毛穴グラデーション、高分子電解質とその間接的モニタリングの金属インプラントのマルチスケール変更

この手順の全体的な目標は、金属インプラントを複数の長さスケールで修正して、in vitroおよびin vivoで細胞の挙動を制御することです。これは、最初に3次元管状インプラント、バイオフリーズ抽出法内で細孔径勾配を生成することによって達成されます。第2のステップは、コラーゲンとアルギン酸塩に基づくナノ原線維基底膜模倣物を層ごとに開発することです。

次に、血漿分析を用いて、インプラント埋込後のインプラントを間接的にモニタリングする方法について紹介します。HPLCとその後のペプチドシーケンシングは、最終的には、必要に応じて異なる領域が異なる細胞タイプに対応できるインプラントであることが実証されています。一部の多細胞組織については、このシステムは金属インプラントを変更する方法を提供できますが、取得できます。

また、人工組織や疾患モデルなどの3D細胞培養モデルシステムにも適用できます。この手法のアイデアを思いついたのは、生体内で多孔質チタンインプラントの周りの細胞の動きを制御する技術を見つけようとしていたときでした。この手順を開始するには、インプラントを洗浄し、凍結および抽出のために書かれたテキストに記載されているようにテフロン型を設計および製造します。

有機溶媒にポリマー粉末を導入して、ダイオキシンと水の二元混合物で合成ポリマーPLLA溶液を調製します。磁気スターでは、均質な溶液を得るために混合物を摂氏60度に加熱します。この温度は、インプラントへの溶液の導入に使用される精密ガラスシリンジの温度抵抗の上限であるため、選択されます。

一方、凍結溶液の体積の変化を考慮して、インプラントの多孔性に対して必要なポリマー溶液の体積を計算します。次に、0.1マイクロリットルの精度の精密ガラスシリンジを使用して、溶液をインプラントに導入します。ポリマー濃度の下限は3%で、再現性のあるPOグラジエント形成のため、または6%を超える厚いサンプルで均一な分布を得ることが難しくなったため、サンプルをマイナス80°Cで直接凍結するか、室温で30分のインキュベーション期間を設けて

凍結条件は、細孔形成を部分的に決定します。したがって、凍結条件は、目指す多孔性に応じて調整することができます。サンプルを摂氏マイナス80度で一晩保管します。

凍結状態での金型の分離は非常に難しいステップです。頭皮の助けを借りて、凍結したボーター溶液と金型との接触を減らすために注意を払う必要があります、インプラントを80%予め冷却したエタノールに浸して多孔性勾配を得る。マンドリルを除くすべての金型部品、管状インプラント、および円盤型インプラントの底部を除くすべての部品を、事前に冷却したメスを使用して、マイナス20°Cで一晩抽出します。

抽出後、残りの金型部品を取り外し、インプラントを風乾します。構造の全体的な多孔性の特性評価用。水銀オキシメータ分析が必要です。

この例では、水銀オキシメータの測定値は、インプラントの両側の細孔と小さな分散細孔に対応する明確なピークを示しています。ただし、より重要なデータは、管腔内表面と管外表面の多孔性の違いであり、画像Jで細孔サイズ分布を分析できます。走査型電子顕微鏡で断面を観察することにより、サンプルの凍結破壊を追跡します。

使用されるインプラントの開放的な多孔質の性質とチタンの光反射能力により、多孔質インプラント内で標識された細胞のZスタックを行うことが可能です。PKH 26またはカルシウムAMで標識された細胞は、共焦点レーザー顕微鏡でインプラントを視覚化し、多層の蓄積のために使用することができます。浸漬ロボットで最高の再現性が得られます。

ただし、ディッピングロボットが利用できない場合は、これらの手順を手動で実行できます。コラーゲン溶液を調製するには、医療グレードのコラーゲン1型とアルギン酸ナトリウムを使用します。最適化された濃度は、150ミリモルあたりそれぞれ0.5グラム/リットルです。

pH 3.8のクエン酸ナトリウム緩衝液は、コラーゲン溶液を一晩溶解して均質性を確保します。構造が不安定であるため、層の安定した蓄積には3.8の溶液酸性pHが必要です。クロスリンク前。

中性pH設計では、多分子電解質多層生産で使用される浸漬ロボットを備えたインプラントを利用するための特定のホルダーを設計します。チタンのみのインプラントまたはテキストで説明されているように変更されたインプラントの表面に層を堆積させます。浸漬ロボットシステムを使用して、最初にインプラントをアルギン酸溶液に15分間浸し、次にpH 3.8の150ミリモル塩化ナトリウムで構造を5分間すすぎます。

その後、コラーゲン溶液に15分間浸します。基底膜を安定化するために、まず100ミリモルのゲニンで架橋溶液を調製します。A-D-M-S-Oクエン酸緩衝液では、体積比1〜4の体積比でジェニンをDMSO成分に溶解し、次に水成分にジェニンを溶解して、凝集を防ぎ、その後12〜24時間の間に架橋溶液に浸漬することにより、サンプルを架橋します。

pH 3.8のクエン酸緩衝液を大量に含ませてすすぎます ステップを洗浄した後、30分間のUV処理または抗生物質の抗真菌浴でサンプルを滅菌します。模倣基底膜の品質を決定する主なパラメータは、その厚さと繊維の直径です。原子間力顕微鏡または接触モードで取得したFM画像を使用して、繊維の直径を計算します。

窒素流でサンプルを乾燥させた後、イメージングする前に、画像ごとに少なくとも10本の繊維の厚さを定量化して、平均フィブリルの厚さを決定します。Image Jソフトウェアでは、コラーゲンアルギン酸24二重層コラーゲン多層フィルムを乾燥させた後、スクラッチテストによってフィルムの厚さを決定することができます。最初にFMを使用して、シリンジ針を使用して、光学顕微鏡でスクラッチの位置を特定した後にフィルムをスクラッチし、スクラッチの境界で10×10平方ミクロンの表面にFMで画像を取得します。

A FMソフトウェアで取得したプロファイルから高さを計算し、フィルム層の厚さを提供します。本文に記載されているようにウサギの気管にデバイスを埋め込んだ後、耳介静脈から血液サンプルを採取し、サンプルを5, 000RPMで摂氏4度で20分間遠心分離します。得られた上清は、ウサギ血漿を0.1%のトリオール酢酸で抽出した後、分析に使用してください。

血漿タンパク質含有量の逆相HPLC精製は、核細胞逆相305 C 18カラムを用いて抽出物を精製することにより行います。テキストプロトコルに記載されている溶媒システムと流量を使用して、214ナノメートルと280ナノメートルでの吸光度を記録します。ピーク画分を回収してから、蒸発によって濃縮します。

スピードバキュームアプリケーションを使用すると、完全に乾燥する前にスピードバキュームを停止することが重要です。移植期間の経過を通じて異なる時点で得られたピークを相関させます。移植の過程で一貫した傾向を示している精製ペプチドを、自動エドモンドシーケンシングによる同定に使用します。

サンプルをポリブレイン処理ガラス繊維フィルターにロードし、プロ精密マイクロシーケンサーを使用して自動エドモンド分解により、精製ペプチドの末端配列を決定します。次のステップは、C 18カラム上のクロマトグラフィーによるフェニルthと1つのアミノ酸の同定です。配列を取得した後、Swiss Proteデータベースを使用してブラストソフトウェアで同定できます。

PLLA溶液の濃度を変えることで、インプラントの余分な管腔側の細孔の大きさを制御することができます。細孔の大きさと形状は、チタンインプラントの存在によって大きく影響を受けました。細孔サイズは 40 から 100 マイクロメートルの範囲であり、低濃度を利用すると細孔が小さくなりますが、管腔内側の細孔サイズは制限された抽出によって支配され、線維芽細胞の平均サイズよりも小さい約 9 ミクロンでした。

室温でのインキュベーションステップを追加することで、大きな細孔の細孔壁が独自の多孔性を持つ二重多孔質構造を得ることができます。この機能は、ガスと栄養素の移動を容易にするため、厚いインプラントにとって重要です。細孔勾配が形成された後、構造の上にコラーゲンアルギン酸フィルム層を追加することが可能です。

このフィルム層は、PLLAフォームの上面で安定しており、フォームナノスケールのコラーゲン繊維が形成されていない場合でも、表面上に保持することができます。フィルム層が成長するにつれて、フィルムの成長は指数関数的になります。これにより、数百ナノメートルの厚膜を得ることができる。

多孔質チタンインプラントは宿主組織と統合され、外植インプラントの断面に示されているように、生体内で4〜6週間で完全に充填されます。細孔内の組織は、良好なレベルの血管新生を伴う成熟した結合組織です。この期間中、HPLC分析では、移植の時間経過中に変動する明確なピークが示されました。

目的のピーク画分をシーケンシングし、α ヘモグロビン半鎖とベータヘモグロビン半鎖であると決定しました。これは、C 反応性タンパク質の読み取り値で同様の傾向を示していました。一度マスターすると、このテクニックは適切に実行されれば1日で行うことができます。このビデオを見れば、金属インプラントの改質や細胞培養実験のための3DマルチスケールPOグラディエントの作成方法について十分に理解できるはずです。

凍結抽出とフィルム形成による層は、細胞のための独自の修正インプラントまたは微小環境を開発するための単純な金属です。