直接標識プローブを用いた堅牢な3DのDNA FISH
2013年8月15日
私たちは、直接標識蛍光プローブを用いた3次元のDNA FISHによる核のアーキテクチャを分析するための堅牢で多目的なプロトコルを記述。
次の実験の全体的な目標は、単一細胞内の特定のゲノム遺伝子座の空間的構成を頑健に調査することです。これは、最初に蛍光標識プローブを作製して、最終的に目的のゲノム領域に結合して強調表示することで達成されます。次のステップは、プローブアクセスを可能にするために、スライド上に目的の細胞を接着、固定、および透過することです。
次に、プローブと細胞DNAの同時熱変性に続いて、一晩のプローブハイブリダイゼーション洗浄ステップを行い、非特異的に結合したプローブとdpiで対抗立位を除去します。細胞核を可視化するために、蛍光顕微鏡で得られた結果は、最終的に特定のゲノム領域が占める核の位置を明らかにします。この方法は、遺伝子間の機能的相互作用の決定など、核組織化分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。
この特定のDNA FISHプロトコルの主な利点は、高速で堅牢で、汎用性が高いことです。この方法はE ES細胞を用いて実証していますが、100〜250の背部から直接標識されたプローブなど、他の多くの細胞タイプにも適用できます。キロベースは、より小さなプローブが必要な場合でも、一貫して明るい信号を生成します。
40〜50キロベースのスミッド、または5〜10キロベースのインサートを含むプラスミドを使用してください。アンサンブルまたは UCSC ゲノムブラウザを使用して、特定の遺伝子に対応するバッククローンまたは smid クローンを同定します。反復沈殿または市販のキットを使用して高品質のバックDNAを調製するには、調製の清浄度は必要なプローブの量に比例します。
ラベル付けを 2 つの手順で実行します。まず、NIC変換を使用してアミノ対立遺伝子(DUTP)を導入します。次に、化学カップリングを使用してAM平均反応性染料を付着させます。
明るいプローブは強い魚のシグナルにとって重要であるため、明るいプローブの作成に時間を費やす価値があります。この手順は、細胞の治療と並行して行うことができ、一日の始まりに行う必要はありません。まず、10〜20ナノグラムの直接標識プローブと6マイクロリットルのCO 1D NAを6マイクログラムに混合しました。
次に、サケの精巣から1マイクロリットルの一本鎖DNAを9.7マイクログラム加えます。ミックスの量を水で100マイクロリットルに調整します。次に、3モルの酢酸ナトリウムを10マイクロリットルとエタノール275マイクロリットルを加え、ボルテックスで混合します。
混合物をマイナス20°Cで少なくとも1時間沈殿させます。次に、マイクロフージで降水量を最大速度で4°Cで30分間回転させます。次に、ペレットを70%エタノールで洗浄し、摂氏4度で5分間再度回転させます。
次に、ペレットを風乾します。その後、復活します。それを5マイクロリットルの脱イオン形態で吊り下げます。
1000 RPMで振とうしながら摂氏37度でアミドを敷き詰め、光から保護します。30分後、5マイクロリットルのデキストリン硫酸塩混合物を加え、攪拌しながらインキュベーションを続けます。さらに10分間、細胞がスライドに付着する傾向は、細胞の種類によって大きく異なります。
各細胞タイプについて、最適なセトリング時間と細胞密度を経験的に決定します。一貫した結果を得るためには、細胞は単一細胞懸濁液中にあるべきであり、スライド上にマウスES細胞を接着する。まず、スライド上のセルが見つかる領域を一周します。
疎水性ペンを使用して、通常の培養培地で80〜100マイクロリットルあたり20〜50,000個の細胞の懸濁液を調製し、細胞懸濁液を円に加え、加湿インキュベーターで細胞を約3時間付着させます。スライドを取り付けた後、スライドを4%PFAに10分間静かに沈めて細胞を固定します。スライドは、チップボックスのようなトレイで平らにする必要があります。
コプランジャーに室温試薬を使用します。まず、細胞を塩化トリスで10分間急冷します。次に、サピンとトリトンX100の混合物を使用して細胞を10分間パーマミーズします。
次に、細胞をPBSで2回、1回の洗浄につき5分間洗浄します。洗浄後、細胞を20%グリセロール中で少なくとも20分間インキュベートします。この時点で、スライドはマイナス20°Cで50%グリセロールに数週間保存できます。
1日以上保管すると、信号強度が増加するはずです。続行する前に、必ず細胞をPBS中の20%グリセロールで室温に平衡化してください。次に、液体窒素を使用してスライドを3回凍結および解凍します。
パチパチという音が止まったら1回ずつ滑らせます。数秒後、ペーパータオルにスライドを取り出して解凍し、不透明な凍結グリセロールが消えるのを待ってから再びスライドを凍結すると、最大15枚のスライドが3回の凍結融解サイクルで回転して快適に行うことができます。次に、スライドをPBSで2回、1回の洗浄で5分間洗浄します。
次に、スライドを0.1モルの塩酸で30分間インキュベートします。塩酸処理に続いて、PBSでさらに5分間洗浄します。次に、より強力なサピンとTriton X 100の混合物で細胞を再び浸透させ、スライドから界面活性剤を洗い流し、5分間のPBS洗浄を2回使用します。
これで、スライドを50%フォームアミドでXSSCに平衡化する準備が整いました。これは、平衡化しながら少なくとも10分間続くべきであり、プローブを数回ピペットで上下させ、その後、細胞スポットあたり10マイクロリットルを適切なサイズのカバースリップに移します。フォームアミドからスライドを取り出し、ペーパータオルで細胞の周りの余分な液体を乾かしますが、細胞のスポットが乾かないようにしてください。
次に、カバーを裏返します。セルの上のスライドに滑り込みます。カバースリップをゴムセメントでスライドに密封します。
セメントを完全に乾かし、スライドを光から保護します。次に、ホットプレート上でスライドを摂氏78度に正確に2分間加熱します。これは、適切に実行するために重要です。
カバーは、このステップ中に細胞を光から保護する必要があります 核の形態を可能な限り保存するため。セルを乾燥させず、ヒートロックの温度が適切であることを確認することが重要です。次に、スライドを湿ったペーパータオルで軽く密閉された箱に入れ、湿度を確保し、摂氏37度で一晩インキュベートします。
この手順は、カバースリップの周りからゴムセメントをはがすことから始めます。次に、カバーが滑り落ちて緩んで滑り落ちるまで、各スライドをX余剰SCに入れます。次に、スライドを50%フォームアミドで2つの余分なSCで45°Cで15分間洗浄します。
水浴に蓋をして、光から保護します。次に、スライドを0.2 XSSCで摂氏63度で15分間洗浄します。次に、摂氏45度で5分間XSSCを2回行い、最後に室温で5分間SEを過剰にします。
残りのステップはすべて室温で、5分間の洗浄から始まり、PBSはスライドをダッピーで2分間染色し、次にスライドをPBSで5分間保持します。カバースリップを取り付けるには、セルスポットごとに10μLの封入剤を適切なサイズのカバースリップに塗布します。次に、細胞を乾燥させずに、細胞スポットの周りから余分なPBSを乾燥させます。
カバーを裏返し、スライドに滑り込ませ、フィッシュプローブ調製プロトコルを使用してネイルワニスで密封します。NIC翻訳後、DNAの塗抹標本が見えるはずで、フラグメントの大部分は150〜700塩基対で実行されます。化学結合後、蛍光色素の取り込みは、通過するプローブの分光分析によって測定できます。
このようなプローブを使用することで、プローブの品質を判断するためのこれらの品質管理ステップが重要になります。エピ蛍光顕微鏡による自動イメージングが可能であった。これには、背景がほとんどない、シャープで簡単に識別できる魚のシグナルが必要です。
これは生の視野画像です。以下の画像は、自動的に同定・解析された原子核を表しています。さまざまな対立遺伝子間および遺伝子座間の距離が、各核の右上と両側に示されています。
この拡大では、白い点は視野ごとに識別された核を表しています。これらのヒストグラムは、上の緑の信号と下の赤の信号の間の最大対立遺伝子間距離を示しています。すべてのデータは、HBB遺伝子とHBA遺伝子、およびヒストンクラスターをカバーする異なる染色体上にプローブを配置したP 20生殖細胞からのものです。
これらは、マイクとKCおよびQ1遺伝子を覆うバックプローブで染色された胎児の肝臓核の例です。これらの画像から、魚類のシグナルの核座標を取得し、ゲノム領域の空間的関係を計算することができます。対立遺伝子間距離は、原子核半径の一部としてプロットされます。
このデータでは、赤色のプローブは緑色のプローブよりも有意に接近していました。また、より強いシグナルを必要とする共焦点顕微鏡法も実現可能でした。画像スタックは、染色体領域内の魚のシグナルの3Dモデリングに使用されました。
赤と白のこれらの2つのプローブは、マウス染色体の両端に近く、7番染色体全体の塗料は緑色で示されています。このビデオを見た後、単一細胞内の特定のゲノム遺伝子座の空間的位置を調査するためにDNAフィッシュを実行する方法について十分に理解しているはずです。この手順を試みる際には、すべての治療が核構造に影響を与える可能性があることを覚えておくことが重要であり、この手順に従って適切なものを含めることが重要です。
免疫魚のような他の方法は、遺伝子とタンパク質の間の空間的関係のような追加の質問に答えるために実行できます。
概要
本記事では、直接標識された蛍光プローブを用いた3D DNA FISHにより、核構造を解析するための堅牢なプロトコルを紹介します。この手法により、単一細胞内におけるゲノム遺伝子座の空間的配置を調査することが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- ゲノミクス
背景
- 核組織の構成を理解することは、遺伝子相互作用を解明する上で極めて重要です。
- 3D DNA FISHは、ゲノム領域を可視化するための強力な手法です。
- 本プロトコルは汎用性が高く、さまざまな細胞型に適用可能です。
- 直接標識されたプローブは信号強度を高め、より良好な可視化を可能にします。
研究目的
- 核構造を分析するための、迅速かつ信頼性の高い手法を開発すること。
- 遺伝子間の機能的な相互作用の研究を促進すること。
- 異なる細胞型に適用可能なプロトコルを提供すること。
使用した手法
- 特定のゲノム領域に対する蛍光標識プローブの作製。
- プローブを浸透させるための細胞の固定および透過処理。
- 熱変性およびプローブの一夜越しのハイブリダイゼーション。
- 蛍光顕微鏡を用いた可視化による核内位置の評価。
主要な結果
- 本プロトコルにより、単一細胞内の特定のゲノム領域を効果的にハイライトすることが可能になります。
- 本手法の堅牢性と汎用性が、さまざまな細胞型において実証されています。
- 直接標識されたプローブによる強いシグナルが、検出能を向上させています。
- 核構造および遺伝子相互作用に関する重要な知見が提供されます。
結論
- このDNA FISHプロトコルは、核構造を研究する研究者にとって有用なツールです。
- ゲノムの空間的組織化を調べるための信頼性の高いアプローチを提供します。
- 今後の応用により、さまざまな生物学的研究分野への展開が期待されます。
よくある質問
産業上の重要性
堅牢な3D DNA FISHにより、単一細胞におけるゲノム遺伝子座の精密な空間マッピングが可能となり、染色体構造の直接可視化によるターゲットバリデーションを支援します。この手法は、疾患メカニズムに関連する機能的な遺伝子相互作用や核組織化パターンを明らかにすることで、初期探索における予測の信頼性を高めます。さまざまな細胞型への汎用性とハイスループットイメージングへの適合性により、前臨床研究における治療仮説のリスク低減のためのスケーラブルなツールとして位置付けられています。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：目的遺伝子間の空間的関係を可視化することにより、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値：再現性のある核内位置データを提供し、パスウェイの関与や機能的ターゲットへのエンゲージメントを明確にする。
- 予測的価値：遺伝子調節と相関する疾患関連の空間構成を持つ遺伝子座を特定し、ポートフォリオの優先順位付け（トリアージ）を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： ゲノム構成を客観的に評価するために、定量的に測定可能な対立遺伝子間および遺伝子座間の距離を算出します。
- 運用的価値： 直接標識されたプローブから堅牢で明るいシグナルを得ることで、信頼性の高い自動イメージングを可能にし、バックグラウンドノイズを低減します。
- 拡張性の価値： ハイスループットのワークフローに対応しており、多様な細胞モデルにわたる複数のゲノム領域のスクリーニングが可能です。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナル価値：疾患関連システムにおいて天然の核構造を維持することで、発見から前臨床検証までの連続性を保持します。
- メカニズムのリスク低減：病原性メカニズムを示す可能性のあるゲノム領域の空間的変化を明らかにし、標的選択に情報を与えます。
- 予測の信頼性：候補治療薬が異常な核組織を正常化するかどうかの評価を可能にし、go/no-go判定をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲット同定後の初期探索ワークフローに組み込むことで、リード最適化および前臨床有効性試験に先立ち、空間ゲノムデータを提供します。
- 探索生物学：遺伝子座が核内で共局在するかを明らかにすることで、潜在的な調節相互作用を示し、仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：定量的な距離指標を用いた、アッセイに適した標準化された核イメージングを可能にし、化合物や遺伝的摂動の比較を容易にします。
- 分析：核半径の割合としての対立遺伝子間距離など、測定可能な出力を生成し、条件間の統計的比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：初代細胞や幹細胞モデルにおいて核の完全性を維持することで、前臨床研究へと繋げ、バイオマーカーに準拠した空間的評価をサポートします。
- エンタープライズ再利用：複数のプロジェクトや治療領域にわたる核構造研究において、再利用可能なイメージング機能を確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：単一細胞におけるゲノムの空間的関係の直接的な視覚的根拠を提供することで、メカニズム的な曖昧さを軽減します。
- 運用的価値：プローブの標識、変性、およびハイブリダイゼーションの各ステップを標準化し、ばらつきを最小限に抑えることで再現性を確保します。
- 戦略的価値：核組織の表現型をターゲットの妥当性に結びつけることで、意思決定（go/no-go判断）を改善し、開発後期における生物学的な脱落を減少させます。
- ポートフォリオへの影響：関連する疾患モデルからの空間ゲノム組織化データに基づき、リスク調整後のターゲット優先順位付けを可能にします。
実施上の留意点
- 正確な信号検出には、分子プローブ設計、ニックトランスレーション、および蛍光顕微鏡観察に関する専門知識が必要です。
- ハイスループットな適用には、ハイブリダイゼーションオーブン、蛍光顕微鏡、および自動イメージングシステムへのアクセスが不可欠です。
- 一貫したデータ解釈を行うためには、プローブの品質管理および核セグメンテーションアルゴリズムに関するチーム間での標準化が必要です。
- モデルシステム間で適用する場合、細胞種や核密度に基づいて、透過処理および変性条件の最適化が必要になる場合があります。
- 実際上の制限として、強い信号を得るためのプローブサイズの制約や、凍結融解サイクル中に核の形態を維持するための慎重な取り扱いが挙げられます。
