ロイシンリッチの代謝標識は、放射性リン酸キナーゼ1および2を繰り返します

次の実験の全体的な目標は、タンパク質、細胞のリン酸化レベルを定量化するために、目的のタンパク質を放射性リン酸塩で標識することです。これは、リン32の存在下で細胞を培養し、細胞内で発現するタンパク質のリン酸修飾を放射性標識することによって達成される。第2のステップとして、標識細胞を溶解し、ライセートをアフィニティービーズでインキュベートして、分析対象のタンパク質の免疫精製を行います。

次に、標識および精製されたタンパク質のサンプルを、デザル酸ナトリウム、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、ポリフッ化物膜にブロットします。放射性リン酸塩の取り込みとタンパク質レベルを検出するために、ロイシンに富むリピートキナーゼ1および2(略称:L rrk oneおよびL rrk 2)が、自動X線撮影および免疫検出に基づいて細胞内で同等のレベルまでリン酸化されることを示す結果が得られます。リン酸化、免疫ブロッティングなどの他の技術と比較した代謝標識技術の主な利点は、この技術により、リン酸化抗体が利用できないタンパク質を含むタンパク質の総細胞リン酸化レベルを測定できることです。

この手法の2つ目の大きな利点は、異なるタンパク質間の全細胞リン酸化レベルを定量的に比較できることです。手順をデモンストレーションするのは、私たちの研究室の技術者であるF gaoです dco修飾イーグル、培地、または8%の胎児の子牛、血清、およびゲンタマイシンを使用したDMMの標準的な培養条件に従ってHEC 2 93 T細胞株の培養を開始します。プレートを拡大し、テキストプロトコルで説明しているように、トランスフェクションまたはレンチウイルスベクター媒介形質導入を介してトリプルフラグタグ付きL rrk 2タンパク質を発現します。

細胞が80〜100%コンフルエントになったら、プレウォームリン酸フリーのdmmですすいでください。層流下で、リンで標識する細胞の6ウェルプレートあたり2.1ミリリットルのリン酸を含まないDM a mのファルコンチューブを準備します。32オルトリン酸。

電離放射線の実験を行うベンチを準備します。作業スペースはスピルマットで覆われており、その上に吸収材の保護ライナーが置かれています。また、ワークスペースにパースペックスジャーを用意し、リン酸塩を含まない媒体のチューブを内部に置きました。

オルトリン酸とラベル付けされたリン32のバイアルが入った鉛で裏打ちされた容器を冷蔵庫から取り出し、放射能ベンチに持ってきます。ガイガーカウンターを使用して容器の外部放射能汚染を監視し、オルトリン酸とラベル付けされたリン32をリン酸塩を含まないdmemのチューブに希釈します。ミリリットルあたり24マイクロキュリーの濃度を追加します。

チューブをパースペックスジャーに入れておきます。オルトリン酸とラベル付けされたリン32の残りの部分で容器を閉じてから、冷蔵庫に戻してください。次に、標識する細胞が入った6枚のウェルプレートをインキュベーターから取り出し、放射能ベンチに置きます。

中清を取り除き、廃棄します。次に、リンを含むリン酸塩を含まない培地を2ミリリットル加えます。ウェルあたり32個の標識オルトリン酸。

培養プレートをパースペックスボックスに入れ、ガイガーカウンターを使用して容器の外部放射能汚染を監視します。次に、細胞の入ったパースペックスボックスを同位体代謝標識専用の真核細胞インキュベーターに移し、細胞を1〜20時間インキュベートします。プロトコルのこの時点で、細胞は、テキストプロトコルの指示に従って必要に応じて化合物で処理することができます細胞処理およびインキュベーションに続いて、細胞から培地を取り出し、パースペックスジャー内に置かれた廃棄物収集チューブに廃棄します。

2ミリリットルの氷冷トリス緩衝生理食塩水で細胞を2回すすぎます。すすぎ液を廃棄物収集チューブに捨てます。次に、0.5ミリリットルの氷冷免疫沈降溶解バッファーを各ウェルに加え、ピペッティングで上下させてライセートを収集します。

溶解したすべての細胞を緩めるには、ライセートをマイクロ遠心チューブに移し、テキストプロトコルの指示に従って遠心融合の少なくとも10分前に氷上でインキュベートし、免疫精製によって目的のタンパク質を単離します。まず、遠心分離機のライセートを入れたマイクロ遠心チューブを氷に戻します。次に、上清を10マイクロリットルのベッドを含むマイクロ遠心チューブにピペットで移します フラグMの体積 2つのaro速度。

テキストプロトコルで説明されているように平衡化し、マイクロ遠心チューブを50ミリリットルのチューブに移します。マイクロ遠心チューブを氷上の標識50ミリリットルチューブに移した後、サンプルを冷蔵室の指定エリアにあるパースペックスシールドの後ろの回転装置に置き、インキュベーション後1〜20時間、摂氏4度でエンドオーバーミキシングを行い、上清を廃棄物収集チューブに捨てた後、マイクロ遠心チューブ内のタンパク質結合フラグM 2つのaroビーズをスピンダウンします。テキストプロトコルで説明されているように、ビーズの洗浄に進みます。

その後、洗浄したビーズを40マイクロリットルのIPサンプルSDSローディングバッファーに再懸濁し、ローディングバッファー内のサンプルを摂氏95度に2分間加熱してから、1000倍g以上で1分間遠心分離し、ビーズをペレット化して、パースペックスクリーンの後ろの放射能ベンチにタンパク質ゲル電気泳動モジュールを準備します。電気泳動を行う前に高分子量タンパク質のサイズを識別するのに適した分子量マーカーを含む3〜8%Tの酢酸トリスSDSページゲルにサンプルをロードします。電気泳動後、ゲルをプラスチックケースから取り出し、ウェスタンブロッティング転写バッファーの入った容器に移します。

ゲルおよびPVDF膜の調製後。テキストプロトコルで説明されているように、セミドライブロッティングモジュールの表面にブロッティングサンドイッチを準備します。転写後1〜2時間、タンパク質を15ボルトで転写します。

ブロッティングモジュールからブロットされたタンパク質を含むPVDFメンブレンを取り出し、メンブレンを乾燥させて自動X線撮影を行います。まず、メンブレンを蓄光プレートに1〜5日間さらします。リン光スキャナーを使用して露光した燐光プレートからリン32を読み取り、画像を高解像度のtiffとして保存して、免疫検出を介してタンパク質レベルを検出します。

メンブレンをメタノールに短時間浸し、PBSを入れた浅いブロットインキュベーション容器に移すことで、メンブレンを再水和します。5%のミルクを含むPBSTでメンブレンをブロックします。ブロットを抗LR K 2抗体またはAnti-Flag抗体でインキュベートし、適切な洗浄ステップと二次抗体のインキュベーションでさらに処理します。

抗体の適用後、化学発光検出を行い、LRRK 2の相対的なタンパク質レベルを確認します。最後に、テキストプロトコルに記載されているように、直径分析を使用してLRK 2におけるリン32の結合を定量化します ここに示されているのは、HEC 2 93 T細胞におけるL Rrk 1およびL Rrk 2の代謝標識の代表的な結果です。ここに描かれているのは、リン32取り込まれた代表的なオートラジオグラムと、トリプルフラッグタグによるL Rrk 1およびL Rrk 2の検出の代表的なウェスタンブロットです。

放射性リン酸塩の取り込みは、L rrk 1とL rrk 2の両方で観察されます。リン32レベルを定量すると、抗フラグ抗体による免疫検出の密度メトリック分析によって測定されたタンパク質レベルに正規化されます。それは、統計的有意性に達していないが、L rrk 1は、テストされた条件下でL rrk 2よりも低い平均リン酸化レベルを持っていたことが判明した、放射能との作業は非常に危険であり、非常に個人的な保護具やあなたの機関の安全部門によって提供される手順を介して作業などの予防措置は、常にこのプロトコルを実行することによって取るべきであることを忘れないでください。