ゼブラフィッシュ幼生における筋機能を評価するために、収縮時の力測定

この手順の全体的な目標は、ゼブラフィッシュ、幼虫、体幹の筋肉の最大収縮中の力の発生を測定することです。これは、まず、力の測定中に幼虫を所定の位置に保持するために使用される縫合ループを作成することによって達成されます。次に、麻酔をかけた幼虫を実験チャンバー内に配置します。

所定の位置に配置されると、力は最大のけいれん収縮中に記録されます。最後のステップは、体幹の筋肉組織の寸法を測定して、ピーク力を筋肉断面積に正規化できるようにすることです。最終的には、収縮中の力の発生を測定することで、筋肉の機能や全体的な筋肉の健康状態の変化を示すことができます。

この方法は野生型のゼブラフィッシュの幼生を用いて実証していますが、遺伝子組み換えの幼生や、薬物や毒物で処理された幼生にも使用できます。その後、この方法は、筋疾患モデルを特徴付け、治療を評価したり、筋肉の発達、損傷、または化学的毒性を研究するために使用できます。最初のステップは、幼虫を所定の位置に保持するために使用される縫合ループを準備することです。

力の試験では、鉗子を使用して非滅菌縫合糸を3本のストランドに分離します。分離したら、ストランドの1つにダブルオーバーハンドノットを結び始めますが、結び目を完全に締めて小さなループを作る前に停止します。ループを完成させるには、ハサミを使って尻尾から余分な縫合糸を切り取ります。

後で使用するために、ループを付箋の付箋側に置きます。テストする幼虫ごとに2つの縫合ループを作成します。まず、実体顕微鏡のステージに試験装置を置きます。

次に、力変換器と長さコントローラーケーブルを試験装置に接続します。力変換器と長さコントローラーの電源を入れ、長さコントローラーの前面にあるスイッチを切り替えます。これにより、長さコントローラーチューブは使い捨てトランスファーでブリッジされます。ピペット。

試験室に試験液を充填します。鉗子を使用して、尾の1つで縫合ループをつかみ、グリップします。湾曲した部分のループは、縫合糸をねじり、その後のステップで縫合糸を破裂させる可能性があります。

力変換器のチューブに1つのループを、長さコントローラーに別のループを掛けます 使い捨てのトランスファーピペットを使用して、ゼブラフィッシュの幼生を試験溶液で満たされた小さなペトリ皿に移します。麻酔薬が効いたら、尾をそっとつねて、水泳を誘発するタッチが不足していることを確認します。次に、ガラスピペットを使用して、鉗子で幼虫を実験チャンバーに移します。

幼虫の前部を力変換器チューブの縫合糸ループにそっと導き、縫合ループの両側の尾をつかみます。それらを同時に引っ張って、オーク嚢の後方のループを締めるか、鉗子で膀胱を泳ぎます。片方の縫合糸の尾を持って引っ張り、幼虫がチューブの周りを90度回転し、幼虫の外側が上を向くようにします。

長さコントローラーに取り付けられたX、Y、Z位置決め装置を使用して、長さコントローラーチューブをX軸に沿って、幼虫の胴体と尾の下に移動させます。長さコントローラーチューブと力変換器チューブの端の間にスペースを残します。次に、縫合糸ループを幼虫の尾にガイドし、縫合ループを締めます。

前に示したように、側面が上を向くように幼虫の後部を回転させる必要がある場合があります。所定の位置に配置されたら、縫合ループのテールをトリミングします。XY、Zポジショニングデバイスを使用して、チューブがチャンバーの底にちょうど触れるまでチューブをゆっくりと下げます。

次に、幼虫をチャンバーの底から適切な距離まで上げます。これは、後で使用する倒立顕微鏡対物レンズの作動距離内にある必要があります。最後に、コントローラーチューブの長さを調整して、幼虫の長軸を力トランスデューサーチューブの長軸に合わせます。

まず、試験装置を倒立顕微鏡のステージに移動します。次に、ウォーターバスサーキュレーター温度計と温度コントローラーを試験装置に接続します。必要なコンポーネントの電源を入れ、温度コントローラーの設定を希望の値に調整します。

刺激装置から試験装置にケーブルを接続します。刺激装置の電源を入れますが、この時点で幼虫を刺激しないでください。幼虫がチャンバーの底に平行であることを確認するには、チューブの端の間の幼虫の部分を表示します。

平行の場合、必要に応じて幼虫の両端に焦点が合います。両端が焦点が合い、幼虫が平行になるまで、力変換器チューブを調整します。ビデオサルコメアの長さシステムをオンにし、縞模様がビデオフレームの側面と平行になるようにビデオカメラを回転させます。

縞模様の間隔は、サルコメアの長さの指標として使用されます。顕微鏡を調整して周辺繊維に焦点を合わせ、示されたサルコメアの長さをメモします。必要に応じて、サルコメアの長さが最適より短くなるまで、長さコントローラーを調整して幼虫を短くします けいれん力を最適化します。

まず、スティミュレータの出力電流を低振幅に設定し、次に専用のソフトウェアをプログラムして電流パルスを0.2ミリ秒の持続時間で供給します。最初のパルスを送達し、オシロスコープを使用してピークtwitch力を測定します。

電流を50ミリアンペア刻みで増やし、新しい電流レベルごとにピークtwitch力を測定します。刺激電流が増加するため、疲労を防ぐために、けいれんの合間に30秒待ちます。ピークtwitch力は通常、最大まで増加し、その後、幼虫が生成する電流を徐々に減少させます。

最大の力は最適な刺激電流です 特定したら、電流の振幅を最適な刺激電流に設定し、幼虫の長さを調整して、最大のけいれん力を引き出します。最後に、幼虫の筋肉のけいれんを引き出します。オシロスコープを使用して力の応答を記録し、その後の解析のために記録を保存します。

筋肉組織の寸法を測定するには、試験装置を実体顕微鏡に戻します。IPスケールを使用して、側面から見た筋肉組織の高さを測定します。解剖学的なランドマークで測定を行います。

たとえば、ここでは赤でマークされた泌尿生殖器の開口部があります。次に、幼虫の長さを変えないように注意してください。縫合糸ループテールを使用して幼虫を90度回転させ、幼虫を下から見ることができます。

下から見た筋肉の幅を測定します。最後に、健康な野生型ゼブラフィッシュの幼生の試験装置から幼虫を解放するためにマイクロブレードで縫合糸ループを切断し、筋繊維はそれらの間に大きな隙間をなく互いに平行にし、証拠の縞模様を持っている必要がありますこれらの特徴を示さない、またはここで見られるように繊維が分離したなどの明らかな損傷を伴う野生型ゼブラフィッシュの幼虫は、ここで廃棄する必要があります。ピークtwitch力対刺激電流は、1匹のゼブラフィッシュの幼生についてプロットされています。

最適な刺激電流は、通常400〜600ミリアンペアです。ここには、1匹の幼虫の最大痙攣収縮中に収集された代表的な力の応答が示されています。ここは。異なる年齢の野生型幼虫のピークフォース値は、0.9から1.7の範囲であることが示されています。

年配の幼虫を持つミリニュートンは、若い幼虫よりも多くの力を生み出します。年配の幼虫は、ピーク力が断面積の筋肉面積に正規化された後でも、若い幼虫よりも多くの力を生成します。この手順を試みるときは、幼虫が力変換器と長さコントローラーチューブの周りを簡単に回転しないように、縫合ループを十分に締めることが重要です。

縫合糸ループが緩すぎると、幼虫によって生成された力が力変換器に完全に伝達されず、最大収縮力が過小評価されます。