生殖様細胞に新生マウス皮膚由来幹細胞の分化

本実験の全体的な目的は、体細胞である皮膚由来の幹細胞を用いて卵母細胞様細胞を形成することです。これは、新生マウスの皮膚から得られた、分化していないクリーンな幹細胞を利用することで達成されます。第2段階として、幹細胞を単一細胞に解離させ、分化に向けた準備を行います。

次に、幹細胞を規定の分化培地に播種します。生殖細胞形成を誘導し、セミクオンティタティブ（半定量）リアルタイムPCRに基づいて卵母細胞特異的マーカーの発現を示す結果を得ます。この手法は、生殖生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。

生殖細胞、eSightの形成および発生を研究するための閉鎖系を提供することで、プロトコルに必要なすべての培地は、使用の2〜3時間前に調製し、実験を行う細胞培養インキュベーター内にキャップを緩めた状態で配置しておく必要があります。ここで使用する2種類の培地は、D-M-A-M-F 12にB 27、BFGF、およびEGFを添加した幹細胞培地と、M1 99にFSH、LH、B-S-A-I-T-S、ピルビン酸ナトリウム、tuin、およびEGFを添加した生殖細胞分化培地です。新生マウスから単離した幹細胞を使用します。

in vitroでの生殖細胞分化には、継代2回から4回のパップ（Pups）を使用します。細胞様細胞（cyte like cell）またはOLCの形成効率は、開始時の幹細胞の質に直接的に依存するため、細胞集団が清潔で健康的であると判断された時点で速やかに分化を開始させるのが最善であり、通常は継代2回頃となります。分化開始の48時間前に、セロロジカルピペットを用いて幹細胞を継代し、培養皿から浮遊している球状の細胞凝集塊と使用済みの培地をすべて回収して、15 mLチューブに移します。この際、培養皿の底に付着し、自然分化している細胞ではなく、浮遊している球状の細胞凝集塊のみを回収することが重要です。

細胞を500 ×gで5分間遠心分離してペレットとし、上清を捨てた後、500 µLの新鮮な幹細胞培地で再懸濁します。37 °Cまで温めます。凝集塊を緩やかにピペッティングし、細胞を部分的に解離させます。

細胞生存率が低下するため、激しくピペッティングしないでください。部分的に解離した細胞を、低接着性の10 cm細胞培養皿上で、あらかじめ温めておいた新鮮な幹細胞培地 9.5 mLを用いて洗浄します。その後、細胞を37 °C、5% CO2の細胞培養インキュベーターに戻し、48時間培養します。

OLC分化の手順を開始するため、セロロジカルピペットを用いて培養皿から幹細胞を回収し、15 mLチューブに移します。接着細胞はそのまま残してください。500 ×gで5分間遠心して細胞をペレット化し、上清を除去した後、500 µLの滅菌PBSで細胞を再懸濁します。ワイドボアの1000 µLチップを用いて激しくピペッティングし、細胞を10〜20個以上の大きな塊にならないよう分散させます。

本プロトコルを成功させるには、解離中に適切なレベルが得られているかを確認するため、定期的に解離状態をチェックすることが不可欠です。定期的に少量の細胞を採取し、白色光顕微鏡下で観察して、凝集した細胞が10から20個の個々の細胞の塊になっていることを確認してください。細胞の過剰な解離は細胞生存率の低下を招くため、避けてください。

次に、解離した細胞に9.5 millilitersのPBSを加え、この細胞懸濁液を15 microliters分ヘモサイトメーターに転移して細胞数を計測します。500 times Gで5分間遠心分離して細胞をペレット化します。上清を除去した後、分化培地を用いて細胞を1.32 times 10 to the sixth cells per milliliterの濃度に再懸濁します。

平底の24ウェル懸濁培養プレートの各ウェルに細胞を500 µLずつ分注します。この24ウェルプレートを、37 °C、5% CO2の細胞培養インキュベーター内で48時間培養します。48時間後、各ウェルから培地250 µLを取り出し、対応するラベルを貼った1.5 mLチューブに移します。

各ウェルに250 µLの新鮮な分化培地を加え、使用済みの培地を500 ×gで5分間遠心分離します。上清を捨て、ペレット化した細胞を50 µLの新鮮な分化培地で再懸濁します。細胞懸濁液を分化プレートの対応する培養ウェルに戻します。分化12日目まで、48時間ごとに同様の方法で培地の半分を交換します。

分化の初期段階において、細胞は培養皿の底面に付着し、広がります。この代表的な画像は、分化開始から42時間から72時間後の、OCT4陽性の細胞を示しています。未分化幹細胞のマーカーを緑色で示し、核をHoechstで対比染色して青色で示しています。

分化が進むにつれて、緑色で示されるOCT4陽性細胞に囲まれた、OCT4陰性細胞を含むいくつかの細胞凝集塊が観察されます。この画像のスケールバーは100 µmです。この図は、培養表面から剥離させた後の卵胞様構造の白色光画像であり、スケールバーは40 µmを表しています。

培養を継続すると、LCSは約45 µmの直径まで成長します。この画像のスケールバーは10 µmを示しています。OCT4陽性の巨大LCSが、細胞に囲まれているか、あるいは培養液中に単独で存在しているのが確認できます。

これらのLCSは、支持細胞と共に回収するか、あるいはトリプシン処理によって他の細胞が付着していない状態で回収することができます。LCSが天然の卵巣部位と同様の転写物を発現しているかを確認するため、LCSを回収し、ZPC、SCPP1、Cyp19a1などの共通の卵巣部位マーカー、および BMP15、vasaの発現を検証しました。本図は、10個のLCSにおけるこれらのマーカーの転写物レベルを、10個の新生マウス卵母細胞と比較して示したものです。

結果から、LCSはcytesよりもZPCの発現が少ないことが示されました。ZPCはCYTE特有のzop lucidum膜構造の構成成分であるため、これがlcsの膜の脆弱性とzita膜の薄さの原因であると考えられます。減数分裂に関与するSCP threeの発現は、天然のcytesと比較してLCSでより高くなっていました。

しかしながら、別の減数分裂マーカーであるCMOsは、より低いレベルで発現しています。この発現レベルの不一致が、現在のLCSにおける減数分裂完了の失敗を部分的に説明している可能性があります。BMP 15やvasaなどの他のマーカーについては、lcsとO部位の間で有意な差は見られません。

この手順を試みる際は、出発点となる幹細胞集団の健全性が成功の鍵となることを忘れないでください。