2013年6月27日
本論文では、原子間力顕微鏡(AFM)を用いて、microindentationにより、生きた細胞の機械的性質を特徴づけるためのプロトコルを示しています。
次の実験の全体的な目標は、原子間力顕微鏡を使用して生細胞の弾性率を測定することです。これは、最初にセル上のさまざまな場所でFM力分光測定を実行することによって達成されます。2番目のステップとして、すべての強制距離曲線が解析され、A FMチップが最初にセルに接触するポイントが決定されます。
次に、接触点から始めて、最初の200〜300ナノメートルのインデンテーションデータをヘルツモデルに適合させます。弾性率を抽出するために、結果は、各ピクセルが単一の強制距離曲線を表すフォースマッピングモードを使用して得られたセル剛性の2Dマップを生成します。この手順を開始するには、カンチレバーホルダーを70%エタノールで洗浄し、乾かします。
次に、メーカーの指示に従って、bru DNP 10カンチレバーをAFMにロードします。次に、逆光学レバー感度を校正します。このパラメータは、フォトダイオードの応答量をカンチレバーのたわみのナノメートルあたりのボルト数で表します。
これを達成するには、まずきれいなスライドガラスをサンプルステージにロードします。a FMヘッドを取り付け、製造元の指示に従ってレーザービームと位置合わせを調整します。位置合わせが完了したら、P eight Oを引き抜いた状態で、スライドガラスにAFMチップをかみ合わせます。
ミラーをマイナス2ボルトのフォトダイオードの読み取り値に再調整します。次に、最大フォトダイオード応答または正2ボルトのトリガーポイントで力分光測定を実行します。データ取得が完了したら、力曲線の固い接触領域にズームインし、この領域に線形フィットを実行します。
傾きをボルト/ナノメートルで求めるには、ミラーの位置合わせを0ボルトの自由たわみにリセットします。次に、levy と Malam によって記述された熱調整法を使用して、カンチレバーのばね定数を較正します。まず、スキャナーをサンプルステージから離して、チップとサンプルの間に相互作用がないようにします。
次に、カンチレバービームの熱振動を記録して熱データを取得します。A FMソフトウェアは、このような熱振動のパワースペクトルを解析し、データウィンドウにプロットします。次に、最低周波数 (基本共振ピークとも呼ばれる) を中心とするデータ セグメントに近似を実行して、ばね定数を決定します。
カルチャープレート用のFMを準備するには、FMステージにディッシュヒーターアクセサリーを取り付け、温度を摂氏37度に設定します。システムが安定した熱平衡に達するまで20分待ちます。予熱したら、FMステージに培養皿を置き、30分以上の測定のために皿ヒーターに付属のクランプを使用して固定し、二酸化炭素に依存しない培地を使用して通常の培地を置き換える必要があります。
次に、A FMカンチレバーの先端に37°Cの培地を少量滴下し、先端がちょうど液体に沈むまでA FMヘッドを下げます。上面図のCCDカメラを使用して、カンチレバーのレーザービームを再調整します。液体中の整列は、媒体の屈折率の変化により、空気とは異なります。
位置合わせが完了したら、培養皿の無細胞領域にA FMチップをかみ合わせ、液体環境で逆光学レバー感度のキャリブレーションを行います。細胞の機械的特性測定を開始するには、光学顕微鏡を使用して、カンチレバーの先端を細胞のperle眼領域の上に配置します。カンチレバーの位置の正確な調整は、XスキャナーとYスキャナーにオフセットを適用することで実現されます。
次に、a FMを4つの分光モードに切り替え、インデント率を毎秒5マイクロメートルに設定します。これは、流体力学的影響を回避するのに十分な低さです。次に、たわみトリガーポイントを2ナノニュートンに設定します。細胞の損傷を避けるために、サンプルの剛性に応じてこの値を調整します。
さらに、相対トリガオプションを選択すると、偏向信号のドリフトが補正されます。次に、力の距離を5マイクロメートルに設定して、力の測定の間に先端がセルから完全に離れるようにします。各条件について、少なくとも30個の細胞の核領域の異なる位置に3つの力曲線を収集します。
ただし、各セルで複数の曲線を取ることは有益です。信頼性の高い統計データを得るためには、取得しすぎると、A FMプローブによる苦痛により細胞の硬さが変化する可能性があります。フォースマップモードを使用して、単一セル全体の機械的特性の分布をさらに特徴付けます。
フォースマップモードでは、スキャンサイズを30マイクロメートルに、解像度を32 x 32に設定し、インデントパラメータは単一のフォースカーブで選択したものと同じです。次に、A FMは、サンプル領域の各ピクセルで単一のフォースカーブを取得し、領域全体の剛性マップを提供します。次に、記録された力曲線を MATLAB を使用して解析し、セルの剛性を計算します。
まず、Lynette Alが最初に発表したアルゴリズムを採用し、matlabを使用して各点から線形近似とヘルツ近似の両方を計算します。両方の近似の相対 RMS 誤差を計算し、各点でこれらの値を合計します。最小の合計フィッティング誤差を達成する点は、この点を特定する最初の接触点として選択されます 細胞のヤング率の正確な測定にとって重要です。
次に、サンプルの変形デルタを計算します。次の式をセル接触前の変形でゼロに等しく、Z は Z より小さく、カンチレバーの変形 D と接触点を過ぎた合計距離 Z との差に等しくなります。次に、セル接触前の力がゼロに等しい場合、ZがZより小さく、カンチレバーのばね定数Kに接触点を過ぎたカンチレバーのたわみを掛けたものに等しい場合、次の式を使用してインデント力Fを計算します。
次に、Elise squareのフィットをヘルツモデルの接触後領域のサンプル変形とインデント力のデータに適用し、示されている先端の形状に基づいてセルのヤング率を抽出します。これは、3つの異なる表面で培養された3つのT、3つのファイバーブラスト細胞から得られた代表的な力曲線です。ここでわかるように、表面の違いが細胞骨格の硬さに大きく影響します。
硬質プラスチック表面で培養した細胞の平均変形を赤色で示しています。硬いポリアクリルアミドゲルで成長したものは紫色で、弾性のあるポリアクリルアミドゲルで成長したものは青色で示されています。曲線の接触点を慎重に特定すると、細胞変形の関数としてのインデント力を正確に示すことができます。
さらに、彼らのヤングのモジュラーは、接触後の最初の300ナノメートルのくぼみから正確に計算することができます。ここに示されているのは、中間フィラメントの一種である緑色蛍光タンパク質タグ付きメントンをトランスフェクションした線維芽細胞です。画像が明るいほど、その領域にはマントンが多く含まれています。
これは、細胞細胞骨格の硬さに関連している可能性があります。ここで紹介するA FMフォースマッピング技術を使用すると、各ピクセルが2.5 x 2.5ミクロンのセル表面積を表す32 x 32ピクセルの解像度でファイバーブラストの同様の剛性マップを示すことができます。このビデオを見た後、原子間力顕微鏡を使用して生体組織細胞の弾力性を測定する方法についての良いアイデアが得られます。
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この論文では、原子間力顕微鏡(AFM)を用いたマイクロインデンテーションによって、生体細胞の機械的特性を特徴付けるプロトコルを示しています。この研究は、力分光法とデータ分析を通じて生体細胞の弾性率を測定することに焦点を当てています。
Quantitative measurement of cell mechanical properties using atomic force microscopy (AFM) enables biopharma teams to assess cellular responses to microenvironmental changes, supporting early discovery and target validation. Reliable stiffness mapping informs mechanistic de-risking and predictive confidence in disease-relevant systems, directly impacting portfolio triage and translational research. Integrating AFM-based elasticity measurements strengthens decision-making at key inflection points in the discovery pipeline.
AFM-based cell stiffness measurement fits within the early discovery to preclinical continuum, providing a bridge between mechanistic studies and translational research.