蛍光タンパク質を発現する生きたマウスでのイメージング細胞内の構造物の生体顕微鏡
2013年9月1日
生体顕微鏡は、生きた動物の様々な生物学的プロセスを画像化可能にする強力なツールです。この記事では、生きたマウスの唾液腺では、このような分泌顆粒として細胞内構造のダイナミクスを画像化するための具体的な方法を提示する。
この手順の全体的な目標は、マウスの唾液腺の細胞内構造を視覚化することです。これは、最初に唾液腺を損傷することなく外科的に露出させることによって達成されます。第2ステップでは、麻酔をかけた動物を顕微鏡ステージに固定します。
次に、唾液腺は、最終ステップでその機能を損なわないように慎重に配置されます。マウスはカスタムホルダーで安定しており、動物の心拍や呼吸による運動アーチファクトを最小限に抑えます。最終的に、細胞内構造のダイナミクスは、生体内顕微鏡法で画像化できます。
麻酔の前に、マウスの体重を量り、麻酔薬の適切な用量を決定します。次に、イソフッ素吸入により麻酔前麻酔を誘発します。動物が意識を失ったら、15分ごとにポップピンチで鎮静を確認し、手術中はマウスをヒートランプの下に保ちます。
直腸プローブ温度計で動物の体温を監視します。次に、電動バリカンでマウスの首を剃り、エタノールに浸したガーゼスポンジを使用して首の腹側を拭き、キムワイプで余分なアルコールを乾かします。次に、鈍い湾曲したピンセットを使用して、マッシターマッスルの下側端にある小さな皮膚を持ち上げ、小さな切開を行います。
はさみを切開部に挿入し、先端を皮膚の下側に向けて上向きにし、皮膚が下にある組織から分離するまでブレードを数回開きます。次に、神経管と血管が唾液腺を体の他の部分に接続する唾液腺の基部近くから始めます。はさみを使用して、ほぐした皮膚の幅3ミリメートル、長さ10ミリメートルのストリップを切ります。
創傷部を洗浄した後、結果として生じる開口部は楕円形になり、約8 x 12ミリメートルの大きさになります。両方の唾液腺が見えます。シリンジを使用してカットの中央に光結合ゲルを塗布し、次に滅菌ガーゼの新しい部分を使用して、すべての血液と抜け毛が除去されるまで、開口部の外側に向かってゲルを拭きます。
次に、7番のピンセットを使って右の唾液腺の先端を見つけ、腺の上部から数ミリメートル上の結合組織をつかみます。次に、実質を傷つけずに腺の周りの結合組織を引き裂きます。腺が露出したら、結合組織を腺からそっと分離し、生理食塩水で出血を洗い流します。
すべての結合組織が分離され、腺が完全に露出していることを確認してください。動物を顕微鏡に持ち込む前に、厚いガーゼとヒートパックを顕微鏡ステージに置き、ヒートパックの上部も薄いガーゼで覆います。ステージの中央にカバースリップを置きます。
次に、マウスをガーゼの上の右側に置き、右前足の腹側にマスキングテープで動物を固定し、切歯の周りに絹の縫合糸を引っ掛けます。糸と足の間に張力をかけ、ステージに取り付けます。マスキングテープを多めに貼れば、唾液腺は自然に休むはずです。
カバースリップの真ん中に。顕微鏡ステージに結合されたプラスチック製のくさびを使用して、マウスの頭と胸部をさらに安定させます。次に、レンズの小片を腺の上にティッシュペーパーをクリーニングします。
グランドを少し伸ばし、カスタマイズされたホルダーをグランドの上に置きます。次に、スタビライザーを金属製のクランプとマスキングテープでステージにしっかりと結合します。動物をガーゼとヒートパッドで覆い、柔軟な熱結合プローブを装備した温度計で露出した腺の温度を監視します 動物を安定させた直後に、エピ蛍光照明を使用して腺の表面に焦点を合わせます。
毛細血管内の血流と組織の全体的な形態を評価します。GFP遺伝子を励起するには、488ナノメートルのレーザーを使用します。ピーク電力を0.5ミリワットに設定して、タンデムトマトタンパク質の光退色を防ぎます。
561ナノメートルのレーザーを使用し、ピーク電力を1ミリワットに設定します。次に、選択した領域を事前にスキャンすることにより、組織の安定性を評価します。調製物が安定していない場合は、それに応じて動物を調整して適切な焦点面を見つけます。
プレモードです。レーザー構造、分泌顆粒、原形質膜がはっきりと見えるようになるまで、対物レンズを徐々にカバースリップに向かって動かします。次に、分泌顆粒のダイナミクスを画像化するには、フレームあたり0.5〜2秒のスキャン速度と、ピクセルあたり0.2マイクロメートルの空間スケールで256×256ピクセルを使用します。
顆粒と原形質膜を最適に視覚化するために、光学的厚さを0.9〜1.2マイクロメートルに設定します。次に、基準点として使用する視野の画像を記録します。最後に、調製したばかりのイソプロテレノールと生理食塩水を1キログラムあたり0.1ミリグラムを皮下に注射することにより、エキソサイトーシスを刺激します。
注射の1分後。分泌顆粒と原形質膜との融合は、顆粒の周りのGFP蛍光の増加とタンデムトマトペプチドのそれらの限界膜への拡散によって検出されます。GFPMトマトマウスでは、アシニンは、破線で示されているように、細胞質GFPと膜標的タンデムトマトペプチドを発現する明確に異なる構造として現れます。
個々のアシニンアセル細胞は、矢印で示されているように、タンデムトマトペプチドによって描かれます。GFPは、細胞内ではっきりと見える核でも検出されます。矢印で示された細胞質GFPは、直径約1〜1.5マイクロメートルの暗い円形の小胞として現れる分泌顆粒から除外されています。
外生現象を視覚化するために、イソプロテレノールの注射後に、アスタリスクで示される分泌顆粒が豊富な原形質膜の代表的な領域が示されています。原形質膜に近接する一部の分泌顆粒の周りの緑色の矢印で示されるGFP蛍光レベルの上昇が観察できます。さらに、原形質膜との融合後、タンデムトマトペプチドは、赤い矢印で強調表示されているように、分泌顆粒の限界膜に拡散します。
30〜40秒後、秘書顆粒は徐々に崩壊し、それらの制限膜は頂端原形質膜に統合されます。ここで紹介するアプローチは、生きたマウスの特定の膜輸送プロセスのダイナミクスのイメージングを可能にするため、細胞生物学における大きなブレークスルーを表しています。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
本記事では、生体内顕微鏡を用いてマウス唾液腺の細胞内構造を可視化するための詳細な手法を紹介します。この手順には、唾液腺の外科的露出、動物の固定、およびモーションアーチファクトを最小限に抑えるための精密なポジショニングが含まれます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生物学
- イメージング技術
背景
- 生体内顕微鏡（イントラバイタル顕微鏡）を用いることで、生物学的プロセスのリアルタイムイメージングが可能になります。
- これは、動的な細胞構造の研究に特に有用です。
- 唾液腺は、細胞内ダイナミクスを観察するためのモデルとして利用されます。
- これらのダイナミクスを理解することで、さまざまな生理学的プロセスに関する知見を得ることができます。
研究目的
- 生体マウスにおける細胞内構造のダイナミクスを可視化すること。
- 分泌顆粒をイメージングするための信頼性の高い手法を開発すること。
- 唾液腺における細胞機能の理解を深めること。
使用方法
- 唾液腺を損傷させることなく外科的に露出させる。
- 麻酔をかけた動物を顕微鏡ステージ上に固定する。
- 機能を維持するため、唾液腺を慎重に配置する。
- マウスを安定させ、モーションアーティファクトを低減するためにカスタムホルダーを使用する。
主な結果
- 生体唾液腺における細胞内構造のイメージングに成功。
- 分泌顆粒のダイナミクスの実証。
- 生体動物モデルを用いた今後の研究に向けた本手法の検証。
- これらの構造の生理学的役割に関する知見。
結論
- この手法は、細胞内ダイナミクスを研究するための堅牢なアプローチを提供します。
- 生体内顕微鏡法は、さまざまな生物学的研究分野に適用可能です。
- この技術により、in vivoにおける細胞プロセスの理解が深まります。
よくある質問
業界における重要性
生体内顕微鏡法（イントラバイタル・マイクロスコピー）により、生体動物モデルにおける細胞内ダイナミクスのリアルタイム可視化が可能となり、標的バリデーションやパスウェイ解析に不可欠なメカニズムに関する知見が得られます。唾液腺における分泌顆粒のエキソサイトーシスおよび膜トラフィッキングをイメージングすることで、この手法は、代謝および分泌疾患の標的に関連するGPCR介在性シグナリングパスウェイの、前臨床段階でのリスク低減を支援します。このアプローチは、生理学的に適切なコンテキストにおいて分子レベルの摂動を機能的な細胞内出力に結びつけることで、初期創薬における予測の信頼性を向上させます。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：βアドレナリン受容体によって刺激される分泌顆粒の融合を直接観察することを可能にし、生体組織におけるGPCR標的の機能的検証をサポートします。
- 実用的価値：蛍光バイオセンサーを用いて、開口放出を制御するキナーゼ、ホスファターゼ、または細胞骨格調節因子を調査するための再現可能なプラットフォームを提供します。
- 治療的価値：サブセルラーレベルでの移行キネティクスをリアルタイムで定量化することにより、cAMP/PKA経路を標的とする化合物のメカニズム的なリスク低減を促進します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備状況： 安定化した唾液腺標本の調製により、化合物ライブラリースクリーニングにおいてGFPおよびtandem-Tomatoシグナルの一定なベースラインイメージングが可能になります。
- 定量的出力： パスウェイ調節の機能的リードアウトとして、顆粒融合頻度、膜拡散速度、および崩壊キネティクスの測定が可能になります。
- 拡張性： 外科的な安定化およびイメージングのワークフローは、標準化された温度および動作制御を用いることで、多頭動物研究に適応させることができます。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患との関連性：外分泌組織における調節性分泌をモデル化しており、膵炎、シェグレン症候群、または嚢胞性線維症膜貫通伝導調節因子（CFTR）機能不全の研究に適用可能です。
- バイオマーカーの連続性：顆粒膜および細胞質に対する蛍光レポーターにより、イメージングのエンドポイントと分泌の生化学的アッセイとの相関を確認できます。
- 前臨床段階のリスク低減：器官レベルの表現型解析の前に、ターゲットへの結合と機能的な細胞内アウトカムを関連付けることで、go/no-go判断を支援します。
パイプラインおよびワークフローへの統合
この手法は、ターゲットのバリデーションからリード最適化に至る創薬のコンティニュアムに適合し、リアルタイムのサブセルラーイメージングによって、作用機序やパスウェイの選択性に関する知見を得ることができます。
- 探索生物学：無傷の組織における下流エフェクターのリクルートメントと膜ダイナミクスを可視化することで、GPCRエフェクター経路の仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：空間的および時間的解像度を用いて、開口放出キネティクスに対する化合物の影響を評価するためのアッセイ準備を可能にします。
- 分析：蛍光強度の変化、拡散速度、および小胞崩壊のタイミングに関する定量データを生成し、実験条件間の比較を行います。
- トランスレーショナルリサーチ：疾患に関連する外分泌モデルにおいて、分子標的と機能的分泌を関連付け、ヒトの病態生理への外挿をサポートします。
- 企業の再利用：この安定化およびイメージングプラットフォームは、最小限の再バリデーションで、複数の蛍光レポーターや疾患モデルにわたって再利用可能です。
運用および企業への影響
- 科学的価値：エフェクターの移行および膜への組み込み事象を直接視覚化することで、シグナル伝達におけるメカニズム的な曖昧さを低減する。
- 運用上の価値：標準化された固定化およびイメージングプロトコルにより、研究室間や研究期間を通じた再現性が向上する。
- 戦略的価値：結合試験やバルク生化学的アッセイを超えた機能的な細胞内活性を確認することで、偽陽性のヒットをより早期に特定することが可能となる。
- ポートフォリオへの影響：生理的に完全でダイナミックな細胞環境においてパスウェイの関与を検証することで、ターゲット選定の信頼性が向上する。
実施上の検討事項
- マウスの外科手術、麻酔、および生体イメージング（intravital microscopy）セットアップに関する専門知識が必要です。
- 488 nmおよび561 nmのレーザーライン、サーマルステージ、およびモーションスタビライゼーションハードウェアを備えた共焦点顕微鏡に依存します。
- 実験全体を通じて腺へのアクセスと機能的安定性を確保するために、標準化された動物調製プロトコルが必要です。
- 他の組織に適応させる場合は、臓器の可動性とアクセスの違いにより、安定化アプローチの変更が必要になる場合があります。
- 光退色による制限があるため、経時的なイメージングには慎重なレーザー出力の校正とフレームレートの選択が必要です。
