3次元細胞培養のための自己申告足場

本実験の全体的な目的は、細胞増殖に影響を与える条件の理解を助けるために、リアルタイムかつin situでモニタリング可能なpH応答性ナノセンサーおよび自己報告型スキャフォールドを作製することである。これは、まず、蛍光出力によってpHをモニタリングできる生体適合性のアナライト応答性ナノセンサーを調製することで達成される。第二のステップとして、pH応答性ナノセンサーをポリマーのエレクトロスパン・スキャフォールドに組み込み、細胞を培養してモニタリングすることが可能な3D環境を構築する。

次に、哺乳類細胞を電界紡糸（エレクトロスパン）スキャフォールド上に播種し、細胞内pHをモニタリングするためにナノセンサーを細胞内環境に導入します。実験の結果、共焦点顕微鏡により取得した蛍光強度比に基づき、細胞内ナノセンサーと自己報告型スキャフォールドが、組織工学環境内のpHをモニタリングできることが示されました。電子pHプローブなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、細胞の増殖を妨げることなく、in situかつリアルタイムで測定が可能であることです。

まず、丸底フラスコに1.5 mgのfam SEを1 mLのジメチルホルムアミド（DMF）に溶解し、フルオロフォアを調製します。別のフラスコにも同様に、1.5 mgのTamara SEを1 mLのDMFに溶解させます。次に、各フラスコに3-アミノプロピルトリエトキシシランを1.5 mL加え、乾燥窒素雰囲気下、21 °Cの暗所で24時間連続して撹拌します。

次に、丸底フラスコに入れた6 mLのエタノールと4 mLの水酸化アンモニウムの混合液に、2種類の染料溶液をそれぞれ250 µLずつ加えます。この新しい混合液を21 °Cで1時間撹拌します。その後、0.5 mLのテトラエチルオルトシリケートを混合液にゆっくりと加え、さらに2時間撹拌を続けます。

この間に混合液が白濁することを確認し、その後、回転蒸発法によりナノセンサーを回収し、今後の使用に備えてガラスバイアルに入れ4°Cで保存します。次に、乾燥させたpHナノセンサーを、pH 5.5からpH 7.5まで0.5刻みのSorensonリン酸緩衝液に5 mg/mLの濃度で添加します。サンプルを3分間ボルテックスしてナノセンサーを再懸濁させ、その後、溶液が白濁するまで、または5分間超音波処理を行います。

FAMには488 nanometers、Tamaraには568 nanometersの励起波長でサンプルを測定し、校正データを収集します。FAMについては500 to 530 nanometers、Tamaraについては558 to 580 nanometersの範囲で放出光を収集し、各pH値で生成された最大放出強度の比を算出します。次に、ナノセンサーのサンプルをカーボンコーティングされた電子顕微鏡用スタブに配置し、アルゴン雰囲気下で粒子を5分間金スパッタコーティングして、SEM観察用のサンプルを調製します。

コーティング後、サンプルを電子顕微鏡にセットし、電子チャージングを最小限に抑えて最適な画像を得るために、ドラフトチャンバー内で作動距離、電圧、および倍率を調整します。ジクロロメタンを用いて、1%のギ酸ペリネウムを含む20% PLGA溶液を調製します。この溶液を18ゲージの鈍端充填針を装着した10 mLシリンジに充填し、シリンジポンプにしっかりと固定します。

この溶液を用いてコントロールのPLGAスキャフォールドを作製します。針先を20 by 15 cmのアルミニウム収集プレートから20 cm離し、高電圧電源の電極をシリンジの先端に取り付け、アルミニウム収集プレートに接地させます。次に、電源を入れ、電圧を12 kVに調整します。その後、シリンジポンプを起動し、3.5 mL/hの一定流量で2時間かけて溶液を供給します。

これにより、約 60 microns のスキャフォールド厚が得られます。完了後、装置の電源を切り、溶媒残渣を蒸発させるため、スキャフォールドをドラフトチャンバー内に 24 hours 放置します。pH応答性ナノセンサーを組み込んだスキャフォールドを調製する場合、前述と同様に PLGA 溶液を調製しますが、今回はナノセンサーを 5 mg/mL 添加してください。

次に、前述と同じ設定でpH応答性材料をエレクトロスピンします。続いて、ナノセンサーを組み込んだ乾燥済みスキャホールドの小型サンプルを35 mm培養プレートに入れ、共焦点顕微鏡下でpH 5.5から7.5まで0.5刻みのSorensenリン酸緩衝液2 mLに浸し、スキャホールドのpH応答性を校正します。ナノセンサー内のFAMの励起には488 nmアルゴンレーザーを、Tamaraの励起には568 nmクリプトンレーザーを使用してください。

FAMについては500から530ナノメートル、Tamaraについては558から580ナノメートルの放出を観察し、次に各pH値で生成された最大放出強度の比率を算出します。まず、スキャフォールドの表面を、8センチメートルの距離からUV光源を用いて各面15分間滅菌します。その後、スキャフォールドを12ウェル培養プレートに無菌的に移し、内径1センチメートル、外径2センチメートルのスチールリングをスキャフォールドの上に配置します。

次に、5% pen stripを含むPBSをスチールリングの内側と外側に加え、サンプルを一晩インキュベートします。翌日、5% pen strepを含むPBSを除去し、スキャフォールドをPBSで洗浄します。

次に、スチールリングの内側と外側に細胞培養液を500 µLずつ加え、プレートをインキュベーターで予熱します。続いて、目的の細胞を回収し、1 × 10⁶ cells/mLの細胞懸濁液を調製します。細胞の準備が整ったら、ウェルから培地を取り除き、スチールリングの外側に新鮮な培地を1 mL加えます。

次に、細胞懸濁液 300 µL をスチールリングの内側に加え、プレートを緩やかに揺らして細胞を均一に分散させます。プレートを 5% CO2 濃度の 37 °C インキュベーターに入れ、必要な時間細胞をインキュベートします。2〜3日ごとに培地を交換し、前節で説明した方法で細胞をスキャホールドに播種し、72 時間中断することなく増殖させます。

次に、細胞をPBSで洗浄し、リングの外側に500 µLの無血清培地を、リングの内側に300 µLを添加します。プレートを37 °Cで1時間インキュベートします。ナノセンサー5 mgを50 µLのoptimumに添加し、短時間撹拌して溶液Aを調製します。

次に、45 µLのOptumに5 µLのlipectomy 2000を加え、溶液Bを調製し、室温で5分間インキュベートします。続いて、溶液Bの混合液に溶液Aを加え、室温で20分間インキュベートして、ナノセンサーリポソーム複合体である溶液Cを形成させます。プレートをインキュベーターから取り出し、複合体溶液100 µLをスチールリングの内側に加えます。

その後、プレートをインキュベーターに戻し、リペクトミー試薬複合物とともに細胞を3時間インキュベートします。培地を吸引し、温めたPBSで細胞を2回洗浄した後、細胞が定着したスキャフォールドを異なるpHの緩衝液に浸し、ナノセンサーの応答をモニタリングします。次に、蛍光共焦点顕微鏡を用いて細胞をイメージングし、哺乳類細胞内におけるナノセンサーの位置を追跡します。

まず、PLGAスキャフォールド上に播種した細胞に、ナノセンサーを含むfamのみを調製して添加します。次に、300 µLの培地に50 nMのlyo tracker redを2 µL加え、インキュベーション期間後、37 °Cで1時間インキュベートします。培地を除去し、PBSで細胞を2回洗浄します。

次に、共焦点イメージング中に細胞を覆うため、2 µLのPBSまたはその他のフェノールレッドフリー培地を加えます。続いて、5 µMの核染色剤であるDRAQ5をPBSに加え、37 °Cで3分間細胞とともにインキュベートします。3分後、プレートをインキュベーターから取り出し、共焦点ステージに設置してイメージングを行います。付随するテキストプロトコルに記載されている通り、励起波長の混入を避けるためにシーケンシャルスキャンを用い、さまざまな励起・蛍光波長を使用してナノセンサー、酸性オルガネラ、および核を撮影します。作製したpH応答性ナノセンサーの粒度分布はSEMを用いて評価し、撮影したナノセンサー集団を測定した結果、240 nmから470 nmの範囲のナノメートル次元であることが確認されました。

左側は電界紡糸したPLGA繊維の画像であり、右側はナノセンサーを伴う電界紡糸PLGA繊維である。繊維のSEM顕微鏡写真から、ナノセンサーが繊維表面に結合していることが確認できる。ただし、ナノセンサーはスキャホールド繊維の内部に組み込まれている可能性もある。

電界紡糸後も、ナノセンサーは光学的な活性および化学的な活性を維持しており、ここではスキャフォールド繊維に結合した状態で示されています。左側は緑色で示されたFAM色素であり、右側は赤色で示されたTAMRA色素です。蛍光強度の比から、ここに示すような検量線が作成されます。

単独で評価したナノセンサーと、電界紡糸PLGAスキャフォールドに組み込んだナノセンサーの結果は互いに一致しており、ナノセンサーがスキャフォールドへの組み込み後も光学活性を保持していることが示されました。また、組み込まれたナノセンサーは、緩衝液をpH 5.5と7.5の間で交互に変化させた際、pH値の変化に対して良好に可逆的に応答しました。fam/Tamra比は、示した回数すべてにおいて予測通りに反応しました。

以下は、トランスフェクション試薬を用いてナノセンサーを細胞内に導入した線維芽細胞の共焦点画像です。fam染料とTamara染料が点状に共局在していることは、これらの染料がナノセンサーマトリックス内に捕捉されたままであることを示唆しています。ナノセンサーの細胞内導入は、さまざまなバッファーに置いた細胞のfam/Tamara比を測定することで確認できます。

ここでわかるように、スキャフォールドベースのナノセンサーを測定すると比率は上昇しますが、細胞内のセンサーを測定すると比率は安定したままになります。この手法の開発により、組織工学分野の研究者は、進行中の実験を妨げることなく、3D細胞構築物内における微小環境の細胞内pH変化を、in situかつリアルタイムで調査できるようになります。