Name: 合成、細胞の配送およびインビボデンドリマーベースのpHセンサの応用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-10T10:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 19 s
Description: 学ぶデンドリマーベース蛍光pHセンサの合成と細胞内導入法。電気穿孔と共焦点顕微鏡を用いて生細胞およびマウス脳内のpH変化を高感度に計測する手法を解説します。

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1。センサーの合成<ol><li>次のセクションでは、PAMAMデンドリマーにpH指示薬の結合のための手順を提供する。同一のプロトコルは、代替のアミン含有デンドリマーに最少の改変を適用することができる。5,17,13,14、市販のデンドリマーおよび染料をさらに精製することなく使用することができる。 </li><li>無水DMSO（50μM最終濃度）にデンドリマーを溶かす。無水DMSOフルオレセインNHSおよびテトラメチルローダミン-NHS（TMR）の10mMのストック溶液を準備します。 </li><li>デンドリマー溶液にフルオレセインとTMRの所望の量を追加します。混合物中のモル比は、デンドリマー上にロード染料の量を反映する。通常、マイクロチューブ内のG4 PAMAMデンドリマー溶液1mlは、フルオレセインとTMRの8 EQ（40μL）の8 EQ（40μL）と反応させる。 12時間室温で溶液を撹拌した。 </li><li>脱イオン水で1:10に希釈し、反応を読み込む透析バッグ（MWCO = 10kDaの）中の混合物。リザーバ内に頻繁に水を交換し、脱イオン水に対して24時間透析。 </li><li> 24時間バイアル凍結乾燥の解決策を転送します。紫色の粉末が得られるはずである。重量が得られた固体および10μMの最終濃度でミリQ水に溶かす。 -20℃でのソリューションや店舗を分取</li></ol> 2 インビトロ pH測定<ol><li> in vitroでのキャリブレーションのために石英キュベット中のPBS中デンドリマーの溶液500nMの（2 mMリン）を準備します。滴定中のpHの急激な変化を避けるために、非常に希薄PBS緩衝液（2mMの）の使用を推奨します。 </li><li>フルオレセインの発光スペクトル（488nmで販売）及びTMR（大口550 nm）を測定し、良好な信号対雑音比を達成するために、蛍光光度計の光学設定を最適化する。 </li><li>すべての添加がキュベットを振った後、NaOHを0.1 N及びHCl 0.1 Nの小さなボリュームを追加することにより、pH滴定を行う混合するため、平衡化のために1分待ってからpHの微小電極を用いてpHを測定します。フルオレセインおよびTMRの発光スペクトルは、光の設定を変更せずにステップごとに記録されるべきである。 </li><li>滴定のためのpH対蛍光強度をプロットします。ローダミン信号は、pH（&lt;10％）による影響を受けなければなりません。フルオレセイン信号はS字状曲線でなければならず、主キー= 6.4のシングル結合モデルを装備する必要があります。 </li></ol> 3。細胞培養およびエレクトロポレーション<ol><li> 10％ウシ胎児血清および100 U / mlのペニシリンおよび100 mg / mlのストレプトマイシン（Invitrogen）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中でHeLa細胞を養う。加湿した5％CO 2雰囲気中37℃で細胞培養を維持する。 </li><li>デンドリマーエレクトロポレーションのために、細胞がコンフルエントされている場合、メディアを取り出し、DPBS（ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水）を用いて細胞を洗浄します。 DPBSを削除し、トリプシン-EDTAを追加します。トリップを中和血清を含む培地ではなく、抗生物質を添加することによって罪。室温で2分間900-1,200 rpmで遠心分離する。メディアを取り外し、DPBSを使用してペレットをすすぐ。 </li><li>細胞をカウントし、4 * 10 6個の細胞を取る。室温で2分間1,200-1,500 rpmで遠心分離する。 </li><li> （microporatorの製造元から提供されている）マイク​​ロポ緩衝液200μl中で細胞ペレットを再懸濁し、1.5 mlのマイクロチューブに細胞を移す。 </li><li>再懸濁細胞へのデンドリマーの水溶液を加える。サンプルごとに必要なデンドリマーの量は、PAMAMタイプ（カチオンと中性デンドリマーのために2μMのため、通常250 nM）を依存しています。 </li><li>マイクロポチューブに（microporatorの製造元から提供されている）エレクトロポレーション緩衝液を追加します。 100μl容量サイズのエレクトロチップで細胞やデンドリマーの混合物をピペット。ピペットステーションにmicroporatorピペットを挿入します。パルス電圧= 1005 V、パルスWID：マイクロポのためのパルス条件を設定する目= 35ミリ秒、パルス数= 2。 </li><li> 1,200 rpmで5分間の1.5mlマイクロ遠心チューブに細胞を遠心パルス伝達細胞は、培地中の過剰なデンドリマーを除去した後。新鮮な培地でプレート35ミリメートルのガラスボトムディッシュ上にエレクトロポレーションした細胞を10μl（WillCo皿GWSt-3522）W / O抗生物質。 </li></ol> 4。リビングHeLa細胞内のpHセンシング<ol><li>エレクトロポレーション後、共焦点顕微鏡を12時間と画像セル。 </li><li>フルオレセインおよびローダミンのための標準的なフィルタセットを使用することができる。チューナブルフィルタが使用可能な場合は500から緑のチャネルを設定する - 550 nmおよび650 nmの580 nmのから赤チャンネル。ローダミンはどちら543nmのか561レーザーラインで画像化することができますが488での励起は、フルオレセインに最適です。 </li><li>試料に焦点を当て、信号対雑音比を最大にするレーザパワーと検出器の利得を調整する。エレクトロポレーションが成功した場合、細胞は、両方のチャネルで明るく蛍光である必要があります。ザ·ローカライズが使用デンドリマーの大きさおよび電荷に依存します。多くの場合、いくつかのリソソーム局在性（小核周囲小胞）が原因エンドサイトーシスまたは区画に存在している。リソソーム局在化が支配的である場合、 すなわち 、蛍光の大部分がベシクル内部に不良信号局在化される細胞質ゾルにおいて観察され、これは、毒性および測定が廃棄されるべきである意味する。取得複数の画像を必要に応じて、順次、2つのチャネルを取得し、画像品質を向上させるために画像を平均化する。 </li><li>異なるpHでイオノフォアを有する緩衝液を用いて較正クランプセルのためのpHは、上記のようにpHをあたり少なくとも20細胞を獲得する。手順の詳細な説明およびバッファーの成分のためBizzarriや同僚を参照してください。16私たちは、pH = 5.5のpH = 7.5、少なくとも5点を測定することをお勧めします。 6未満のpHは、細胞に対して毒性ではなく、短い時間のために許容され、我々は可能な限り迅速に画像を取得することを示唆している。もし細胞アポトーシスの兆候を示さ、セルを廃棄し、再起動してください。 </li><li>データ分析のためのImageJまたは類似のソフトウェアを使用してください。緑と赤のチャンネルの画像をインポートし、バックグラウンドを減算し、ツールの「画像電卓」の画素比イメージングによってピクセルを作成します。 </li><li>所望のセルを選択する関心領域（ROI）を描画し、細胞内の緑から赤色の比率を測定します。取得したすべての画像を分析し、次にpHに対する比率をプロットします。 5.5から7.5の範囲での傾向は直線的である必要があります。得られた点の線形フィットは、pHに緑色〜赤色の比率を変換するために使用される較正曲線を与える。 </li><li>さらに対照として、いくつかの未処理細胞（NOイオノフォア）を取得し、得られた検量線を用いてpHを計算してみてください。 7.2と7.4の間の値​​を取得する必要があります。 </li></ol> 5。 インビボサンプル調製<ol><li>実験は、出生後のDとのC57BL/6J（雄と雌）を実施したAY 28と70。ウレタンの腹腔内注射（ すなわちエチルカーバメート）（20％生理食塩水中のW / V、20 mg / kgのウレタン）でマウスを麻酔し。動物は、同じ麻酔薬の心臓内注射したウレタンの過剰摂取を用いた実験後に屠殺した。 </li><li>手術中に皮質ストレス反応および脳浮腫を減少させるためにリン酸デキサメタゾンナトリウム（2 mg / kg体重）の筋肉内注射を行う。 </li><li>動物の頭を剃ると頭皮に2.5％リドカインゲルを適用します。 </li><li>両半球の頭蓋骨をカバーする皮膚のフラップをカットするはさみを使用して、 </li><li>生理食塩水を用いて露光骨を洗い、軽くピンセットを用いて骨膜を削除します。これは、接着剤とを接着するための歯科用セメントのためのより良い基盤を提供します。 </li><li>中央イメージング室とカスタムメイドのスチールヘッドポストを適用し、平面上にシアノアクリレートとそれを接着し、約私の皮質領域の上の頭蓋骨に平行なnterestと白の歯科用セメント（Paladur）で所定の位置に固定します。 </li><li>関心のある領域にわたって掘削直径2〜mmで開頭を実行するために、マウスの頭部を固定します。 </li><li>手術、硬膜涙、または出血の際に皮質の加熱を最小限に抑えるようにしてください。 </li><li>無菌ACSF（126のNaCl、3のKCl、1.2mMのKH 2 PO 4、1.3のMgSO 4、26 mMの炭酸水素ナトリウム、2.4のCaCl 2、15 mMグルコース、蒸留H 2 O中1.2のHEPESで灌流皮質を保つ液、pH = 7.4）。 </li></ol> 6。マウス脳におけるpHイメージング<ol><li> O 2富化空気を提供する実験援助動物呼吸の間。酸素は80％まで濃縮される。 O 2分圧および流量は、しばしば、適切な呼吸補助を得るために調整される。フィードバック制御された加熱ブランケットを37℃の体温を一定に保つ。 </li><li> 2 - 写真の目的の下に鋼製のポストを通して動物を修正しました。n個のイメージングセットアップ。 </li><li>大脳皮質にセンサーを注入するためにデンドリマー溶液（1μM）とAgCl電極（先端径4ミリメートル）を含むガラスピペットをロードします。電極は細胞外電場電位を記録することができるようになります。 </li><li>マイクロインジェクションのセットアップを150μm程度の深さで皮質にピペットを挿入します。 0.5 psiの圧力で1〜2分間注入する。 </li><li>イメージング用の光学セットアップを最適化します。レーザー出力は光退色と光損傷を最小化するように調整する必要があります。典型的に用いられるレーザパワーが以前の校正がこの電圧は、最良のS / N比が得られることが示されたのでミリワットおよびPMTゲインは667 Vで一定に保った約20である。 </li><li>イメージングのために820 nmでセンサーを励起し、標準FITC及びTRITCフィルターを通して、フルオレセインおよびローダミンの蛍光を同時に検出。 </li><li>時間分解測定は、2 Hzで、タイムラプスシリーズを獲得。 </li><li>バックグラウンド補正のためにLASEとダークフレームを取得するRシャッターは通常、電子回路によって追加された光電子増倍管と台座に発生する平均熱ノイズを測定するために閉鎖。 </li><li>データ解析のために第4章で報告されたのと同じ手順に従ってください。 </li></ol>

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デフォルト：著者は、開示することは何もありません。

デンドリマーベースのセンサとの正常なpHイメージングのための重要なステップは次のとおりです。I）正しい樹状足場の選択と、それに結合させ指標の数や細胞内や生体内でのセンサ配信プロトコルのII）は、最適化。 合成手順は非常に簡単であり、すべてのアミン持つハイパーブランチポリマーに仮想的に適用することができます。センサは、単一のステップにおいて市販のデンドリマーおよびNHS-活性化染料から得ることができる。我々は、このモジュール式で簡単な手順では、生物学のさまざまな問題のためにそのようなセンサの更なるアプリケーションのために有益であると考えています。精製は、効果的にコンジュゲートしていない色素を除去するために透析することによって達成することができる。樹状足場の選択は非常に重要であり、所望の特定のアプリケーションに依存します。異なるデンドリマーは、sとの特異的相互作用に起因し、細胞内の特有の局在を有することが示されているubcellular構造。 （PAMAM G4のアセチル化など）ニュートラルデンドリマーは、細胞内の任意の相互作用を示し、びまん性局在を...

特定の生体関連分子を標識するための蛍光分子の使用は完全に我々は生物学的システムを研究方法を変更しました。広視野と共焦点顕微鏡は、生物学的プロセスをリアルタイムで高解像度の可視化のために許可されたと、最近の細胞およびin vivoでのin vitroでの生物学的事象を研究するための最も人気のあるテクニックの一つです。1関連の改善は、蛍光指標の開発で表したその蛍光の特定の分子実体の濃度に依存する、 すなわち染料。 pHとカルシウムの指標は特に起因する生物学において、H +およびCa 2 +イオンの膨大な関連性に細胞生理学の研究に大きな影響を与えた。2,3 細胞内のtargetiにおけるI）難しさ：ただし、本センシング染料のほとんどいくつかの固有の制限は、次のような彼らの低分子行動に関連NGと、ii）水への溶解度が低い、その結果、貧困層、生体適合性、およびiii）細胞漏れ、したがって長期タイムラプスイメージング能力の欠如4はさらに、多くのプローブの信号は色素濃度への依存のために補正することができない（非。レシオメトリックイメージング）、したがって、細胞またはin vivoで絶対的な測定は不可能である。 我々は最近、デンドリマー骨格上の感知色素のコンジュゲーションに基づき、これらの制限を克服するための簡単で効果的な方法論を説明した図5デンドリマーは、生物学的用途のための非常に魅力的な特性を有する単分散ハイパーブランチポリマーであり、特に6は、複数の樹状アーキテクチャが開発され、使用されている薬剤7および遺伝子送達のために。8ごく最近になっていくつかのグループは、センシングデバイス用の足場として、これらの分子の可能性を探求し始めた。9,10,11 私たちは、以前にNHS-活性化エステルに基づく異なるポリアミドアミンの官能化に向けて容易に合成経路（PAMAM）足場を説明したコンジュゲート12のみを精製などの透析により単一工程で得ることができる。興味深いことに、このアプローチは容易に樹枝状またはポリマー足場、種々に適用することができる。13,14 i）のpH指示薬（ すなわち、フルオレセイン）およびii）pH依存性蛍光部分（ すなわち、ローダミン）：レシオメトリックイメージングデンドリマーを達成するために二重標識色素の2セットであった。これは、フルオレセインおよびローダミンとの比はpHにし、これ以上のプローブの濃度にのみ依存しているように我々に正確なpHの撮影を行うことができました。寿命は、その測定値が、レシオメトリック補正を必要としないプローブ濃度に依存しないように、この問題へのもう一つの興味深いアプローチは寿命ベースのプローブを使用する。15で表されます。しかし、LIFetimeの測定は、より複雑な楽器のセットアップを必要とし、それらの時間分解能は、従って、それらの潜在的用途を限定する、高速な生理的プロセスのために準最適である。 細胞内イメージングを行うために、プローブは、サイトゾルに原形質膜を横切って配信する必要がある。デンドリマーは、それらの大きさおよび親水性のために、膜透過されないように、細胞内送達は、エレクトロポレーションを介して達成することができる。この技術により、トランスフェクションのために広く使用される生物学において、標識された巨大分子を効果的に高品質のイメージングを行うために細胞内に送達することができる。巨大分子が直接細胞質に送達されるようにまた、エレクトロポレーションによりデンドリマーエンドサイトーシスに関連した合併症を回避することができる。興味深いことにエレクトロポ異なるデンドリマーの後でもシーケンスを対象とした全ての特定の非存在下では細胞内の個別のローカライズを示しています。5このPASSIVEのみによりデンドリマーの物理化学的特性のために、ターゲットに、オルガネラ特異なpHイメージングを実現するために悪用される可能性があります。 レシオメトリックイメージング、共焦点顕微鏡を用いて行うことができる。共有結合した樹状足場に結合させ、フルオレセインおよびローダミンは、別々に画像化したと画素ごとの比マップが作成されました。イオノフォアを用いて生細胞における細胞内pHを制御するために、いくつかの手順が報告された。イオノフォアは、原形質膜を横切ってイオンを輸送することができる小さな疎水性分子であり、H +イオンに対するイオノフォア、例えば、ナイジェリシンとして、入手可能であり、デンドリマーベースのセンサを較正するために使用することができる16これらの測定値を観察したものに同様にpHに線形応答を明らかにした。 in vitroで 。較正細胞内のpHに基づいて正確に測定することができる。これらの測定は、デンドリマーベースのセンサーは、研究H + homeost貴重なツールになり得ることを示し生きた細胞およびpH調整の誤動作を伴う病理学的プロセスにおいてASIS。 我々は最近、デンドリマーベースのpHセンサーは、麻酔したマウスの脳におけるpHの撮影を行う、 生体内でも適用することができることを実証した。17により生体組織の複雑な環境へのインビボ検出の高い品質が技術的に困難である。ここでは、脳内の正確なpHイメージングを実行するために取り組むべき重要な課題の重点を置いて、生体内のpHイメージングのための実験手順の詳細な説明を表示。二光子顕微鏡法は、2つの主な理由のために使用されている：i）の赤外光の使用は、標準的な共焦点顕微鏡の組織浸透性の欠如を克服することを可能にすること、ii）フルオレセインおよびローダミンの広い二光子吸収は、それらの同時励起を回避することを可能励起用2波長の使用に関連する合併症。マウス脳におけるpH測定であった正常に実行、センサーが容易に脳細胞外空間中のpHの変化を誘導する低酸素状態に応答します。これらの測定は、デンドリマーベースのインディケータが正常動物モデルにおけるin vivoでのpHの生理学的および病理学的変化を強調するために使用できることを実証している。

<table><tbody><tr><td>PAMAM G4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>412449</td><td></td></tr><tr><td>Carboxyfluorescein NHS ester</td><td>ライフテクノロジー</td><td>C-1311</td><td></td></tr><tr><td>TMR NHS エステル</td><td>Life technologies</td><td>C-1171</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Dyalsis bags</td><td>Spectrum Labs</td><td>132117</td><td></td></tr><tr><td>WillCo Dishes</td><td>WillCo Wells</td><td>GWSt-3512</td><td></td></tr><tr><td>ウレタン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U2500</td><td></td></tr></tbody></table>

合成、細胞の配送および<em&gt;インビボ</em&gt;デンドリマーベースのphセンサの応用

Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

蛍光指示薬の開発は、生命科学のための革命を表していた。遺伝的にコードされたと検知能力を持つ合成フルオロフォアは、高い空間分解能と時間分解能との生物学的に関連の種の可視化を可能にした。合成染料は、その高い同調性と測定可能な分析物の広い範囲に特に関心のおかげである。しかし、これらの分子は、低分子の挙動（溶解度が低い、ターゲット設定の難しさ、許可された多くの場合、無レシオイメージング）に関連するいくつかの制限を受ける。本研究では、デンドリマーベースのセンサの開発を紹介し、生細胞及びin vivoで、in vitroで pH測定のための手順を提示する。我々はそれらのいくつかの生物医学機器に広く使用される足場た彼らの多くの望ましい特性（単分散性、波長可変特性、多価性）のために私たちのセンサーのための理想的なプラットフォームとしてデンドリマーを選択します。蛍光のpHの抱合デンドリマー骨格にインジケータが彼らのセンシング性能の向上につながった。特に、デンドリマーの展示は、セルの漏れを低減し、細胞内ターゲティングを改善し、レシオメトリック測定が可能です。これらの新規なセンサは正常マウス脳におけるHeLa細胞を生体内及び生体内の pHを測定するために使用した。

図1は、異なる樹状足場に染料を感知するのコンジュゲーションの概略図を示す。得られた指標は、市販品から1つの合成工程で容易に得ることができる。アミン含有デンドリマーはDMSO中のNHS-活性化色素と反応させ、透析によって精製される。この一般的な手順は、すでに成功して、いくつかのデンドリマーの標識に使用されました。I）PAMAMデンドリマー世代2、4、6、12、ペグ化PAMAMデンドリマー17及びPEG-樹状雑種18。としての明確なデンドリマーは、樹枝状構造の選択が強く、目的のアプリケーションに、目的の試料に関連している細胞や組織（ローカリゼーション、毒性、浸透性、拡散）との異なる相互作用を示している。 ⅰ）pH指示薬と内部標準として働くII）pH非感受性部分：センサーは、蛍光色素の2セットを備える。 ALTH指標と参照の多種多様ウワーッ利用できる、最良の結果は、フルオレセインおよびテトラメチルローダミンで得られている。つの色素の比は、反応において異なるモル当量を使用して簡単に調整す...

蛍光センサーは、生命科学の強力なツールです。ここでは、生細胞およびin vivoでのpHを測定するために、デンドリマー系蛍光センサーを合成し、使用する方法を記載している。樹状足場が改善検知特性につながる共役蛍光色素の特性を高める。

合成、細胞の配送および<em&gt;インビボ</em&gt;デンドリマーベースのpHセンサの応用

The development of  fluorescent indicators represented a revolution for life sciences. Genetically  encoded and synthetic fluorophores with sensing ...

本実験の全体的な目的は、生細胞内および生体内のin vitroおよびin vivoにおけるpHイメージングに最適化した、特性を向上させたデンドリマーベースの新しい蛍光センサーを開発することである。これは、まずpH感受性色素を、標的化基やpH非感受性色素などの他の部位とともにデンドリチック・スキャフォールドに結合させることで達成される。次いで、生細胞内のpHをイメージングするために、in vitroでの測定を行い、pH校正曲線を作成する。センサーはエレクトロポレーションによって導入され、共焦点顕微鏡を用いて脳の細胞外空間のpHをイメージングし、pHマップを作成します。生理学的および病理学的な神経活動の間、麻酔をかけたマウスの脳にセンサーを微量注入します。その後、2光子顕微鏡を用いて蛍光データを取得します。得られた結果は、drimmerベースのセンサーが生細胞およびin vivoの両方において、高い空間・時間分解能でpH変化を測定することに成功したことを示しています。pH感受性を有するいくつかの蛍光染料がすでに利用されていますが、それらは可動性の低さや細胞外への漏出などのいくつかの欠点があります。さらに、それらではレシオメトリックな絶対測定を行うことができません。本研究では、pH感受性色素のDNA遺伝子スキャフォールドへの結合を実証しました。本手法は、空間的および時間的分解能を備えた正確な測定が可能であるため、生細胞内でpHによって調節される生理学的および病理学的プロセスの研究に有用なツールとなり得ます。神経系におけるpH調節の破綻は、脳卒中やてんかんなどのいくつかの疾患に関連していますが、既存のpHセンサーは効果が不十分であることが判明しており、それが本センサーの設計につながりました。本手法はここではpHイメージングに適用されていますが、汎用的なアプローチであり、他の生物学的に重要な分子にも適用可能です。利益感知染料を選択することで、簡便で汎用性の高い合成アプローチにより、これらの手順は単純になります。本日の手順の実演は、Giovanni re、Barbara ti、Marco Brody、およびSebastian Suliが担当し、pH指示薬をPiam Demersに結合させます。まず、プライマーを無水DMSOに溶解し、最終濃度を50 micromolarに調整します。フルオレセインNHSおよびTetraethyl RUMINE NHS（TMRとしても知られる）の10 µMストック溶液を、無水DMSOを用いてマイクロ遠心チューブ内で調製します。1 mLのG four peram dederer溶液に対し、8当量（すなわち40 µL）のフルオレセイン、または8当量（すなわち40 µL）のTMRを混合します。混合液中のモル比は、デマーにロードされる染料の量に対応します。この溶液を室温で12時間攪拌します。次に、混合物を脱イオン水で10倍に希釈し、分画分子量10 kilodaltonsの透析膜に反応混合物を充填します。脱イオン水に対して透析を行い、24時間かけてリザーバー内の水を3回交換します。翌日、溶液をガラスバイアルに移し、-80°Cで数時間凍結させます。溶液が完全に凍結したら、バイアルを凍結乾燥機に移し、24時間凍結乾燥させます。紫色の粉末が得られるはずです。得られた固体を回収し、最終濃度が 10 µM となるように MQ water に溶解させます。この溶液を 1.5 mL マイクロ遠心チューブに 50 µL ずつ分注し、-20 °C で保存します。in vitroでの校正のために、石英製キュベット内で2 mMのPBSを用いて500 nMのD drummer溶液を調製します。滴定中の急激なpH変化を避けるため、非常に低濃度のPBSバッファーを使用します。フルオレセインとTMRの放出スペクトルを測定し、十分な信号対雑音比を得られるようフルオリメーターの光学設定を最適化します。次に、0.1 normal 水酸化ナトリウムと 0.1 normal 塩酸を少量ずつ加え、pH滴定を行います。添加ごとにQ vetを振って混合してください。平衡に達するまで1分間待ち、pH計を用いてpHを測定します。フルオレセインおよびTMRのマイクロ電極放出スペクトルを、いかなる変更も加えずに各ステップで記録してください。光学設定において、蛍光強度をpHに対してプロットします。滴定に関しては、ロッドドミネ信号はpHの影響を受けないはずです。フルオレセインシグナルはシグモイド曲線となり、エレクトロポレーションにおけるPK 6.4のシングルバインディングモデルでフィッティングされるはずです。再懸濁したHeLa細胞6 × 10⁵個を72 µLで1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。2 µM濃度のdendri水溶液を加え、エレクトロポレーション緩衝液3 mLをマイクロピューレーションチューブに加えます。次に、10 µL のエレクトロポレーション用チップを使用して、細胞とプライマーの混合液を吸引します。続いて、マイクロピペットをピペットステーションに挿入し、マイクロポレーションのパルス条件をここで設定します。パルス電圧は 1005 V に設定します。パルス幅を35 millisecondsに設定し、パルスプレート後のパルス数を2回に設定します。エレクトロポレーション後の細胞20 µLを、抗生物質を含まない新鮮な培地が入ったガラスボトムディッシュに播種します。エレクトロポレーションの12時間後、フルオレセインおよびローダミン用の標準フィルターセットを用いて、共焦点顕微鏡で細胞を観察します。検体にフォーカスを合わせ、レーザー強度と検出器ゲインを調整して、信号対雑音比（S/N比）を最大化します。エレクトロポレーションが成功していれば、細胞は両方のチャンネルで強く蛍光を発します。局在は、使用したDのサイズと電荷に依存します。多くの場合。核周囲の小さな小胞として観察されるSunのリソソーム局在は、エンドサイトーシスまたは共区画化によって生じます。蛍光の大部分が小胞内に局在し、孔形成シグナルが細胞質で観察されるなど、リソソーム局在が優勢な場合は、毒性を示しているため、その測定値は破棄する必要があります。2つのチャネルを順次取得し、数枚の画像を撮影してそれらを平均化することで、画質を向上させます。pH較正曲線を作成するには、異なるpHのopforを含む緩衝液を用い、細胞内および細胞外のpHを同じ値に揃えます。pHごとに少なくとも20枚の細胞画像を撮影し、pH 5.5からpH 7.5まで、少なくとも5つのポイントで測定を行います。pH B sixは細胞に対して毒性がありますが、短時間であれば耐えられます。そのため、撮影時間はできるだけ短くしてください。アポトーシスの兆候が見られた場合は、細胞を廃棄してやり直してください。撮影後、データ解析にはImage Jまたは同様のソフトウェアを使用します。まず、緑色と赤色の比率を算出します。次に、その比率をpHに対してプロットして線形トレンドを作成し、今後の実験で比率をpHに変換するために使用できる検量線を作成します。in vivo サンプルの調製では、生後 28 日から 70 日の C 57 black six J の雌マウスを使用します。ウレタンでマウスを麻酔した後、足指をピンチして動物が完全に麻酔状態にあることを確認し、皮質ストレス反応と脳浮腫を軽減させるために眼軟膏を塗布します。手術中に、デキサメタゾンリン酸ナトリウムを体重 1 kg あたり 2 mg の用量で筋肉内に注射します。次に、外科用バリカンを用いて動物の頭部を剃毛し、手術用ドレープを敷いて頭皮に2.5%リドカインゲルを塗布します。ハサミを使用して、両半球の頭蓋骨を覆っている皮膚フラップを切開します。露出した骨を生理食塩水で洗浄し、ピンセットを用いて骨膜を慎重に除去します。これにより、接着面がより良好になります。接着剤と歯科用セメントを用いて、中央にイメージングチャンバーを備えた特注の鋼製ポストをシアノアクリレートで固定し、頭蓋骨の皮質関心領域上のほぼ平行な平面に接着します。その後、白い歯科用セメントでポストを完全に固定します。マウスの頭部を固定し、目的領域の上方をドリルで穿孔して、直径2〜3 mmの開頭術を行います。穿孔の手技中は、手術中の皮質の加熱を最小限に抑えるため、シリンジを用いて新鮮な滅菌CSFを頭蓋骨に頻繁に塗布してください。開頭後、対物レンズの下で頭部を静止させるため、動物をイメージングステージに移動させます。イメージングチャンバーを調節可能なポストにネジで固定します。酸素に接続されたカスタムメイドのプラスチック製マズルを装着します。これにより、実験中に酸素濃縮空気が供給され、動物の呼吸が補助されます。センサーを脳皮質に注入するために、先端径4 mmのガラスピペットに塩化銀電極を装填します。1 µMのdrimmer ER溶液を用いることで、この電極はマイクロインジェクション装置による細胞外電位の記録を可能にします。ピペットを皮質の深さ約150 µmまで挿入してください。イメージングのための光学系を最適化するため、0.5 pounds per square inchの圧力で1〜2分間注入します。光退色および光損傷を最小限に抑えるようにレーザー出力を調整してください。通常、レーザー出力は約20 milliwattsに設定し、PMTゲインは667 voltsで一定に保持します。レーザー波長を820 nanometersに設定してセンサーを励起し、標準的なFTSEおよびtritフィルターを用いてフルオレセインとrod domineの蛍光を同時に検出するようにソフトウェアを設定します。また、背景補正のため、取得周波数を2 hertzのフレームレートに設定します。レーザーシャッターを閉じた状態でダークフレームを取得し、PMTおよびペデスタルで発生する平均熱ノイズを測定します。最後に、pH依存的な蛍光画像を取得し、後の解析のために保存します。以前と同様にデータを解析し、フルオレセインとルミンのin vitroにおける挙動を評価します。ライマーに負荷し、フルオリメーターを用いてpH滴定を行いました。この図は、pHセンサーの代表的なタイトレーションを示しています。フルオレセインとルミノールは、それぞれ488 nmおよび550 nmで個別に励起させることができ、図に明確に示されている通り、2つのチャネル間のクロストークを最小限に抑えることが可能です。フルオレセインはpH依存的な挙動を示しますが、ルミノールのシグナルは生理学的pH範囲において大きな変化は見られません。したがって、これら2つの信号の比率はセンサー濃度に依存せず、pHのみに依存します。次に、インジケーターを細胞内に導入するため、HeLa細胞にdedererセンサーをエレクトロポレーションし、本ビデオで説明した通りに共焦点イメージングを行いました。これらの共焦点画像は、左側にフルオレセインチャネル、中央にR domineチャネル、そして右側にpHレシオメトリックマップとして表示した細胞を示しています。強いフルオレセインおよびローダミン信号が観察され、それらが共局在していることから、センサー構造の完全性が示された。2つの画像をピクセルごとに除算してレシオメトリックマップを再構築し、疑似カラースケールで表示した。細胞内でのセンサー応答を校正するため、ここに示すように、イオノフォアを用いたpHクランピングを行った。指示薬は、緑色と赤色の比率の変化によってpHに迅速に反応します。得られたデータを用いて、正確なpH測定のための検量線を作成しました。検量線における線形的な傾向は、細胞環境からの干渉を受けることなく、センサーがpHに反応できることを示しています。デンドリマーベースのセンサーが生体内イメージングにどのように利用できるかを示すために、デンドリマーを注入した麻酔状態のマウスの脳においてpHイメージングを実施しました。フルオレセインおよびローダミン信号を820 nmの励起で同時に取得し、生細胞測定と同様にピクセル単位で比率マップを作成しました。注目すべき点として、インジケーターは細胞外空間に局在するため、画像内の非蛍光領域は細胞体または微小血管であり、これによりpHに対するセンサーの応答を検証することができます。我々は高二酸化炭素血症を利用しました。実際に、二酸化炭素は血液および組織内の炭酸緩衝系の平衡を変化させ、組織の酸性化を引き起こすことが知られています。このプロットに示されているように、30%の二酸化炭素を吸入させると、センサーの強い反応を誘導するのに十分であり、マウスを再換気させることで完全に回復します。これらの結果は、生細胞およびin vivoにおけるpHの生理学的および病理学的な変化を明らかにする上で、ベースセンサーを活用する手法が有効であることを示しています。また、本手順は電気生理学的記録などの他の測定法と併用可能です。これにより、進行中の生物学的プロセスに関する相補的な情報を同時に得ることが可能となりました。本手法の開発により、細胞生物学および神経生物学の研究者が、培養細胞および生体内におけるpH調節プロセスを探索する道が開かれました。

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Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

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合成、細胞の配送および

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