することで、プロトコルに必要なすべての培地は、使用の2〜3時間前に調製し、実験を行う細胞培養インキュベーター内にキャップを緩めた状態で配置しておく必要があります。ここで使用する2種類の培地は、D-M-A-M-F 12にB 27、BFGF、およびEGFを添加した幹細胞培地と、M1 99にFSH、LH、B-S-A-I-T-S、ピルビン酸ナトリウム、tuin、およびEGFを添加した生殖細胞分化培地です。新生マウスから単離した幹細胞を使用します。in vitroでの生殖細胞分化には、継代2回から4回のパップ（Pups）を使用します。細胞様細胞（cyte like cell）またはOLCの形成効率は、開始時の幹細胞の質に直接的に依存するため、細胞集団が清潔で健康的であると判断された時点で速やかに分化を開始させるのが最善であり、通常は継代2回頃となります。分化開始の48時間前に、セロロジカルピペットを用いて幹細胞を継代し、培養皿から浮遊している球状の細胞凝集塊と使用済みの培地をすべて回収して、15 mLチューブに移します。この際、培養皿の底に付着し、自然分化している細胞ではなく、浮遊している球状の細胞凝集塊のみを回収することが重要です。細胞を500 ×gで5分間遠心分離してペレットとし、上清を捨てた後、500 µLの新鮮な幹細胞培地で再懸濁します。37 °Cまで温めます。凝集塊を緩やかにピペッティングし、細胞を部分的に解離させます。細胞生存率が低下するため、激しくピペッティングしないでください。部分的に解離した細胞を、低接着性の10 cm細胞培養皿上で、あらかじめ温めておいた新鮮な幹細胞培地 9.5 mLを用いて洗浄します。その後、細胞を37 °C、5% CO2の細胞培養インキュベーターに戻し、48時間培養します。OLC分化の手順を開始するため、セロロジカルピペットを用いて培養皿から幹細胞を回収し、15 mLチューブに移します。接着細胞はそのまま残してください。500 ×gで5分間遠心して細胞をペレット化し、上清を除去した後、500 µLの滅菌PBSで細胞を再懸濁します。ワイドボアの1000 µLチップを用いて激しくピペッティングし、細胞を10〜20個以上の大きな塊にならないよう分散させます。本プロトコルを成功させるには、解離中に適切なレベルが得られているかを確認するため、定期的に解離状態をチェックすることが不可欠です。定期的に少量の細胞を採取し、白色光顕微鏡下で観察して、凝集した細胞が10から20個の個々の細胞の塊になっていることを確認してください。細胞の過剰な解離は細胞生存率の低下を招くため、避けてください。次に、解離した細胞に9.5 millilitersのPBSを加え、この細胞懸濁液を15 microliters分ヘモサイトメーターに転移して細胞数を計測します。500 times Gで5分間遠心分離して細胞をペレット化します。上清を除去した後、分化培地を用いて細胞を1.32 times 10 to the sixth cells per milliliterの濃度に再懸濁します。平底の24ウェル懸濁培養プレートの各ウェルに細胞を500 µLずつ分注します。この24ウェルプレートを、37 °C、5% CO2の細胞培養インキュベーター内で48時間培養します。48時間後、各ウェルから培地250 µLを取り出し、対応するラベルを貼った1.5 mLチューブに移します。各ウェルに250 µLの新鮮な分化培地を加え、使用済みの培地を500 ×gで5分間遠心分離します。上清を捨て、ペレット化した細胞を50 µLの新鮮な分化培地で再懸濁します。細胞懸濁液を分化プレートの対応する培養ウェルに戻します。分化12日目まで、48時間ごとに同様の方法で培地の半分を交換します。分化の初期段階において、細胞は培養皿の底面に付着し、広がります。この代表的な画像は、分化開始から42時間から72時間後の、OCT4陽性の細胞を示しています。未分化幹細胞のマーカーを緑色で示し、核をHoechstで対比染色して青色で示しています。分化が進むにつれて、緑色で示されるOCT4陽性細胞に囲まれた、OCT4陰性細胞を含むいくつかの細胞凝集塊が観察されます。この画像のスケールバーは100 µmです。この図は、培養表面から剥離させた後の卵胞様構造の白色光画像であり、スケールバーは40 µmを表しています。培養を継続すると、LCSは約45 µmの直径まで成長します。この画像のスケールバーは10 µmを示しています。OCT4陽性の巨大LCSが、細胞に囲まれているか、あるいは培養液中に単独で存在しているのが確認できます。これらのLCSは、支持細胞と共に回収するか、あるいはトリプシン処理によって他の細胞が付着していない状態で回収することができます。LCSが天然の卵巣部位と同様の転写物を発現しているかを確認するため、LCSを回収し、ZPC、SCPP1、Cyp19a1などの共通の卵巣部位マーカー、および BMP15、vasaの発現を検証しました。本図は、10個のLCSにおけるこれらのマーカーの転写物レベルを、10個の新生マウス卵母細胞と比較して示したものです。結果から、LCSはcytesよりもZPCの発現が少ないことが示されました。ZPCはCYTE特有のzop lucidum膜構造の構成成分であるため、これがlcsの膜の脆弱性とzita膜の薄さの原因であると考えられます。減数分裂に関与するSCP threeの発現は、天然のcytesと比較してLCSでより高くなっていました。しかしながら、別の減数分裂マーカーであるCMOsは、より低いレベルで発現しています。この発現レベルの不一致が、現在のLCSにおける減数分裂完了の失敗を部分的に説明している可能性があります。BMP 15やvasaなどの他のマーカーについては、lcsとO部位の間で有意な差は見られません。この手順を試みる際は、出発点となる幹細胞集団の健全性が成功の鍵となることを忘れないでください。

differentiation-newborn-mouse-skin-derived-stem-cells-into-germ-like

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生物学

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