3次元細胞培養のための自己申告足場
November 7th, 2013
生体適合性のpH応答性ゾル - ゲルナノセンサーは、ポリ（乳酸 - コ - グリコール酸）（PLGA）エレクトロスパン足場に組み込むことができる。産自己申告足場は、足場上に細胞を培養しながら微小環境条件の現場モニタリングのために使用することができる。 3D構築物が細胞の実験を妨害することなく、リアルタイムでモニターすることができるので、これは有益である。
次の実験の全体的な目標は、細胞増殖に影響を与える条件の理解を支援するために、リアルタイムかつその場で監視できるpH応答性ナノセンサーと自己報告型足場を作成することです。これは、まず、蛍光出力を通じてpHをモニターできる生体適合性分析種応答性ナノセンサーを調製することで達成されます。第2のステップとして、pH応答性ナノセンサーを高分子電気紡糸足場に組み込んで、細胞を培養および監視できる3D環境を形成します。
次に、哺乳類細胞はエレクトロスピンスキャフォールドに座り、ナノセンサーも細胞内環境に送達されて細胞内pHをモニターします。実験中に、共焦点顕微鏡によって取得された蛍光比に基づいて、細胞内ナノセンサーと自己報告スキャフォールドが組織工学環境内のpHをモニターする能力を示す結果が得られます。電子pHプローブの使用など、既存の方法と比較した場合のこの手法の主な利点は、細胞の成長を妨げることなく、その場でリアルタイムで測定できることです。
まず、1.5ミリグラムのfam SEを丸底のDMFとして知られるジメチルホルムアミド1ミリリットルに溶解することにより、蛍光色素を調製します。また、フラスコは1.5ミリグラムのタマラSEを2つ目のフラスコで1ミリリットルのDMFに溶かします。次に、各フラスコに1.5ミリリットルの3つのアミノプロピルトリエチルを加え、摂氏21度の乾燥窒素雰囲気下で暗闇で24時間連続的に攪拌します。
次に、丸底フラスコに含まれる6ミリリットルのエタノールと4ミリリットルの水酸化アンモニウムを含む混合物に、両方の染料溶液の250マイクロリットルを追加します。この新しい混合物を1時間後に摂氏21度で攪拌します。0.5ミリリットルのテトラエチルオルトスケイ酸塩を混合物にゆっくりと加え、さらに2時間攪拌し続けます。
この間、混合物が濁ることを覚悟し、その後、ナノセンサーを回転蒸発によって収集し、将来の使用のために摂氏4度のガラスバイアルに保管します。次に、乾燥させたpHナノセンサーを、pH 5.5からpH 7.5の範囲のソレンソンリン酸緩衝液に、1ミリリットルあたり5ミリグラムで加えます。サンプルを3分間ボルテックスしてナノセンサーを再懸濁し、次に5分間または溶液が濁るまで超音波処理します。
FAMの場合は488ナノメートル、568ナノメートルの励起波長でサンプルを測定し、キャリブレーションデータを収集します。Tamara の場合、FAM の場合は 500 から 530 ナノメートル、Tamara の場合は 558 から 580 ナノメートルで排出量を収集し、各 pH 値で生成される最大排出量の比率を計算します。次に、ナノセンサーのサンプルをカーボンコーティングされた電子顕微鏡に置き、アルゴン雰囲気下で粒子を金でスタブおよびスパッタコーティングして、SEMイメージング用のサンプルを準備します。
コーティングしたら、サンプルを電子顕微鏡に入れ、作動距離、電圧、倍率を調整して、電子の帯電を最小限に抑え、ドラフト内で最高の画像を生成します。ジクロロメタンに1%ギ酸会陰を含む20%PLGA溶液を作ります。溶液を18ゲージの鈍器充填針を備えた10ミリリットルのシリンジにロードし、シリンジポンプにしっかりと取り付けます。
このソリューションは、制御PLGA足場が20 x 15センチメートルのアルミニウム収集プレートから針先を20センチメートル離すようにし、高電圧電源の電極をシリンジの先端に取り付け、ワイヤをアルミニウム収集プレートに接地するために使用されます。次に、電源をオンにし、電圧を12キロボルトに調整します。次に、シリンジポンプをオンにし、毎時3.5ミリリットルの一定流量で2時間溶液を送達します。
これにより、約60ミクロンの足場の深さが生成されます。終了したら、機器の電源を切り、足場をドラフトに24時間放置して、溶剤の残留物を蒸発させます。pH応答性ナノセンサーを組み込んだスキャフォールドを調製するには、前回と同様にPLGA溶液を調製しますが、今回はナノセンサー1ミリリットルあたり5ミリグラムも追加します。
次に、以前と同じ設定を使用してpHに応答するようにエレクトロスピンします。次に、ナノセンサーを組み込んだ乾燥した足場の小さなサンプルを35ミリメートルの培養プレートに入れ、共焦点顕微鏡でpH 5.5から7.5までの2ミリリットルのソレンセンリン酸緩衝液に0.5刻みで浸漬することにより、足場のpH応答性を較正します。488ナノメートルのアルゴンレーザーを使用してFAMを励起し、568ナノメートルのクリプトンレーザーを使用してナノセンサー内のタマラを励起します。
FAMは500〜530ナノメートル、タマラは558〜580ナノメートルでの発光を観察し、各pH値で生成される最大放出の比率を計算します。まず、足場の表面をUV光源で両側8センチメートルの距離で15分間滅菌します。次に、足場を12ウェル培養プレートに滅菌移し、内径1センチメートル、外径2センチメートルのスチールリングを足場の上に置きます。
次に、スチールリングの内側と外側に5%ペンストリップ付きのPBSを加え、サンプルを一晩インキュベートします。翌日。5%ペン連鎖球菌でPBSを取り外し、PBSで足場を洗います。
次に、スチールリングの内側と外側に500マイクロリットルの細胞培養培地を加え、インキュベーターでプレートを予温します。次に、目的の細胞を採取し、1ミリリットルあたり10〜6個の細胞の1倍の細胞懸濁液を調製する。セルの準備ができたら、培地をウェルから取り出し、スチールリングの外側に1ミリリットルの新鮮な培地を追加します。
次に、300マイクロリットルの細胞懸濁液をスチールリングの内側に加え、プレートを静かに揺さぶって細胞を均等に分散させます。プレートを5%CO2を含む摂氏37度のインキュベーターに入れ、必要なだけ細胞をインキュベートします。前のセクションで説明したように、2〜3日ごとに培地をリフレッシュして、細胞を足場に播種し、72時間中断せずに成長させます。
次に、細胞をPBSですすぎ、リングの外側に500マイクロリットルの無血清培地を、リングの内側に300マイクロリットルを追加します。インキュベーション中にプレートを摂氏37度で1時間インキュベートします。5ミリグラムのナノセンサーを50マイクロリットルの最適で短時間の淫行で追加することにより、溶液Aを準備します。
次いで、5マイクロリットルの脂肪切除術2000〜45マイクロリットルのOptumを添加して溶液Bを混合し、混合物を室温で5分間インキュベートする。次に、溶液B混合物に溶液Aを加え、室温で20分間インキュベートして、ナノセンサーリポソーム複合体である溶液Cを形成します。インキュベーターからプレートを取り外し、スチールリングの内側に100マイクロリットルの複雑な溶液を追加します。
次に、プレートをインキュベーターに戻し、インキュベーション後3時間、脂肪切除試薬複合体と細胞をインキュベートします。培地を吸引し、温めたPBSで細胞を2回洗浄してから、細胞に着座した足場を異なるpHの緩衝液に浸して、ナノセンサーの応答をモニターします。次に、細胞内で蛍光共焦点顕微鏡を使用して細胞を画像化し、哺乳類細胞内のナノセンサーの位置を追跡します。
まず、ナノセンサーを含むファムのみを調製し、PLGAスキャフォールドに座った細胞に送達します。次に、2マイクロリットルの50ナノモルlyo tracker redを300マイクロリットルの培地に加え、インキュベーション期間後に摂氏37度で1時間インキュベートします。培地を取り出し、PBSで細胞を2回洗浄します。
次に、2マイクロリットルのPBSまたは他のフェノールレッドフリー培地を添加して、共焦点イメージング中に細胞を覆います。次に、核染色液を5マイクロモル、PBSに5マイクロモルのドラックを加え、細胞と37°Cで3分間インキュベートします。3分後、インキュベーターからプレートを取り出し、イメージング画像、ナノセンサー酸性オルガネラおよび核の酸性オルガネラおよび核を、添付のテキストプロトコルに記載されているように種々の励起および発光波長を用いて、励起波長の収集を避けるためにシーケンシャルスキャンを使用しながら、調製したpH応答性ナノセンサーのサイズ分布をSEMを用いて特徴付け、イメージングされたナノセンサーの集団を測定し、240 から 470 ナノメートルの範囲のナノメートル寸法を有する。
左がエレクトロス紡績PLGAファイバー、右がナノセンサー付きエレクトロスピンPLGAファイバーです。繊維のSEM顕微鏡写真は、繊維の表面にナノセンサーの会合の証拠を提供します。しかしながら、それらはまた、足場繊維内に組み込まれてもよい。
エレクトロが回転すると、ナノセンサーは光学的および化学的に活性なままでいる能力を保持し、ここでは足場ファイバーに関連して示されています。左が緑、右が赤のタマラ染料です。蛍光強度比により、ここに示すような検量線が得られます。
ナノセンサーを単独で評価し、エレクトロスピンPLGA足場に組み込むと、互いに鏡像化され、ナノセンサーが足場に組み込まれた後も光学活性を保持することが実証されました。組み込まれたナノセンサーは、バッファーが5.5と7.5の間で交互に行われたため、pH値の変化にも可逆的に応答します。家族タムラの比率は、示されるたびに予想通り反応しました。
これは、トランスフェクション試薬を介して細胞内にナノセンサーが送達された線維芽細胞の共焦点画像です。fam色素とTamara色素の点状共局在は、色素がナノセンサーマトリックスに閉じ込められたままであったことを示唆しています。ナノセンサーの細胞内送達は、さまざまなバッファーに入れた細胞のfam Tamara比率を測定することで確認できます。
ここでわかるように、足場ベースのナノセンサーを測定すると比率が増加しますが、細胞内のセンサーを測定すると一定のままです。この技術の開発後、組織工学の分野の研究者は、その場でリアルタイムで調査することができます。進行中の実験を妨げることなく、3D細胞構築物内の微小環境細胞内pH変化
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概要
この研究は、PLGAの電気紡糸スキャフォールドに組み込まれた生体適合性pH応答性ソル-ゲルナノセンサーの開発に焦点を当てています。これらの自己報告型スキャフォールドにより、細胞培養中の微小環境条件をリアルタイムでモニタリングし、細胞成長ダイナミクスのより良い理解を促進します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 材料科学
背景
- 細胞成長条件の理解は、組織工学にとって重要です。
- pHをモニタリングするための既存の方法は、細胞環境を乱す可能性があります。
- 蛍光ナノセンサーは、リアルタイムモニタリングの非侵襲的な代替手段を提供します。
- PLGAスキャフォールドは、細胞培養に適した3D環境を提供します。
研究目的
- in situでpHレベルをモニタリングできるナノセンサーを作成すること。
- これらのナノセンサーを電気紡糸スキャフォールドに組み込み、細胞培養モニタリングを強化すること。
- 細胞成長条件を維持するこれらのスキャフォールドの有効性を評価すること。
使用された方法
- 蛍光を用いた生体適合性pH応答性ナノセンサーの調製。
- 電気紡糸によるナノセンサーのPLGAスキャフォールドへの組み込み。
- 共焦点顕微鏡を用いたpH応答性の校正。
- 細胞培養環境におけるpHのリアルタイムモニタリング。
主要な結果
- 構造を損なうことなく、ナノセンサーをスキャフォールドに成功裏に組み込んだ。
- 細胞培養中にpHレベルをリアルタイムでモニタリングする能力を実証した。
- 蛍光比率は、様々な条件下での効果的なpH応答性を示した。
- 従来の電子プローブと比較して、この方法はより非侵襲的であることが証明された。
結論
- 開発されたスキャフォールドは、細胞環境をモニタリングするための新しいツールを提供します。
- このアプローチは、細胞成長に影響を与える要因の理解を深めます。
- 将来の応用には、組織工学や再生医療での幅広い用途が含まれる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Self-reporting 3D scaffolds with integrated pH-responsive nanosensors enable real-time, in situ monitoring of microenvironmental conditions in cell culture systems. This capability enhances predictive confidence in early discovery and tissue engineering by providing quantitative, non-disruptive readouts of cellular environments. The approach supports risk-adjusted decision-making at key inflection points in preclinical model development and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cellular microenvironments to clarify mechanistic hypotheses in 3D culture systems.
- Supports biological de-risking by providing direct, quantitative pH measurements relevant to cell viability and function.
- Facilitates functional target validation by linking environmental cues to cellular responses in physiologically relevant models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated 3D biological systems for downstream compound screening and evaluation.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative pH readouts for assay development workflows.
- Enables scalable, platform-ready integration of self-reporting scaffolds for high-content screening applications.
Translational & Preclinical Research
- Aligns 3D culture conditions with disease-relevant microenvironments for improved translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by providing real-time data on cellular health and environmental stability.
- Enhances predictive de-risking by enabling non-invasive monitoring of key physiological parameters.
Pipeline & Workflow Integration
Self-reporting scaffolds with pH-responsive nanosensors fit within the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies and translational model validation.
- Discovery Biology: Provides real-time, quantitative pH monitoring to support hypothesis testing and pathway clarification in 3D systems.
- Screening: Offers reproducible, standardized outputs for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Supplies fluorescence-based ratiometric measurements for robust comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Maintains continuity between in vitro discovery and preclinical model validation by mimicking in vivo-like environments.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse cell types and experimental designs in tissue engineering and drug discovery.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in 3D cell culture studies.
- Operational Value: Standardizes environmental monitoring, enhances reproducibility, and supports scalable workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing actionable, real-time data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and preclinical programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence imaging and 3D cell culture techniques.
- Needs access to confocal microscopy and analytical infrastructure for ratiometric measurements.
- Demands cross-team standardization of scaffold preparation and calibration protocols.
- Adaptation may be necessary for different cell types or tissue models.
- Practical limitations include scaffold fabrication throughput and compatibility with specific assay formats.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:36
Preparation and Analysis of pH Responsive Sol-gel Nanosensors
4:26
Preparation and Analysis of PLGA Scaffolds
6:57
Nanosensor Location within Mammalian Cells
8:36
Nanosensor Delivery to Cells Cultured upon Regular PLGA Scaffolds
10:33
Nanosensor Location within Mammalian Cells
11:57
Results: Incorporation of Nanosensors into Scaffolds and Cells
14:20
Conclusion
