Name: 無傷のゴキブリ神経系の神経回路の録音 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-04T20:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 学ぶゴキブリの腹神経索と尾毛神経からの細胞外記録技術。機械・電気刺激による感覚情報処理を神経回路レベルで解析し、中枢神経系での信号統合メカニズムを解明する方法です。

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私たちは、イラストHyewonクーパーに感謝します。

1。解剖このプロトコルを通して使用さゴキブリ食塩溶液は以下の組成を有する。 ゴキブリ食塩水36：（100ml 100ml用のグラム） 210のNaCl（1.227グラム） 2.9のKCl（0.0216グラム） 1.8のCaCl 2（0.0265グラム） 0.2のNaH 2 PO 4•2H 2 O（0.0032グラム） 1.8のNa 2 HPO 4•7H 2 O（0.0483グラム） （pHは7.2。1 M NaOHまたは1M HClでpHを調整する）。 <ol><li>堅牢cercusの複数形（ 図1）があり、貯蔵タンクの男性ゴキブリを選択します。男性は解剖が容易であり、かつ全く卵巣と卵の塊を含まない、男の最後のセグメントは、女性に比べて狭い。 Pの男性アメリカーナは cercusの複数形の間の短いスタイラスのペアを持っている。これらのスタイラスは、女性では観察されない。 </li><li>翼、足と頭を切り落とし、Diと体、腹側を上にして、ピンSHシリコーンエラストマーが並ぶ。 </li><li>鉗子で腹側のプレートをピックアップし、細かいハサミでそれらを切断し、後端から始まり、前方に取り組んでいます。 cercusの複数形の乾燥を維持しようとしているときには、必ず生理食塩水で湿った内臓を保つ。一つはcercusの複数形を濡らすから生理食塩水を防ぐために腹部を上方に配置するために、ワックスやゴムの部分を使用することができます。彼らが濡れた場合は、ティッシュペーパーの切れ端で、それらを乾燥させます。側に内臓し、白質（脂肪体）を押します。 VNCは、フィールドの中央である腹部の長さを実行し、光沢のある気管の間に表示されるはずです。神経索は半透明であり、照明は（ 図2）が適切に調整されるまで、最初は見えにくくすることができる。鉗子や虫ピンとVNCを処理しない、代わりにガラスプローブを使用して操作します。 </li><li>ピンセットで、微細なガラスの必要一対の神経索から可能な最良のように、動物の気管システムを一掃LESは、非常に慎重に、A6およびA5やA5とA4神経節（ 図3）の間で長手方向のVNC接続詞を分割します。クレードルcercusの複数形と短縮昆虫ピンとワックスまたは調製（ 図4AおよびB）を合わせてカット可能なシリコーンエラストマーのウエッジと生理食塩浴から上向きに腹部。神経節（ 図2Dおよび5）内に突出cercal神経を損傷しないように、最後の腹部のセグメント内に追加できるように注意してください。 </li></ol> 2。細胞外記録法<ol><li>解剖し準備、顕微鏡、および記録装置（ 図6）ニューロンからの信号をオーバーライドすることができ、外部、特に交流、電場を遮断するために、ファラデーケージの中に設定する必要があります。 </li><li>それは顕微鏡のステージを見下ろすされるように顕微鏡を配置します。製剤は、ステージ上に配置されると、高強度の照明ビームの位置を調整するそれを最大限可視化のために。 </li><li> （特定のハードウェアとソフトウェアの設定については、以前に25を説明してきた）統合されたデータ記録部にAC / DC差動アンプを接続します。吸引電極を保持ヘッドステージは、アンプに接続する必要があります。 Clで被覆された銀のアース線-より安定したレコーディング中の腹部の結果に挿入。その理由は、体腔内の溶液が皿の中の入浴流体と接触していない場合には、記録電極に関連付けられた流体は、接地のままである。 </li><li> 4 kHzに記録周波数を設定します。 500 mVで（これは微量の可視化を最適化するように調整することができる）に電圧スケール（y軸）を設定する。刺激に反応して神経活動を記録するために、連続またはオシロスコープモードで録音ソフトウェアを実行します。 </li><li> A5に近いのVNC接続詞の1をカットし、吸引電極にA6に装着切り口を置く。 Pに確認してください神経を吸引する前に内部の銀線をカバーするために吸引電極に生理食塩水をULL。 </li><li>各尾角に位置して毛の上の乾燥ピペットブロー空気と。記録された結合に尾角の同側の毛を刺激すると、反対側の1とは異なる応答を与えるかどうかを確認します。応答の振幅と刺激中の指定された時間間隔でのスパイクの数をメモします。 </li><li>記録cercal神経に吸引電極を移動します。必要に応じて、より良いフィット感を得るために、より小さな開口部に電極先端に切り替える。 </li><li> A6に近いcercal神経を切断し尾角につながる神経を吸う。活動電位の自然発火があるはずです。今、尾角に空気を吹き付けると応答に注意してください。 </li></ol> 3。電気的に募集を決定するために、感覚神経を刺激<ol><li>それはトレース（100〜500 MSEを記録するようにモードを掃引する録音ソフトを変更するC）たびに刺激がトリガされます。 </li><li>刺激装置の出力に刺激電極を接続します。 </li><li> 2ミニフックリードまたはクリップで、刺激ケーブルを接続します。 </li><li>記録部上のトリガ入力に刺激装置からのBNCトリガ出力を接続します。 </li><li> 10ミリ秒、周波数：1Hzで、電圧：必要に応じて（ちょうどしきい値を超えると、最大応答を得ることができること）のレコーディングに信号を得るために調整し、：時間：ディレイ0.3秒以下の刺激パラメータは、応答を呼び起こす必要があります。高電圧が神経にダメージを与えることができるように募集のための最大しきい値よりもはるかに高い電圧に行く理由はありません。 </li><li>長い神経根を刺激吸引電極（ 図7、矢印の頭）に引き込むことができるように、可能な限り遠位としてcercal神経を切った。 A6およびA5または別のセグメントより前方の間の結合を使用することができます。 </li><li>記録吸引電極を設定することができますので、PU電極中に切断された結合を事前にチェック！神経を吸引する前に内部の銀線をカバーするために、吸引電極にいくつかの生理食塩水を引くようにしてください。刺激電極はまた、（A3近い腹部に最適です）バス生理食塩水に接地されていることを確認します。 </li><li>活動電位が画面に表示されるまで増加する電圧の単一刺激のシリーズを提供します。一つは、応答を募集する最小限の刺激電圧と継続時間の記録を確認する必要があります。接続詞におけるシナプス応答が観察されるまで、強度を上げる。巨大軸索からの大きなスパイク（細胞外のAP）が最初に表示され、その後、他の小さいのAPも観察することができる。 </li></ol>

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著者らは、利害の対立が存在しないことを宣言します。

この古典的な製造のための技術を発揮する理由の一つは、cercusの複数形のシステムがあったことであり、まだ神経回路の発達の問題に対処するだけでなく、シナプスの修復および再生26〜31についての質問での研究の活発な分野である。ゴキブリ腹側神経索において活性を誘発するいずれかの方法は、神経系機能に対する薬理学的物質又は殺虫剤の効果を調べるために使用することができる。これらの実験は、単純に生理食塩水に神経活性化学物質を溶解することによって行われます。接続詞または運動神経から記録しながら、通常の入浴培地でこの溶液を交換した後、誘発または自発的活動の変化は、CNSの機能に対する化学物質の効果の一貫性のある読み出しを与えるように観察することができる。 すべての神経生理学の実験のように、一般的な問題は、電気的なノイズです。これらの製剤のための信号品質の、おそらく最大の要因I神経組織のSの吸引電極シール。完全cercal神経または結合で描画しないタイトなシールが理想的です。記録はまた、神経索および鉱物油およびワセリンの混合物でVNC絶縁膜下に置かれた二重フック電極を作製することができる。この混合物をシリンジに充填し、神経索32の周囲に排出することができる。また、慎重な解剖は、いかなる中枢神経系の調製と、ここのように非常に重要です。いくつかは、それが簡単に背キューティクルを解剖によってCNSにアクセスするために見つけることができます。これは、腹側神経索を損傷する可能性を低減しながら、このアプローチを用いて内臓の全てを除去することはより困難であることができる。 それはここでは説明しませんが、この準備は巨大介在ニューロン32,33の細胞内記録に適している。全体の神経索はまた、同時に複数の記録及び刺激電極を収容するために除去することができる。触角葉、キノコBOのファクト探査DY、およびその他の前部CNS構造が進行中34〜35のままです。ゴキブリ中枢神経系は、現代の神経生物学的研究に光を当てるために続けているが、この特定の準備は、学部学術の研究室で使用するのに十分に簡単です。

そこに4,000人以上のゴキブリ種があるが、約30の家庭害虫である。おそらく最も有名なアフリカに起源名前の誤りワモンゴキブリワモンゴキブリであり、現在では地球上のほぼどこにでも発見された。熱帯地方での急速な走行速度1と回避行動に加えて、P.アメリカーナは、飛行2,3することが可能である。 ゴキブリ中枢神経系（CNS）の主な特徴は、制御プロセス4,5のセグメント化され、その性質および分散化である。脳、胸部、および腹部神経節、腹側神経索（VNC）を形成する一対の神経節間の結合子によって結合されている。 各セグメントでの神経節はセンターを統合している。これらは、単にそれらの下に血液脳関門透過性を担う細胞を含む外、皮質領域、および神経細胞の細胞体のorigiから構成されているその神経節でのNAT変換。これらの細胞体はニューロン、調節ニューロン、または運動ニューロンに属していてもよい。彼らは、原点（ローカル介在ニューロン）の神経節内にとどまる軸索、またはCNSの神経節の間に突出した軸索（神経節間の介在ニューロン）を供給または周辺筋肉細胞（運動ニューロン）に終了します。ほとんどの細胞体は、神経節皮質5に腹または腹部外側に位置している。対になった、神経節間の結合子だけ軸索なし神経細胞体が含まれています。 神経節の神経網は、グリア細胞（神経膠）、軸索管、軸索の束、および神経細胞の樹状突起（神経突起）が含まれています。神経網は、神経細胞体を欠いている。これは神経細胞および入力の積分間の直接的な通信が発生するシナプス神経節内の領域である。 ワモンゴキブリPの能力（足、漢を検出して、急に近づいて捕食者への対応アメリカーナD などが 。）cercusの複数形と巨大な繊維系の6,7で構成されていますリフレックス回路に起因している。 cercusの複数形は、腹部の終わり（ 図1）上にある角状、風の影響を受けやすい構造のペアです。 Pにアメリカーナ各尾角の腹面は約200糸状（糸）14の列に編成された毛髪が含まれています。これらの列のうち9は、一貫して関連した受容体細胞および軸索の応答特性に応じて異なる動物で同定することができる。それぞれの髪は、それが列固有である1面内で最も容易に曲げることを可能にするソケットです。その面に沿って一方向に髪の動きは、受容体細胞内の脱分極および感覚神経における活動電位のバースト（AP）を誘導する。反対方向への移動が進行中の自発的APが8を阻害する。レスポンスのたわみや方向性の好ましい面は、各列に異なっている。このように、filiform本の毛髪 - レセプター複合体は空気の動きを検出するだけでなく、APは、気流が発信された方向の形で、「コーディング」のためだけでなく、担当している。 CNSによるこの情報の処理は、「適切な」逃避反応6,7になる。感覚毛のこの機能は、柱状特異性は、動物から動物に保存されている。 各糸状の毛の受容体細胞は、（受容体細胞の軸索9のAPのバーストまたは阻害をもたらす神経イベントに毛の機械的変位を伝達する責任があります。APはcercal介して端子腹部神経節（A6）に旅行彼らは腹側神経索（VNC）の巨大軸索とシナプス神経XIは、巨大軸索は、逃避行動6,10,11をもたらす、運動ニューロンの伝達およびその後の励起に関与すると考えられている。 行動レイテンシーOPの逃避反応F アメリカーナは、任意の動物7の最短の一つです。行動待ち時間が機械受容の刺激の到着と逃避応答の開始の間の時間です。攻撃ヒキガエルから試行脱出を記録するために、高速撮影技術を用いた実験では、ゴキブリを移動7,12ゴキブリ舌伸長の開始から約40ミリ秒（時間的に離れてヒキガエルからの回転を開始することが観察された。制御された風力パフを使用して、行動の待ち時間は11ミリ秒に減少させることができた。他の実験はさらに低い速度（3ミリメートル/つつ（2ミリ秒600ミリメートル/加速度付き）12ミリメートル/秒の最小風パフ速度は、逃避反応を呼び起こすことができることを明らかにした秒）は12を移動を停止する、ゆっくり歩いてゴキブリが発生していました。 通常、巨大ファイバシステムと逃避行動の間に存在する強い相関関係がうまく13,14文書化されています。 instの中特定のセルが必要な特定の行動を喚起するのに十分であるancesセルは、コマンドニューロン15,16と呼ばれている。 Pの風エスケープ回路巨大介在ニューロン（GIS） アメリカーナは反射的に必要ではない。実験的に切除されたGISを活用した動物は、まだそのため、これらのGIをコマンドニューロン17,18考慮されていない逃避行動を示す。感覚回路に吻側である子宮頸部接続詞を切断することも脳からの入力を下降するエスケープ19の方向に影響を与えることを示す、行動に影響を与える。細かい制御と冗長性のこれらの局面は、生物の生存にとって最も重要であり、生体アミン20を介して神経化学的変調によって補完されています。 P.アメリカーナ神経索の準備はRoederの&lt;の先駆的な仕事から始めて、過去何十年にわたってneuroethologistsためのエレガントなモデルシステムでした&gt; 21 SUP。これは、ディスプレイを記録し、それらの入力22,23,24に巨大介在ニューロンによる一次知覚活動とその結果応答を分析するために学生を可能にします。識別可能な神経回路は、環境への行動反応の根底にあるという考えを伝えることに加えて、これらの演習は、この一般的な家庭害虫によって行われた生物学的な貢献に感謝を植え付ける必要があります。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;試薬&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>182 silicone kit</td><td>182 silicone elastomer kit</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;strong&gt;S7653&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>pH調整用</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td>pH調整用</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;器具・材料名&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>解剖器具</td><td>World Precision Instruments</td><td>assortment</td><td></td></tr><tr><td>昆虫ピン</td><td>Fine Science Tools, Inc</td><td>26001-60</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>World Precision Instruments</td><td>PZMIII-BS</td><td></td></tr><tr><td>ガラス電極</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS7095B5X</td><td>吸引電極、200本入り</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>World Precision Instruments</td><td>MD4-M3-R</td><td>ベースまたは金属棒に固定可能</td></tr><tr><td>銀線 (10/1,000 inch)</td><td>A-M Systems</td><td>782500</td><td></td></tr><tr><td>コンピューター</td><td>メーカー不問</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AC/DC差動アンプ</td><td>A-M Systems</td><td>Model 3000</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 26T</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td>27T</td><td></td></tr><tr><td>ヘッドステージ</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td></td><td>AC/DCアンプに付属</td></tr><tr><td>LabChart7</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>電気リード線</td><td>メーカー不問</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラス製器具</td><td>自作</td><td></td><td>神経操作用</td></tr><tr><td>ケーブルおよびコネクタ</td><td>メーカー不問</td><td></td><td></td></tr><tr><td>バルブ付きピペット</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7</td><td>500本入り</td></tr><tr><td>ビーカー</td><td>メーカー不問</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ワックスまたはモデリングクレイ</td><td>メーカー不問または地元販売店</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スティミュレーター</td><td>Grass Instruments</td><td>SD9 or S88</td><td></td></tr><tr><td>吸引電極用プラスチックチップ</td><td>地元のホームセンター (Watt'sブランド)</td><td>&amp;frac14; inch OD x 0.170 inch ID</td><td>小さく切断する。炎で加熱して引き伸ばし、先端を適切なサイズに切り戻す。</td></tr></tbody></table>

無傷のゴキブリ神経系の神経回路の録音

Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

ゴキブリ腹側神経索調製物は神経動物行動学実験のために、ニューラルネットワークモデル、および殺虫剤の生理学的効果を試験するための扱いやすいシステムである。この記事では、昆虫の神経系は、環境摂動にどのように応答するかを分析するために使用することができゴキブリの感覚モダリティの範囲を説明しています。ここに重点がワモンゴキブリにおける巨大ファイバ伝送にcercusの複数形が介在する逃避行動である。これは、その場に備えて神経活動の再現性のある録音を生成するために、中程度の解剖技術および電気生理学的な専門知識を必要とします。ペプチドまたは他の化学試薬は、次いで生理食塩水を含む溶液中で、神経系に直接適用することができる。中枢神経系の興奮状態のためのプロキシとして働くことができる殺虫剤はまた、前の切開およびエスケープ回路に投与することができる。これに関連して本明細書中に記載のアッセイはまた、rに有用であろう四肢再生とどのPの神経系の発達の進化に興味esearchers アメリカーナは、確立されたモデル生物である。

空気のパフによるcercusの複数形の毛の刺激は、いずれかの腹部神経節またはcercal神経自体（ 図8）との間に接続詞に付着した細胞外吸引電極を用いて記録することができ、一次感覚ニューロンの放電が発生します。二つの領域から記録されたスパイク振幅がミリボルト、数マイクロボルトのオーダーである。なぜなら神経節における感覚統合の複合活動電位またはcercal神経から記録された個々のスパイクとして観測スパイクの数は、連結語からの記録で観察されるよりも格段に大きい。しかしまた、原因電極と神経組織との間の緊密なシールするために、結合の記録が実質的にノイズの少ないがあることに注意してください。 cercusの複数形大きなスパイクで空気を吹くことによって結合子（ 図8A）で観察することができる。この刺激法を用いて、A3とA4との間の典型的なレコーディング<html> LY巨大ニューロン（単数または複数）の大きなスパイク特性を示す。物理的に鉗子でcercusの複数形をこすりながらcercal神経からの記録は、活動の強力なバスト（ 図8B 1）を生成した。他の記録では、空気の2パフは、それぞれcercal神経の急激なつぶし応答（ 図8B 2）を生成した。電気A3とA4の間の結合における吸引電極と記録とのcercal神経を刺激すると、1は（ 図8C 1）の応答を誘発する刺激閾値を観察することができます。 cercal神経の電気刺激は、明らかにこのような温度（ 図8C 2）のような操作的薬理学的薬剤を用いた研究や、地域の環境を取り囲んで、ために定量することができる接続詞での応答を誘発する。 <html> fig1.jpg &quot;/&gt; 図1。そのままcercusの複数形とワモンゴキブリ 。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig2.jpg" /> 図2。取り外し腹キューティクルに見られるようなゴキブリ神経索の腹側図（A）。矢印で概説されたセグメントの拡大図（B）に見られる。 （C）において、接続詞は、ガラスプローブとA4とA3の間にこぼれた。 6 番目の腹部神経節は2 cercal神経が尾終わりに出ると、（D）に示されている。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig3.jpg" /> 図3。ゴキブリ神経索の概略腹側のビュー。 YS &quot;&gt; <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig4.jpg" /> 図4。cercusの複数形は、生理食塩水浴から上向きに配置されている。開いた腹部が出cercusの複数形を保つために、シリコーンエラストマーの小さな楔形状片を上昇さローチの尾の端に生理食塩水（A）が殺到することができます浴の（B）。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig5.jpg" /> 図5。（矢印で概説さ）cercal神経と6 番目の腹部神経節。 <img alt="図6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig6.jpg" /> 図6。機器が設置しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50584/50584fig6large.jpg" target="_blank">LARを見るにはここをクリックしてください</a>GER図。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig7.jpg" /> 図7。刺激と記録電極を設置しました。 <img alt="図8" fo:content-width="5.75in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig8.jpg" /> 図8。様々な刺激手順に接続詞やcercal神経の神経録音。cercusの複数形で空気を吹かしながら、A3とA4の間に接続詞から吸引電極で記録（A）。物理的に（B 1）または空気パフを提供する、（B 2）cercal神経の活動の急速なバーストで結果をこすりながら、どちら吸引電極を有する一次cercalニューロンから記録。電気cercal神経を刺激することは接続詞で応答を生成します（ <strong&gt; C 1）。刺激強度が徐々に増加する（矢印は刺激アーティファクトの振幅を示している）し、次の誘発反応の強さに注意してください。 cercal神経の電気刺激は、応答（C 2）を定量化するための刺激における一貫性のためcercal神経を刺激することが、比較的より制御された手段を提供します。

この記事では、ゴキブリ腹神経索の解剖とcercal神経と結合子から細胞外記録を記述する。誘発反応はcercal神経またはcercusの複数形の直接的な機械的刺激の電気刺激によって生成されます。

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological ...

この技術は、生物が機械的な感覚刺激を通じて環境を検出する方法と、腹側神経索と円神経を露出させることにより、情報がCNSの高次中心にどのように統合および変換されるかを示しています。まず、腹側神経索の結合体から記録し、CNSが伝えている信号の種類を示します。次に、一次感覚ニューロンから記録して、一次ニューロンの活動と結合詞の活動を比較します。その結果、空気振動による細い毛の動きが電気信号とCNSにどのように関連し、その信号がどのように処理されるかが明らかになりました。この方法は、感覚ニューロン活動とゴキブリの統合に関する洞察を提供することができ、他の運動回路や他のモデル生物に適用することもできます。一般に、この方法に不慣れな人は、一次感覚神経から記録しながら感覚毛を乾いた状態に保つために動物を解剖するのが少し難しい場合があるため、苦労するでしょう。この方法は、神経束を損傷しやすいため習得が難しいため、視覚的にデモンストレーションすることが重要です。メスとは異なり、オスの最後のセグメントが狭く、卵巣や卵塊がない周囲が丈夫な保持タンクからオスのゴキブリを選択します。Pアメリカーナの男性はまた、女性では観察されない、周りの間に短いスタイルの目のペアを持っており、翼、脚、および頭を切り落としています。次に、体の腹側を上にして、鉗子付きのシリコンエラストマーで裏打ちされた皿に固定します。腹側板を拾い上げ、細いハサミで切り取ります 後端から前方に働きかけます 常に内臓を絞って湿らせてください 周囲を乾いた状態に保つようにしながら。これは、ワックスまたはゴムを使用して腹部を上げることによって行われます。シルク・ドゥ・ソレイユが濡れた場合は、ティッシュペーパーで乾かしてください。次に、内臓と白質を押しのけます。VNCは、腹部の長さを走る光沢のある気管の間に見える E.It はずです。VNCを見るために照明を調整する必要がある場合があります。VNCを鉗子や昆虫ピンで取り扱わないでください。代わりに、ガラスプローブを使用して操作します。細いガラス針のペアを持つ鉗子を使用して、動物の気管Eシステムを神経索から可能な限り取り除きます。VNC接続詞をA、6、5、またはA、5、4の間で縦に分割します。シリと腹部が生理食塩水浴から上向きに出てきます。短くした昆虫ピンとワックス、またはシリコンエラストマーのくさびを使用してください。神経節に突き出ている円の神経を損傷しないように、最後の腹部部分で特に注意してください。解剖された調製顕微鏡と記録装置は、ニューロンからの信号を無効にする可能性のある外部電場を遮断するために、ファラデーケージ内に設置する必要があります。顕微鏡がステージを見下ろすように配置します。次に、高強度イルミネータービームの位置を調整します。準備を最適に視覚化するには、AC CDC差動アンプを統合データ記録ユニットに接続します。マイクロ電極を保持しているヘッドステージは、アンプに接続する必要があります。録音を安定させるため。塩化物でコーティングされた銀線で腹部を接地します。銀色のアース線の理由は、体腔内の溶液が皿の入浴液との接触を失った場合です。その後、記録電極に関連付けられた溶液は接地されたままになります。次に、録音周波数を4キロヘルツに設定します。次に、トレースの電圧スケールを500ミリボルトで開始します。必要に応じてこれを調整し、ソフトウェアを連続モードまたはオシロスコープモードのいずれかで実行するように準備に設定します。VNC接続詞の1つを5に近づけて切断します。次に、6に取り付けられたカットエンドを、リンガー溶液をあらかじめ充填した吸引電極に入れます。乾いたピペットで、各サーカスの毛に空気を吹き付けます。サーカスの毛を録音された結合に対して同側に刺激すると、反対側のものとは異なる反応が得られるかどうかを確認します。応答振幅とスパイクの周波数に注意してください。次に、吸引電極を円形の神経に移動して記録します。フィット感が良くない場合は、開口部が小さい電極先端に切り替えてください。次に、円の神経を6に近づけて切り、サーカスにつながる神経を吸い上げます。これにより、自発的な活動電位が生じるはずです。次に、サーカスに空気を吹き込み、反応に注意してください。録音ソフトウェアをスイープモードに切り替えて、刺激がトリガーされるたびにトレースを記録するようにします。これらのトレースは 1 ミリ秒から 500 ミリ秒の間である必要があります。刺激装置の出力に刺激電極を接続し、刺激装置からのBNCトリガー出力を記録ユニットのトリガー入力に接続します。さて、特定の刺激パラメータは応答を呼び起こし、刺激電圧を調整して閾値をわずかに超える信号を取得し、最大の応答を得ることができるはずです。リクルートメントの最大しきい値よりもはるかに高い電圧に移行する理由はありません。高電圧は神経に損傷を与える可能性があるため、長い神経根を刺激的な吸引電極道路に引き込むことができるように、円神経をできるだけ遠位に切断します。現在、A 6と5神経節の間、またはより前方のセグメントの接続詞を使用できます。生理食塩水を吸引電極に引き込み、次にカット結合液を電極に引き上げます。刺激電極が浴生理食塩水に接地していることを確認してください。理想的には、記録電極は腹部の3の近くにある必要があります。次に、複合活動電位が画面に現れるまで、電圧が増加する一連の単一刺激を提供します。応答をリクルートするための最小の刺激電圧と持続時間をメモします。低く始めて、結合体のシナプス応答が観察されるまで強度を上げます。巨大な軸索からの大きなスパイクと細胞外活動電位が最初に現れ、次にcciで空気を膨らませることによって他の小さな活動電位も観察されます。この刺激的なパラダイムを使用して、接続詞に大きなスパイクが観察されました。3と4の間の接続詞からの記録は、典型的には、ピンセットでSiriを物理的にこすりながら円神経から記録する巨大な間ニューロンの大きなスパイク特性を示し、別の記録で2つの空気のパフを記録し、それぞれが吸引電極で円神経を電気的に刺激し、3と3との間の接続体に記録すると、円神経に急速な破裂反応を引き起こしました。4、誘発された反応への刺激の閾値が記録されました。円神経の電気刺激は、薬理学的薬剤または局所環境パラメータを用いた操作研究のために定量化できる結合体の反応を明確に引き出す 一度習得すると、この技術は適切に実行されれば約1時間で行うことができます。この手順を試みるときは、ピンセットで神経を挟まないように、または吸引電極で神経を強く引っ張りすぎないように覚えておくことが重要です。このビデオを見た後、ゴキブリの神経系を解剖し、感覚誘発細胞外記録を収集する方法についてよく理解していただければ幸いです。

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Neuroscience

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