原子間力顕微鏡を用いた生細胞の機械的特性を測定する
2013年6月27日
本論文では、原子間力顕微鏡（AFM）を用いて、microindentationにより、生きた細胞の機械的性質を特徴づけるためのプロトコルを示しています。
本実験の全体的な目的は、原子間力顕微鏡を用いて生細胞の弾性率を測定することです。これはまず、細胞上のさまざまな位置でFM力分光測定を行うことで達成されます。次に、得られたすべての力-距離曲線（force distance curve）を解析し、AFMチップが細胞に最初に接触した点を決定します。
次に、接触点から最初の200〜300 nanometersのインデンテーションデータをHertzモデルにフィッティングさせます。弾性率を抽出するため、各ピクセルが単一の力-距離曲線を表すフォースマッピングモードを用いて、細胞剛性の2Dマップを作成します。この手順の実演は、私の研究室の大学院生であるGuen Thomasが行います。まず、カンチレバーホルダーを70% ethanolで洗浄し、乾燥させてください。
次に、製造元の指示に従ってbru DNP 10カンチレバーをAFMに装着します。続いて、逆光レバー感度を校正します。このパラメータは、カンチレバーのたわみ1nmあたりのフォトダイオードの応答電圧を示します。
これを達成するために、まず清潔なガラススライドを試料ステージに載せます。AFMヘッドを取り付け、製造元の指示に従ってレーザービームとアライメントを調整します。アライメント完了後、P8Oを後退させた状態で、AFMチップをガラススライドに接触させます。
フォトダイオードの読み値が-2 Vになるようにミラーを再調整します。次に、フォトダイオードの最大応答またはトリガーポイントを+2 Vに設定して、フォーススペクトロスコピー測定を行います。データ収集が完了した後、フォースカーブの強接触（firm contact）領域を拡大し、この領域に対して線形フィッティングを行います。
V/nm単位の傾きを求めた後、ミラーのアライメントをリセットし、自由たわみを0 Vにします。次に、LevyとMalamによって記述されたサーマルチューニング法を用いて、カンチレバーのばね定数を校正します。まず、チップとサンプルの間に相互作用が起きないよう、スキャナをサンプルステージから離します。
次に、カンチレバーの熱振動を記録することで熱データを取得します。AFMソフトウェアがこの熱振動のパワースペクトルを解析し、データウィンドウにプロットします。次に、ばね定数を決定するために、基本共振ピークとして知られる最低周波数を中心とするデータセグメントに対してフィッティングを行います。
培養プレート用のa FMを準備するために、a FMステージにディッシュヒーターアクセサリーを取り付け、温度を37 °Cに設定します。システムが安定した熱平衡に達するまで20分間待ちます。予熱が完了したら、培養ディッシュをa FMステージに置き、30分以上の測定を行う場合は、ディッシュヒーターに付属のクランプを使用して固定してください。通常の培養培地の代わりに、二酸化炭素非依存性培地を使用してください。
次に、37 °Cの培地を少量のドロップとしてAFMカンチレバーの先端に滴下し、チップが液体に浸るまでAFMヘッドを下げます。上面視CCDカメラを使用して、カンチレバー上のレーザービームを再調整します。媒体の屈折率が変化するため、液体中でのアライメントは空気中の場合とは異なります。
アライメントが完了したら、培養皿の細胞のない領域にAFMチップを接触させ、液体環境における逆光学レバー感度の校正を行います。細胞の機械的特性の測定を開始するには、光学顕微鏡を用いて、カンチレバーのチップを細胞の真珠縁（perle eye）領域の上に配置します。カンチレバーの位置の微調整は、XおよびYスキャナーにオフセットを適用することで行います。
次に、AFMをフォーススペクトロスコピーモードに切り替え、圧入速度を5 µm/sに設定します。この速度は、流体力学的影響を避けるのに十分な低速です。続いて、たわみトリガーポイントを2 nNに設定します。細胞への損傷を防ぐため、サンプルの剛性に応じてこの値を調整してください。
さらに、偏向信号のドリフトを補正するため、相対トリガリング（relative triggering）オプションを選択します。次に、力の測定間にチップが細胞から完全に離れるように、力距離を5 µmに設定します。各条件について、少なくとも30個の細胞の核領域の異なる位置で、3本の力曲線データを収集します。
各細胞で複数の曲線を採取することは有用ですが、統計データの信頼性を確保しようとして採取しすぎると、AFMプローブによるストレスで細胞の剛性が変化する可能性があります。フォースマップモードを用いて、単一細胞内の機械的特性の分布をさらに評価してください。
フォースマップモードにおいて、スキャンサイズを30 micrometersに、解像度を32 by 32に設定し、押し込みパラメータは単一フォースカーブで選択したものと同じに設定します。これにより、AFMがサンプル領域の各ピクセルで単一フォースカーブを測定し、領域全体の剛性マップを作成します。次に、記録されたフォースカーブをMATLABを用いて解析し、細胞の剛性を算出します。
まず、Matlabを用いて各点から線形近似とハーツ近似の両方を算出する、Lynetteらによって最初に発表されたアルゴリズムを採用します。両方の近似における相対的なRMS誤差を計算し、各点におけるこれらの値を合算します。合計フィッティング誤差が最小となる点が初期接触点として選択されます。この点を特定することは、細胞のヤング率を正確に測定するために極めて重要です。
次に、サンプルの変形量deltaを算出します。細胞への接触前（ZがZ zero未満の場合）は変形量は0とし、接触後の変形量は、カンチレバーのたわみDと接触点からの総距離Zの差として、以下の式を用いて計算します。続いて、以下の式を用いて押し込み力Fを算出します。細胞への接触前（ZがZ zero未満の場合）は力は0とし、接触後は、カンチレバーのばね定数Kに接触点以降のカンチレバーのたわみを乗じた値とします。
次に、使用したチップの形状に基づいて細胞のヤング率を抽出するため、ヘルツモデルのポストコンタクト領域におけるサンプルの変形量対押し込み力のデータにElise squareのフィッティングを適用します。ここでは、3つの異なる表面で培養された3つのT3線維芽細胞から得られた代表的な力曲線を示します。ここからわかるように、表面の状態によって細胞骨格の剛性は大きく影響を受ける可能性があります。
硬いプラスチック表面で培養した細胞の平均変形を赤色で示しています。硬いポリアクリルアミドゲル上で成長させた細胞は紫色で、弾性ポリアクリルアミドゲル上で成長させた細胞は青色で示されています。曲線における接点を慎重に特定することで、細胞変形の関数としての押し込み力を正確に示すことができます。
さらに、ヤング率を接触後最初の300 nanometersの押し込み量から正確に算出することができます。ここに示されているのは、中間フィラメントの一種であるmentonに緑色蛍光タンパク質をタグ付けしてトランスフェクションした線維芽細胞です。画像が明るいほど、その領域にmentonが多く存在していることを示しています。
これは細胞骨格の剛性に関連している可能性があります。ここで提示したAFMフォースマッピング技術を用いることで、1ピクセルが細胞表面積の2.5 by 2.5 micronsに相当する、32 by 32ピクセルの解像度で線維芽細胞の同様の剛性マップを示すことが可能です。このビデオを視聴することで、生体組織細胞の弾性を測定するために原子間力顕微鏡をどのように使用するかについて、十分な理解が得られるでしょう。
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概要
本論文では、原子間力顕微鏡（AFM）を用いたマイクロインデンテーションにより、生細胞の機械的特性を評価するプロトコルを提示します。本研究では、フォーススペクトロスコピーとデータ解析を通じて、生細胞の弾性率を測定することに焦点を当てています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 細胞力学
- 生物物理学
- 原子間力顕微鏡
背景
- 細胞の機械的特性を理解することは、さまざまな生物学的応用に不可欠です。
- 原子間力顕微鏡（AFM）を用いることで、細胞の剛性を高解像度で測定することが可能です。
- 弾性係数は、細胞の機械的特性を評価するための重要なパラメータです。
- フォースマッピングにより、細胞剛性の空間的な変動に関する詳細な知見を得ることができます。
研究目的
- AFMを用いて生細胞の弾性率を測定すること。
- 細胞の力学的特性を評価するためのプロトコルを開発すること。
- フォースマッピングデータに基づき、細胞剛性の2Dマップを作成すること。
使用方法
- 細胞上のさまざまな位置におけるFM力分光測定。
- 接触点を決定するための力距離曲線の解析。
- 弾性率を抽出するための、Hertzモデルへの押し込みデータのフィッティング。
- 細胞の2次元剛性マップを作成するためのフォースマッピングモード。
主な結果
- 生細胞の弾性率の測定に成功。
- 細胞硬度の変動を示す詳細な2Dマップの作成。
- 大学院生によるプロトコルの実演。
- 細胞の機械的特性を評価するための信頼性の高い手法の確立。
結論
- このプロトコルは、細胞力学を研究する研究者にとって有用なツールとなります。
- AFMを用いた測定により、細胞の挙動への理解を深めることができます。
- 今後の応用として、疾患状態や細胞応答の研究などが考えられます。
よくある質問
産業界における重要性
原子間力顕微鏡（AFM）を用いた細胞の機械的特性の定量的測定により、バイオ医薬品開発チームは微小環境の変化に対する細胞応答を評価でき、初期探索およびターゲット検証を支援することが可能になります。信頼性の高い剛性マッピングは、疾患関連システムにおけるメカニズム的なリスク低減と予測の信頼性に寄与し、ポートフォリオの選別やトランスレーショナルリサーチに直接的な影響を与えます。AFMベースの弾性率測定を統合することで、創薬パイプラインの重要な局面における意思決定が強化されます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲット検証
- 生理的または病理的状態の機能的バイオマーカーとして、細胞剛性の直接的な定量化を可能にします。
- 細胞骨格の変化を疾患モデルや化合物の影響と相関させることにより、メカニズム面でのリスク低減をサポートします。
- 基質や遺伝的摂動に対する細胞応答に関する仮説検証を促進します。
- 細胞ベースのアッセイにおけるターゲットバリデーションのための定量的なエンドポイントを提供します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの標準化に向けた、再現性のある定量的な力曲線および剛性マップを提供します。
- 複数の細胞条件下における機械的表現型のハイコンテンツスクリーニングを可能にします。
- 細胞力学を標的とした化合物評価のための、堅牢でスケーラブルなアッセイの開発をサポートします。
- フォースマッピングと自動データ解析ワークフローを統合することで、アッセイの準備状態を向上させます。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 機械的特性の測定を疾患関連の表現型と整合させ、トランスレーショナルなバイオマーカー開発を可能にする。
- 細胞力学と機能的アウトカムを関連付けることで、探索から前臨床検証までの連続性を提供する。
- 定量的で生理学的に妥当なデータに基づき、リスクを調整した進展判断を可能にする。
- 機械的な不均一性をマッピングすることで、前臨床モデルにおける予測的なリスク低減を支援する。
パイプラインおよびワークフローの統合
AFMを用いた細胞剛性測定は、初期の探索から前臨床までの連続的なプロセスに適合し、メカニズム研究とトランスレーショナルリサーチを橋渡しする役割を果たします。
- 探索生物学： 定量的な力マッピングにより、細胞応答が明確になり、生物学的仮説のリスクが軽減されます。
- スクリーニング： 標準化されたフォーススペクトロスコピーの出力により、条件間および化合物間での再現性のある比較が可能になります。
- 分析： MATLABベースの分析により、定量的ヤング率および空間的な剛性マップが得られ、堅牢なデータ解釈が可能になります。
- トランスレーショナルリサーチ： 機械的フェノタイピングが疾患モデルと整合し、バイオマーカーの連続性をサポートします。
- 企業内での再利用： AFMプロトコルおよび分析ルーチンは、さまざまな細胞型や実験システムに適応可能です。
運用および企業への影響
- 科学的価値：細胞ベースモデルにおける予測精度を向上させ、メカニズム上の曖昧さを軽減する。
- 運用上の価値：機械的特性の測定を標準化し、チーム間の再現性を向上させる。
- 戦略的価値：堅牢な定量的エンドポイントを提供することで、ゴー/ノーゴーの意思決定に寄与し、資本効率を改善する。
- ポートフォリオへの影響：機能的な細胞表現型に基づいた、リスク調整後の優先順位付けおよび創薬プログラムの推進を可能にする。
実施上の考慮事項
- AFMの操作、フォーススペクトロスコピー、および定量的なデータ解析の専門知識が必要です。
- 校正済みのAFM装置および互換性のある解析ソフトウェア（例：MATLABルーチン）へのアクセスが不可欠です。
- 校正、測定、および解析プロトコルのチーム間での標準化が必要です。
- 押し込みパラメータを慎重に調整することで、さまざまな細胞種や基質に適応させることが可能です。
- 潜在的な制限として、プローブによる細胞へのストレスや、接触点の慎重な特定が必要なことが挙げられます。
