の遺伝的操作

本手順の全体的な目的は、Toxoplasma gondiiのタイプ1およびタイプ2のdelta 2 80株を用いて、効率的かつ信頼性の高い遺伝子置換を行うことです。これはまず、異なる5'および3'の遺伝子ターゲティングDNAフランク間に、HX GPRT選択マーカーを順方向で融合させたターゲティングDNA分子を構築することで達成されます。手順の第2ステップでは、このターゲティングDNA分子をタイプ1またはタイプ2のToxoplasma gondii株にトランスフェクションします。

第3段階は、二重交叉相同組換えイベントを忍耐強く選択し、個々のクローンを単離することです。最終段階は、単離した変異クローンにおいて遺伝子ターゲティングイベントが発生していることを検証することです。最終的に、この手順の結果により、標的遺伝子のノックアウト、遺伝子置換、およびタグ付け遺伝子の解析をさまざまなダウンストリームアプリケーションを通じて行うことで、寄生虫遺伝子の機能を明らかにすることができます。

この手法の、本寄生虫の野生型株を用いた既存の手法に対する主な利点は、タイプ1およびタイプ2のdelta 2 80寄生虫バックグラウンドにより、標的とする二重クロスオーバー相同組み換えイベントを極めて確実に選択でき、遺伝学的に精密に定義された株を作製できる点にあります。この手法は、オンラインのtoxodb.orgにある優れたゲノムリソースと組み合わせることで、抗トキソプラズマ薬療法の新たな標的の発見や、安全で効果的な弱毒生ワクチンの開発を大幅に加速させるでしょう。一般的に、この方法に不慣れな方は、標的DNA分子の設計やToxoplasma gondiiを用いた遺伝子操作に苦慮する可能性があります。

しかしながら、習熟した技術と信頼性の高いターゲティング分子の設計が成功の鍵となります。まず、ゲノムDNAから目的遺伝子の5'側および3'側のゲノムターゲティングフランキング領域をPCRで増幅させます。次に、HX GPRT cDNAミニジーンカセットから、5'側および3'側のDHFRフランキング領域を含むHX GPRT選択マーカーをPCRで増幅させます。

酵母組換えまたは同様の手法を用いて、3D NA分子をプラスミドPRS 416に5'から3'方向の正しい向きで融合させ、目的遺伝子の欠損を標的とするプラスミドp delta GOIを構築します。次に、コンフルエントなHFF細胞を25 cmフラスコで播種し、68〜72時間後に、15〜30 µgの線状化標的プラスミドを含む100 µLのサンプルを調製し、T giaへ導入します。HFF細胞の90〜95%が溶解していることを視覚的に確認し、寄生虫が十分に溶解していることを検証してください。遺伝子ターゲティングには生存した寄生虫が不可欠です。

密閉したフラスコを激しく振って、生存している寄生虫を懸濁させます。この際、液が蓋の内側やフラスコのネックに飛び散らないように注意してください。フラスコから寄生虫を回収し、テキストプロトコルに従ってトランスフェクションの準備を行います。ターゲットプラスミドをdelta CO 80トキソプラズマ株にエレクトロポレーションします。

エレクトロポレーション後の混合液を、コンフルエントなHFF細胞と30 mLの感染培地を含む150 cmフラスコに移します。感染させた培養物を37 °Cで一晩、 transfection後約20時間インキュベートします。培地をMPAおよびX選択培地に交換します。

次に、寄生虫を37 °Cで約8日間、静置してインキュベートします。プラークが確認できたら、フラスコを振って単層から細胞外寄生虫を剥離させ、寄生虫懸濁液を作成します。この寄生虫懸濁液を約0.5 mL取り、5 mLのMPAおよびX選択培地を含む、HFF細胞がコンフルエントに達した新しい25 cmフラスコに移します。

約3日後、この培養物をPAs one Aと指定します。元のフラスコから0.5 mLの寄生虫溶液を、同一の選択培地を用いた別のHFF細胞フラスコへ移す操作を繰り返します。その後5日間にわたり、この培養物をPAs one Bと指定します。

pfuを確認するため、パス1 Aおよびパス1 Bをモニターします。感染圏（zone of infection）が25箇所以上という十分な数である方のパス1 Aまたはパス1 Bをサブクローニングに選択します。寄生虫がHFF細胞を溶解させた場合は、その培養物を、コンフルエントなHFF細胞が入った新しい25 cmフラスコに選択培地を用いて継代します。トランスフェクションの3週間後に、寄生虫をMPA plus X培地で適切な濃度に希釈し、コンフルエントなHFF細胞を含む96ウェルトレイに寄生虫溶液を均等に分注することで、新鮮に分離した寄生虫をサブクローニングします。

1ウェルあたり1個の寄生虫の濃度で1枚のトレイを準備し、1ウェルあたり2個の寄生虫の濃度で2枚目のトレイを準備します。元の導入日以降、両方のトレイを37 °Cでインキュベートします。タイプ1の寄生虫は20日目まで、タイプ2の寄生虫は25日目まで、寄生虫のサブクローニングは行わないでください。

ノックアウト株の検証が完了するまで、オンラインテキストに記載されている通り、25センチメートルのフラスコで毎週継代を行います。約1週間後、96ウェルプレートを40〜60倍の倍率で観察します。単一の感染領域として同定された単一のPFUを含むウェルのみを、50 µLに設定したピペットを用いて選択します。

ウェル内の流体をPFU（プラーク形成単位）上で流し、寄生虫をウェル全体に分散させて混合します。選択したウェルを混合してから4〜5日後、細胞が溶解しているクローンを12個選びます。96ウェルプレートから24ウェルプレートの12個のウェルへ、12個のクローンを移します。この操作は、ピペットチップでウェルの底を軽く掻き、6 µLを吸引することで行います。

溶液を、1 mLのMPAにX選択剤を加えた培地中でHFF細胞がコンフルエントに増殖している24ウェルプレートのウェルに分注します。24ウェルプレートを37 °Cでインキュベートし、HFF細胞の溶解をモニターします。24ウェルプレート内で溶解が認められたウェルから、週1回のスケジュールで寄生虫を継代します。

スクラッチ・アンド・ドロー法を用いて、寄生虫溶液 2 µL を MPA および X 選択剤を含む新しいプレートに継代します。継代後、元の 24 ウェルプレートから寄生虫を回収し、DNA抽出用の小型チューブに移します。

最後に、PCRを用いて目的遺伝子の欠失を確認し、5'側および3'側のターゲットフランクの組み込みを検証します。また、HX GPRT選択マーカーの有無を確認します。このプロトコルは、操作後のdelta Q 80株からHX GPRTマーカーを除去するためのものであり、詳細はオンラインテキストに記載されています。

P delta GOYCは、6種類のTX培地を用いたネガティブセレクションにより、寄生虫からHX GPRTを除去することを目的としています。その後、PCRを用いてHX GPRTの消失を確認します。HX GPRTが遺伝子座から除去されなかった場合は1.2 Kilobase pairのバンドが示され、除去された場合は3.4 kilobase pairのバンドが表示されます。

本プロトコルの最終部分であるタンパク質のC末端タグ付けについても、オンラインテキストで詳細に解説しています。標的遺伝子欠損を作成するための概要プロトコルに従った後、一般的に標的化が困難な部位であるtype one R 18のノックアウトによる欠損を確認するためにPCRを用いました。PCR 1では、R 18遺伝子のPCR産物がないことが示されています。

PCR 2は、3' R 18ゲノムターゲティングフランキング領域の存在を示しています。PCR 3およびPCR 4は、選択マーカーが5'および3'ゲノムターゲティングフランキング領域の間に適切に組み込まれていることを示しており、これによりR 18欠損が定義されます。ある菌株において後続の欠損作成に選択マーカーを再利用するためには、まずその遺伝子座から元のHX GPRTを除去する必要があります。概説したプロトコルに従った後、

株 delta two 80 delta GRA two において、HX GPRTをGRA twoの欠損させた2つの遺伝子座から除去した。HX GPRTの消失を確認するためにG-P-R-T-P-C-Rを用いたところ、1.2 KILOBASEのバンドが示された。H-X-G-P-R-Tが除去されていない場合は、最初の遺伝子ターゲティングステップ後に3.4 kilobaseのバンドが出現した。さらに、同一のタイプ1またはタイプ2株において複数のノックアウトを構築したり、変異株にタグを付加したり相補させたりする追加の遺伝子ターゲティング手法を適用することで、「このタンパク質は細胞内のどこに局在しているか」といったさらなる疑問を解決することができる。

あるいは、このタンパク質やパスウェイの生物学的機能を説明する鍵となるドメインや活性は何でしょうか。この手法は、モデルとなるAP複合体および寄生虫toxoplasmaにおける寄生虫遺伝子機能の探索を加速させることで、この分野の研究者に道を開くものです。Gandhi eye。

トキソプラズマを取り扱う際は危険が伴うため、手順全体を通してBSL 2のすべてのガイドラインに従うなどの予防策を講じることを忘れないでください。