Name: マウス肺の病理生理学を研究するための非侵襲的気管内挿管 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-08T22:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 15 s
Description: 学ぶマウスの非侵襲的気管内挿管法を用いた肺病理生理学研究。BioLite照明システムで気管を確認し、カテーテルで治療薬を直接投与する手法です。緑色染料による可視化で肺内分布を確認でき、肺疾患モデルの構築に有用です。

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この作品は、国立癌研究所、癌研究センターの学内研究プログラムによってサポートされていました。

次のプロトコルは、マウスの肺に興味のある材料を提供する、非侵襲的、シンプルかつ迅速な方法について説明します。この手順は、国立がん研究所動物実験委員会によって承認された。 1。麻酔<ol><li>まず、ケタミンおよびキシラジン（それぞれ100 mg / kg体重〜10 mg / kg体重）の混合物を使用して、マウスを麻酔。これはACUCお勧め麻酔および用量である。この量で、マウスは、少なくとも約20分間意識不明である。 </li><li>麻酔中、目の乾燥を防ぐために、マウスの目に獣医軟膏を適用します。 </li><li>数分後、意識を確認するために、マウスの足を挟ま。一度意識不明が確認され、約60°の角度をなす挿管スタンドにマウスを置き、スタンドの上部にある小さなゴムバンドの上の上顎をフックして所定の位置に保持する。 </li></ol> 2。気管内挿管</p&gt; <ol><li>静かに、Q-ティップを使用して一方の側にマウスの舌を引っ込める。 </li><li> BioLITE挿管照明システムを使用する際に喉頭を光ファイバーライトガイドを用いて可視化されるまで、慎重に挿管システムを挿入します。 </li><li>喉頭蓋や披裂軟骨が可視化されるとカテーテルの適切な長さが挿入されるまで、喉頭蓋の上および披裂軟骨間のファイバを挿入し、前進。 </li></ol>注：挿入するカテーテルの適切な長さを得るためには、最初に事前に同様のサイズの実践マウス（ 図1）を用いて口や気管支の分岐点との間の長さを測定する。長さは、主にマウスのサイズによって異なります。カテーテルの挿入は、分岐点（体重〜25グラムとマウス用の約1.5 CM）の上に停止する必要があります。これは挿管された物質は、すべての葉に行くことが保証されます。少なくとも50の練習MICeは（熟練が挿管の成功率は95％以上であることを意味する）技術で習熟する挿管を行う人に必要とされ得る。 <ol start="4"><li>カテーテルが挿入されると、すぐに動物が普通に呼吸できるようにするために、カテーテルから光ファイバーライトガイドを取り外します。挿管照明システムを使用しない場合、直接に記載されるようにカテーテルを挿入する。 </li><li>カテーテルへの関心のある物質を含有する溶液を加える。溶液を添加直後の肺に吸入されていることを確認してください。 〜25gのマウス体重のための50マイクロリットルを、日常的に使用される。 </li></ol> 3。動物の回復<ol><li>とすぐに溶液が肺に吸い込まれるように、スタンドからマウスをダウンさせると、元のケージに戻します。 </li><li>それが動き始めるまで、マウスを観察します。 </li><li>一度マウスが良好な状態であることが確認でき、ラックにケージを戻す。 </li></ol>

<ol><li>Das, S., Macdonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+mouse+lung+intubation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple method of mouse lung intubation.</a> J. Vis. Exp. (73), e50318(2013).</li>
<li>Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+murine+intranasal+dosing+efficiency+using+luminescent+Francisella+tularensis%3A+effect+of+instillation+volume+and+form+of+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia.</a> PLoS One. 7, e31359(2012).</li>
<li>Rayamajhi, M., Redente, E. F., Condon, T. V., Gonzalez-Juarrero, M., Riches, D. W., Lenz, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-surgical+intratracheal+instillation+of+mice+with+analysis+of+lungs+and+lung+draining+lymph+nodes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (51), e2702(2011).</li>
<li>Riesenfeld, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhaled+salmeterol+and%2For+fluticasone+alters+structure%2Ffunction+in+a+murine+model+of+allergic+airways+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Res%22%5BJournal%5D)">Inhaled salmeterol and/or fluticasone alters structure/function in a murine model of allergic airways disease.</a> Respir. Res. 11, 22(2010).</li>
<li>Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+endotracheal+intubation+of+mice+and+rats+used+in+imaging+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Contemp.+Top.+Lab+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies.</a> Contemp. Top. Lab Anim. Sci. 44, 52-55 (2005).</li>
<li>Bonniaud, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+transforming+growth+factor+beta1-induced+lung+fibrosis+is+blocked+by+an+orally+active+ALK5+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Res.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Progressive transforming growth factor beta1-induced lung fibrosis is blocked by an orally active ALK5 kinase inhibitor.</a> Am. J. Res. Crit. Care Med. 171, 889-898 (2005).</li>
<li>Bivas-Benita, M., Zwier, R., Junginger, H. E., Borchard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+pulmonary+aerosol+delivery+in+mice+by+the+endotracheal+route%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharm.+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Non-invasive pulmonary aerosol delivery in mice by the endotracheal route.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 61, 214-218 (2005).</li>
<li>Haegens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloperoxidase+deficiency+attenuates+lipopolysaccharide-induced+acute+lung+inflammation+and+subsequent+cytokine+and+chemokine+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Myeloperoxidase deficiency attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung inflammation and subsequent cytokine and chemokine production.</a> J. Immunol. 182, 7990-7996 (2009).</li>
<li>Jackson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+pregnant+mice+to+carbon+black+by+intratracheal+instillation%3A+toxicogenomic+effects+in+dams+and+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Exposure of pregnant mice to carbon black by intratracheal instillation: toxicogenomic effects in dams and offspring.</a> Mutat. Res. 745, 73-83 (2012).</li>
<li>Bodewes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+Influenza+A%2FH5N1+virus+infection+in+ferrets+differs+between+intranasal+and+intratracheal+routes+of+inoculation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of Influenza A/H5N1 virus infection in ferrets differs between intranasal and intratracheal routes of inoculation.</a> Am. J. Pathol. 179, 30-36 (2011).</li>
<li>Winslow, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+lung+adenocarcinoma+progression+by+Nkx2-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Suppression of lung adenocarcinoma progression by Nkx2-1.</a> Nature. 473, 101-104 (2011).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

ここで説明する気管内挿管は、均等に、マウスの肺に興味のある材料を提供する、シンプルでありながら優れた非侵襲的な方法です。この方法は、効果および/または生理学および/または肺の病理に投与物質の役割の研究を可能にする。投与物質は、このような生体異物化学/医薬品、発がん性物質、汚染物質、アレルゲン、または6月10日 、様々なヒト疾患を研究するためのモデルを表すことができ、様々な肺の状態を招くウイルスなどのサイトカイン、または外因性材料などの内因性の分子であり得る。この技術は、恒常性、生理学的、病理学、および/または肺の発癌におけるこれらの遺伝子の役割を研究するために、気道上皮細胞における目的の遺伝子の過剰発現または欠失を導入するために、組換えアデノウイルスまたはレンチウイルスと組み合わせて使用​​することができる。遺伝子の破壊は、中のフロックス遺伝子を破壊するために一過性の上皮細胞にCreリコンビナーゼを発現させることによって達成することができる上皮細胞11にterest。 カテーテルは簡単に​​誤って気管に並置され、食道に挿入することができま...

肺は、多くの破壊的な病気は、一般的に診断されている器官である。これらの中でも、肺癌は、男性および女性の両方において二番目に診断される癌、および癌死亡の最も一般的な原因である。また、肺気腫や慢性気管支炎として知られている慢性閉塞性肺疾患は、非常に深刻な病気、米国の死因の第3位である。 2011年に、それは2590万アメリカ人が18歳未満の710万子どもを含む、喘息を持っていたと推定された。喘息は、15（米国肺協会、歳未満の子供たちの間で入院の3番目の主要な原因である<a href="http://www.lung.org" target="_blank">http://www.lung.org</a> ）。これらの壊滅的な疾患やその基礎となるメカニズムの病態生理および/または病因を研究するために、正確なモデルを使用すると、肺への関心のある様々な材料の簡便かつ非侵襲的投与とともに重要です。マウスはに最高のモデルのいずれかを提供なぜならノックアウトおよびトランスジェニックマウスの増加可用性と利用可能な遺伝情報の膨大な量の肺疾患の病態生理学の基礎をなす分子メカニズムを研究。 様々な方法は、吸入、鼻腔内注入、気管内注入、および気管内挿管1-4を含むマウス肺への関心の資料を提供するために様々な設定で多くの研究者によって使用されている。それは実行するためにはかなり難しいと考えられているので、後者の方法は、日常的に使用されていない。ここに記載さ気管内挿管は、遺伝子発現パターン、病理学および/ ​​または肺5の生理学上の納入材料の効果を研究するために、マウスの肺に興味のある材料を提供する、非侵襲的、シンプルかつ迅速な方法である。この技術は、肺全体に外因性物質の送達を保証する、任意の生存手術を伴わないのでlikelうYは任意の制度上の動物のケアと使用委員会の承認を得なければ。

<table><tbody><tr><td>KetaVed</td><td>Vedco</td><td></td><td>Ketamine</td></tr><tr><td>AnaSed Injection 20 mg</td><td>LLOYD</td><td></td><td>Xylazine</td></tr><tr><td>BioLite Stand</td><td>Braintree Scientific</td><td>RIS100</td><td>マウス用</td></tr><tr><td>BioLite 挿管照明システム</td><td>Braintree Scientific</td><td>BIO MI-KIT</td><td>マウス用</td></tr><tr><td>22 G, 1 インチ i.v. カテーテル</td><td>テルモ</td><td>SR-OX2225CA</td><td>マウス用<強>以下</強> 30g&nbsp;カテーテルは、挿管照明システムを使用しない場合にのみ使用されます。</td></tr><tr><td>20G、1インチ点滴カテーテル</td>テル<td>モ</td><td>SR-OX2025CA</td>マウス<td>用over30g.&nbsp;カテーテルは、挿管照明システムを使用しない場合にのみ使用されます。</td></tr></tbody></table>

マウス肺の病理生理学を研究するための非侵襲的気管内挿管

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

ヒトにおける肺疾患の状態を模倣するモデルの使用は、特定の疾患の病態および/または病因を研究するため、および治療的介入を開発するために重要である。一緒に遺伝情報の膨大な量のノックアウトおよびトランスジェニック誘導体の増加可用性と、マウスは肺疾患の病態生理学の基礎をなす分子メカニズムを研究するための最良のモデルのいずれかを提供する。吸入、鼻腔内注入、気管内注入、および気管内挿管は、マウスの肺に興味のある資料を管理するための多くの研究者によって、最も広く使用されている技術である。研究の目的に応じて、各技術に対する長所と短所があります。ここで直接マウス肺への外因性材料を提供することができ、非侵襲的気管内挿管法が提示されている。この技術は、肺線維症を研究するためのモデルとして、マウスの肺にブレオマイシンを投与するために適用した。&lt;/ pの&gt;

最初に、緑色の染色溶液を練習するためのマウスに挿管するために使用した。肺は、色が肺（ 図2）で配布されたかを均等に検討すること挿管直後に切除した。この技術は、C57BL / 6マウスを用いたブレオマイシン誘発肺線維症を研究するために適用した。マウスを気管内に制御のようブレオマイシンまたは生理食塩水の1.2 U / kgの挿管し、3週間後に剖検したときに、マウスは組織学および増加ヒドロキシプロリン含有量（ 図3）でサポートされている、それらの肺全体にブレオマイシン誘発線維症を発症した。損傷領域は、20X対物レンズを用いて評価した肺の画像及び121点の格子グリッドを作成した。繊維質領域の上に落下する交点の数（点）の合計（121）点の割合としてカウントされ、発現させた。このようにして計数損傷領域の割合は、ブレオマイシン投与した（ 図4）の量に比例した。 キープtogether.withinページ= &quot;常に&quot;&gt;：FO」jove_content」 <img alt="図1" fo:c...

ヒトにおける肺疾患の状態を模倣するモデルの使用は、特定の疾患の病態および/または病因を研究するため、および治療的介入を開発するために重要である。ここで直接マウス肺への外因性材料を提供することができ、非侵襲的気管内挿管法が提示されている。

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

この手順の目的は、気管内挿管を用いて、実験的治療が対照肺の生理学的および病理学的影響に及ぼす効果を研究することです。まず、実験用マウスと同程度のサイズのコントロールマウスを用いて、口から肺の気管分岐点までの距離を測定します。次に、BioLite挿管照明システムを使用して気管の位置を確認します。挿入後、光ファイバーを速やかに抜き取り、カテーテルを留置します。最終ステップとして、実験的処置を含む溶液をカテーテル経由で肺に投与します。最終的に、併用した緑色色素を用いることで、目的の分子が肺全体に均一に拡散している様子を可視化できます。他の挿管法と比較した本手法の主な利点は、光ファイバー除去システムを用いることで気管の特定およびカテーテルの留置が容易になり、目的物質を肺内へ最適に導入できることです。手順のデモンストレーションは、私の研究室のポストオペラティブケア（post-OC）にて行います。処置を開始する前に、同様のサイズの練習用マウスを用いて口から気管支点までの長さを測定し、挿管時に挿入すべき適切なカテーテルの長さを決定します。その後、麻酔をかけた実験動物の両眼に動物用軟膏を塗布してください。数分後、足をつまんで鎮静を確認し、動物を挿管スタンドに固定します。スタンドを約60度の角度に設定します。動物を固定するため、上顎切歯をスタンド上部にある小さなゴムバンドに掛け、次にQチップを用いてマウスの舌を優しく横に除けます。この手順で最も困難な点は、食道とは別にあり、カテーテルを挿入すべき気管を明確に特定することです。成功させるためには、喉頭がファイバーオプティックファイバーによって十分に照らされていることを確認し、カテーテルを挿入すべき方向を意識してください。ファイバーオプティクスガイドを用いて喉頭が視認できるまで、挿管システムを慎重に挿入します。会厭と舌骨軟骨が確認できたら、ファイバーを会厭の上、かつ舌骨軟骨の間に挿入し、あらかじめ決定した長さのカテーテルが挿入されるまでシステムを進めます。カテーテルが定位置に配置されたら、動物が通常通りに呼吸できるよう、ファイバーのようなガイドを速やかに取り除き、目的の溶液をカテーテル内に投与します。適切に挿管されていれば、溶液が直ちにチューブを通って肺へと吸い込まれます。溶液が肺に吸い込まれたらすぐに、マウスをスタンドから取り外し、元のケージに戻します。マウスが動き出すまで観察してください。動物の健康状態が確認できたら、ケージをラックに戻します。初期の実験では、練習として緑色の色素溶液を用いてマウスに挿管を行いました。挿管後、直ちに肺を摘出し、色が均一に分布しているかを確認しました。肺の大部分に色素が観察されたことから、挿管が成功したことが示されました。次に、この手法を、ブレオマイシンまたは対照としての生理食塩水を気管内注入して3週間後のC 57 BL/6マウスを用い、ブレオマイシン誘発性肺線維症の研究に適用した。ブレオマイシン誘発性線維症の進行を評価するため、組織学的解析により肺を検査した。生理食塩水を投与した動物の肺では、低倍率および高倍率のいずれにおいても線維化は見られなかった。対照的に、ブレオマイシンを気管内投与したマウスでは、低倍率および高倍率の両画像で明らかなように、肺全体に線維化が認められた。生理食塩水を投与したマウスの肺と比較して、ブレオマイシン投与マウスの肺ではヒドロキシプロリン含量が高かった。このことは、ブレオマイシン投与マウスにおいて肺線維症が発現することをさらに実証している。その後、損傷部位に121点の格子状グリッドを重ね、線維化領域に重なる交点または点の数を数え、全121点に対する割合（%）として算出しました。このようにして算出された損傷領域の割合は、投与したブレオマイシンの量に比例していました。カテーテルを気管のどの深さまで挿入すべきかをあらかじめ把握しておき、溶液を添加した直後にカテーテルを通じて肺に吸引されることを必ず確認してください。

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