合成、細胞の配送およびインビボデンドリマーベースのpHセンサの応用

次の実験の全体的な目標は、生細胞内およびin vivoでのpHイメージングのための改善された特性を持つDunドラマーに基づく新しい蛍光センサーを開発することです。これは、まずpH感受性色素を樹状突起足場に結合させることで、標的基や感受性色素のpHなどの他の部分と結合させることで達成されます。また、in vitro測定により、生細胞の画像pHの隣にpH検量線が生成されます。

センサーはエレクトロポレーションによって送達され、pHマップは共焦点顕微鏡を使用して作成され、脳の細胞外空間のpHを画像化します。生理学的および病理学的神経活動中に、センサーは麻酔をかけたマウスの脳にマイクロ注入されます。次に、蛍光データを2光子顕微鏡を使用して取得します。

得られた結果は、ドリマーベースのセンサーが、生細胞とin vivoの両方で、高い空間的および時間的分解能でpH変化を測定することに成功したことを示しています。すでにpH感受性のある振る舞いを持ついくつかの煙道染料が採用されていますが、移動性の悪さや細胞の漏出など、いくつかの欠点があります。さらに、ラッシュメトリックの絶対測定は許可されていません。

ここでは、pH感受性色素のD遺伝子スキャフォールドへのコネーションを実証しましたが、その性能により、特別かつ時間的な分解能で正確な測定が可能になることから、この方法は、生細胞のpHによって制御される生理学的および病理学的プロセスを研究するための有用なツールとなる可能性があります。神経系のpH調節の混乱は、脳卒中やてんかんなどのいくつかの状態に関連しており、利用可能なpHセンサーは効果が低いことが証明され、提示されたセンサーの設計につながりました。このメットはここではpH hイメージングに適用されていますが、これは一般的なアプローチであり、他の生物学的関連種にも適用できます。

プロフィットセンシング色素を選択することで、簡単で汎用性の高い合成アプローチにより、これらの手順が簡単になります。今日の手順を実演するのは、ジョバンニ再、バーバラti、マルコブロディ、およびセバスチャンスリは、PiamデマーズにpHインジケーターを結合するために。まず、ライマーを無水DMSOに最終濃度50マイクロモルで溶解します。

フルオレセインNHSとテトラエチルルミンNHS(無水TMR、DMSOとも呼ばれる)の10マイクロモルストック溶液をマイクロ遠心チューブに調製し、1ミリリットルのG 4ペラムデデラー溶液を8等量、またはフルオレセイン40マイクロリットルと8等量、またはTMRの40マイクロリットルを調製します。混合物中のモル比は、デマーにロードされる染料の量を反映します。溶液を室温で12時間攪拌します。

次に、混合物を脱イオン水で1〜10に希釈し、分子量カットオフが10キロダルトンの透析バッグに反応混合物をロードし、脱イオン水に対して透析し、リザーバー内の水を24時間にわたって3回交換します。翌日、溶液をガラスバイアルに移し、マイナス80度で数時間凍結します。溶液が完全に凍結したら、バイアルを凍結乾燥機に移し、24時間凍結乾燥させます。

紫色の粉末を取得し、波状に固体を取得し、それをmqe水に溶解する必要があります。最終濃度10マイクロモルで。1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに50マイクロリットルのアリコートで溶液を分注し、摂氏マイナス20度で保存します。

in vitroキャリブレーションのために、2ミリモルPBS中のDドラマーの500ナノモル溶液をクォーツQ獣医で調製します。滴定中のpHの急激な変化を避けるために、非常に希薄なPBS緩衝液が使用されます。フルオレセインとTMRの発光スペクトルを測定し、蛍光計の光学設定を最適化して、良好なS/N比を実現します。

次に、0.1の正常水酸化ナトリウムと0.1の正常塩酸を少量加えてpH滴定を行います。追加するたびに、Qベットを振って混ぜます。平衡化のために1分待ってから、pHを使用してpHを測定します。

フルオレセインとTMRの微小電極発光スペクトルは、変更することなくすべてのステップで記録する必要があります。光学設定で、蛍光強度と pH をプロットします。滴定では、ロッドドミンシグナルはpHの影響を受けないようにする必要があります。

フルオレセインシグナルはシグモイド曲線である必要があり、エレクトロポレーションにはPKが6.4の単一の結合モデルを適合させる必要があります。72マイクロリットルの5番目のヘラ細胞に10を6回1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、再懸濁した細胞に移します。2マイクロモルの濃度で樹状突起または水溶液を加え、3ミリリットルのエレクトロポレーションバッファーをマイクロピュレーションチューブに加えます。

次に、10 マイクロリットルのエレクトロポレーションチップを使用して、セルとライマーの混合物を吸引します。次に、マイクロピペットをピペットステーションに挿入し、ここでマイクロピュレーションパルス条件を設定します。パルス電圧は1005ボルトに設定されています。

パルス幅は 35 ミリ秒に設定され、パルス数はパルスプレートの後で 2 に設定されます。エレクトロポレーションした細胞の 20 マイクロリットルを、抗生物質を含まない新鮮な培地でガラス底の皿に送ります。エレクトロポレーションの 12 時間後、フルオレセインと r ドミンの標準フィルターセットを使用して、共焦点顕微鏡で細胞をイメージングします。

試料に焦点を合わせ、レーザー出力と検出器のゲインを調整して、信号対雑音比を最大化します。エレクトロポレーションが成功した場合、細胞は両方のチャンネルで明るく蛍光を発しているはずです。ローカリゼーションは、使用されるDのサイズと電荷によって異なります。よく。

小さな核周囲小胞として見られる太陽のリソソーム局在化は、エンドサイトーシスまたはコンパートメント化のために存在します。リソソーム局在が優勢であり、蛍光の大部分が小胞内に局在し、サイトゾルで細孔シグナルが観察されます。これは毒性を意味し、測定値は破棄する必要があります。

2つのチャンネルを順番に集録し、複数の画像を集録し、画像を平均化して画質を向上させます。pH 検量線を作成するには、異なる pH で opfor を含むバッファーを使用して、細胞内 pH と細胞外 pH を同じ値で凝集させます。pHごとに少なくとも20個の細胞画像を取得し、pH 5.5からpH 7.5までの少なくとも5ポイントを測定します。

これは、pH B 6が細胞に対して毒性があることを思い出させますが、短時間で耐えることができるため、できるだけ短い画像を取得してください。アポトーシスの兆候が見られる場合は、細胞を廃棄して再起動します。買収後。

データ解析には、image Jまたは類似のソフトウェアを使用してください。まず、緑と赤の比率を決定します。次に、比対pHをプロットして線形トレンドを作成し、将来の実験で比をpHに変換するために使用できる検量線が得られます。

in vivoサンプル調製では、C 57 black six Jと出生後28日目から70日目までの雌マウスから始めます。ウレタンでマウスに麻酔をかけた後、つま先をつまんで動物が完全に麻酔されていることを確認し、皮質ストレス反応と脳浮腫を軽減するために眼軟膏を塗布します。手術中は、体重1キログラムあたり2ミリグラムのデキサメタゾン、リン酸ナトリウムを筋肉内に注射します。

次に、外科用鋏を使用して動物の頭を剃り、次に外科用ドレープを置き、2.5%リドカインゲルを頭皮に塗布します。はさみを使用して、両方の半球の頭蓋骨を覆う皮膚のフラップを切ります。露出した骨を生理食塩水と鉗子で洗い、骨膜を静かに取り除きます。

これにより、接着面が向上します。接着剤と歯科用セメントの場合は、中央のイメージングチャンバーを備えたカスタムメイドのスチールヘッドポストを適用し、シアノアクリレートを使用して、関心のある皮質領域の頭蓋骨とほぼ平行な平野に接着します。ポストを白い歯科用セメントで所定の位置に固定します。

マウスの頭部を固定し、関心領域に穴を開けて直径2〜3ミリメートルの開頭術を行います。穿孔手順全体で頻繁に、シリンジを使用して新鮮な滅菌A CSFを頭蓋骨に塗布し、手術中の皮質の加熱を最小限に抑えます。開頭術の後、動物をイメージングステージに移して、頭を目標の下に静止させます。

イメージングチャンバーを調整可能なポストにねじ込み、酸素に接続されたカスタムメイドのプラスチック製銃口を適用します。これにより、実験中に酸素が豊富な空気が供給され、動物の呼吸を助けます。

センサーを大脳皮質に注入するには、先端径が4ミリメートルのガラスピペットと塩化銀電極をロードします。1マイクロモルのドリンマーERソリューションを使用すると、電極はマイクロインジェクションのセットアップで細胞外電位の記録を容易にします。ピペットを約150ミクロンの深さで皮質に挿入します。

0.5ポンド/平方インチの圧力で1〜2分間注入して、イメージングの光学セットアップを最適化します。レーザー出力を調整して、写真の退色と写真の損傷を最小限に抑えます。通常、使用されるレーザー出力は約20ミリワットで、PMTゲインは667ボルトで一定に保たれます。

レーザー波長を設定してセンサーを励起し、標準のFTSEフィルターとtritフィルターを介してフルオレセインとロッドドミンの蛍光を同時に検出するようにソフトウェアに指示します。また、背景補正のために、集録周波数を2ヘルツのフレームレートに設定します。レーザーシャッターを閉じた状態で暗いフレームを取得し、PMTと台座で発生する平均熱ノイズを測定します。

最後に、pH依存性の蛍光画像を取得し、その後の分析のために保存します。以前と同様にデータを解析し、フルオレセインとルミンのin vitroでの挙動を評価します。ライマーに負荷をかけ、蛍光計を用いてpH滴定を行った。

この図は、pHセンサの一般的な滴定を示しています。フルオレセインとルミンは、それぞれ488ナノメートルと550ナノメートルで別々に励起できるため、2つのチャネル間のクロストークを最小限に抑えることができます。フルオレセインはpH依存性を示しますが、Rドミンシグナルは生理学的pH範囲で大きく変化しません。

したがって、これら2つの信号の比率はセンサーの濃度には依存せず、pHにのみ依存します。次に、指標を細胞内に送達するために、hela細胞をdedererセンサーでエレクトロポレーションし、このビデオで説明されているように共焦点イメージングを行いました。これらの共焦点画像は、左側がフルオレセインチャネルの細胞、中央がRドミンチャネル、右側がpH比メトリックマップとして表示されている細胞を示しています。

強いフルオレセインシグナルとr ドミンシグナルが観察され、これらは共局在化し、センサー構造の完全性を示しています。比率メトリック マップは、2 つの画像をピクセルごとに分割することによって再構築され、擬似カラー スケールで表されます。細胞内のセンサー応答を較正するために、ここに示すようにイオノフォアによるpHクランプを行いました。

インジケーターは、緑と赤の比率の変化でpHに容易に反応します。得られたデータを使用して、正確なpH測定のための検量線を作成しました。キャリブレーションの線形傾向は、細胞環境からの摂動なしにセンサーがpHに応答する能力を示しています。

デンドリベースのセンサーをin vivoイメージングにどのように使用できるかを示すために、デンドリまたは注射された麻酔マウスの脳内でpHイメージングを行いました。フルオレセインシグナルとr domineシグナルは、820ナノメートルの励起で同時に取得され、比率マップは生細胞測定と同様にピクセルごとに構築されました。特に、指標は細胞外空間に局在し、画像内の非蛍光領域は細胞体または小さな血管を識別して、pHに対するセンサー応答を確認します。

私たちは高炭酸ガス血症の使用を採用しました。実際、二酸化炭素は血液や組織内の炭酸塩緩衝液の平衡を変化させ、組織の酸性化を引き起こすことが知られています。このプロットに見られるように、30%の二酸化炭素を吸入すると、マウスの回転換気時に完全に可逆的なセンサーの強い応答が誘発されます。

これらの結果は、生細胞およびin vivoにおけるpHの生理学的および病理学的変化を強調するためのセンサーの可能性を示しています。A、私たちの手順は、電気生理学的記録などの他の測定と互換性があります。これにより、進行中の生物学的プロセスに関する補完的な情報を同時に得ることができました。

この方法は、その開発後、細胞生物学および神経生物学の研究者が培養細胞およびin vivoのpH制御プロセスを探求する道を開きました。