Name: 細胞内記録、感覚野のマッピング、および培養は、リーチのニューロンを同定しヒルドmedicinalis /i (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-04T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: 学ぶ細胞内記録と感覚野マッピング、培養法を用いたヒルドmedicinalisの神経研究。個々のニューロンからの電位記録と神経回路の生理学的特性評価により、神経科学の基礎原理を解明する。

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1。電極および生理食塩液の調製<ol><li>動物が解剖される前に、生理食塩水と電極を準備します。 115.3のNaCl、1.8のCaCl 2、4.0のKCl、10 mMトリス/マレイン酸またはHEPES：ヒルリンゲル液は、以下で構成されています。 pHを7.4に調整する。 </li><li>ワイヤーがスムーズに濃いグレー仕上げになるまで20分間漂白剤を少量に掃除銀線を浸漬またはによるAg-Clでワイヤーを準備します。使用する前に蒸留水でワイヤーを洗ってください。その後、アンプに差し込むマイクロピペットホルダーにワイヤーを配置。 </li><li>ピペットプラーを使用してホウケイ酸ガラスのシャープなガラス電極を準備します。電極抵抗は20MΩのオーダーである必要があります。 </li><li> 3Mの酢酸カリウム溶液でピペットを埋め戻すとマイクロピペットホルダーに内に挿入します。 </li><li>細胞外電極用で、バック先端を破る、上記のような鋭利なガラスピペットを準備鋭いエッジの近くに別の鋭いピペットをこする。それは接続詞を引き裂くしないように先端を磨く発射。プラスチック外電極は限り電極と神経の間の良好な接触があるように動作します。 </li><li>吸引用のゴムチューブと注射器が装備されて銀（Ag-Clでワイヤー付き）マイクロピペットホルダーに細胞外記録電極を挿入します。少なくとも銀線の高さまで電極に生理食塩水を描画するために注射器を使用してください。 </li><li>特定の信号記録部の取扱説明書に従うことによって、ハードウェア（アンプ、刺激アイソレータ）とソフトウェア記録パラメータを設定します。以下の実験で使用される機器の詳細を表示するLeksrisawat ら 22を参照してください。 </li></ol> 2。腹側神経節の解剖<ol><li>リーチリンゲル液で大規模なシリコーンエラストマーが並ぶ皿にリーチを解剖。動物が縦延伸された場合、それは意志腹側神経索（ 図1A参照 ）を削除する方が簡単。 </li><li> ＃10または＃11サイズのメスで、腹側正中での非常に浅い切り傷に縦切開を行います。腹側のカットの途中2/3rdについて、図1（b）に示します。動物が完全に開放され、血液洞がまっすぐに伸ばされるまでの黒ストッキング（腹側血液洞）を切断しないようにしてください。この血液洞は、腹側正中に沿って動物の長さを実行します。 VNCは、この血管の内部に含まれている。 </li><li>皮膚はニックへの血液洞（ 図2）微細な虹彩はさみを使用し、動物の完全な長さに切断された後。洞の下で細かいアイリスハサミの刃1をスリップし、少し神経組織からそれを分離するためのブレードを上げる。神経根、分節神経、または神経節の間に接続詞を回避しながら洞に、VNCの長さをカットします。 </li><li>次に、で腹側神経索の一部を除去血管が根に参加するところに遠位根を切断。腹側神経索の長さに沿って、各節ごとにこの手順を繰り返します。 </li><li>小さいペトリ皿に1または2神経節のセグメントを転送します。神経節または単一神経節は、いくつかのたるみをピンと張ったピン止めする必要があります。 </li><li>神経節神経膠シースが少しグリアシースを通って、目的の神経細胞に突き刺すとき動き回るから神経細胞体を防ぐために引き伸ばされるように接続詞や根をピン。ピンは、根、黒洞を通って、軸索の損傷（ 図3）を最小化するには、2つの結合子の中央に配置する必要があります。 </li><li>顕微鏡下準備とペトリ皿を置き、動きを防ぐために、皿の底にワックスで固定します。 </li><li>慎重に、図4（a）のように神経細胞を見て、ミラーと集光を用いた光ビームを集束（概略図4Bに示されている</st栄&gt;）。神経節の中心部にある二つの大きなレチウス細胞に注目してください。 </li><li> Rzは、T、P、およびN個のニューロンの細胞内記録を作るために、慎重に目的の細胞上には、電極の先端を配置し、静かにディンプルがグリア鞘に見られるまで、先端を下げる。 </li><li>電極先端が目的の細胞に「飛び出す」ように（非常に慎重に）電極ホルダまたはマニピュレータをタップします。 </li><li>活動電位を呼び起こすために細胞内に正の電流（1-10 NA）の短パルス（30〜40ミリ秒）を注入。 </li></ol> 3。腹側神経節の準備から培養したニューロン<ol><li>ウシ胎児血清（FCS）（ 図3）L-15を含有する清浄な皿に神経節の腹側を上にピン。細胞内記録のために上に行ったように神経節が少し伸びているように、根をピン。細かいハサミで、ニック·一端のグリアカプセルは、その後グリアカプセルを横断、カプセルの下に1はさみの刃を滑ら図5Aに示すように、 </li><li> 15分間シェーカー上皿の場所にコラゲナーゼ/ディスパーゼ100μlのアリコートを加える。公開される細胞体の周りに培養培地を移動させることで、細胞を調べる。細胞は、最小限の吸引で出てくるまで、さらに15分以上振とう機にセルを返します。 </li><li>そっと神経節から細胞を抽出するために注射器に取り付けたピペットを使用してください。それは細胞体の直径よりもわずかに大きくなるように火がピペット先端を研磨する。大人のリーチでのRzのセルの場合、直径が約50μmにする必要があります。 </li><li>これは、ピペットの内側に付着した細胞の可能性を減少させるようにフィラメントずに、直径の異なるピペットの様々な準備をします。チッピングからヒントを保護するために、下部の綿球を使用して、80％エタノール（エタノール）を含む瓶の中にピペットを保管してください。細胞を吸引する前に、媒体とピペットからエタノールを洗うことを忘れないでください。 </li><li>酵素処理した後、洗い流す2X（FCSを含む）、L-15を有する酵素を含む培地。目的の細胞を同定し、ゆっくりと注射器（ 図6A）引いて、ピペットにそれらを描画します。 （FCSを）、L-15を含む別の皿に吸引セルを放電。 </li><li>今までは、すべての手順は、非滅菌した。無菌フードで次の手順を実行します。無菌ペトリ皿の内側の異なる場所に（FCSを）無菌のL-15の3-4大滴を配置します。 </li><li>それらを洗浄するには、ドロップの周りにそれらを吹いて、前のような滴の1に細胞をピペット。培地の3または4滴シリーズでこれを繰り返します。 </li><li> （FCSを）L-15で満たされたきれいなペトリ皿に細胞を配置します。 </li><li>室温で1から24時間のために細胞をインキュベートします。その後きれいな細胞がメッキすることができる。数時間あるいは細胞を残すことによって、一晩の細胞外マトリックスは簡単に外れます。長いプロセスを生成するために、すぐに細胞をプレート。 </li><li>マイクロジをコーティングするために、無菌の基板を使用<html> SHで、それを実験を培養する前に、（一晩）完全に乾燥させます。 </li><li>皿を塗布した後、L-15培地の少量、次いで滅菌水で穏やかに皿を洗浄し。 FCSを含まないL-15のソリューションを使用することを忘れないでは、細胞がディッシュに接着させるために追加。細胞が基材に接着した後、培地を穏やかにFCSとL-15に変更することができる。細胞がプレーティング後数時間使用される場合には、FCSでL-15培地への切り替えは不要である。 </li><li>位置めっき時に互いに隣り細胞は急速なシナプス形成（ 図6B）を誘導する。ニューロンのペアでの24時間の尺度で生理活性の後。 </li><li> （第二細胞内電極を用いたペアの細胞からの細胞内電極と記録の応答を通じて1ニューロンを刺激する）は、細胞の培養されたペアでRPまたはシナプス応答を記録するために、細胞内の電気生理学的手法を使用してください。 </li></ol>タイトル &quot;&gt; 4。神経節ボディウォール準備<ol><li>上記のようなエラストマーで裏打ち皿にダウンヒル背側をピン。 </li><li>切断された神経の反対側にルーツを持つ片側に皮膚（ 図7（b）に拡大された図7Aを ）ピンまたは身体へのすべてのルーツを持つ神経節（ 図7C）上のリーチの腹側面に窓を作るそのまま壁。 </li><li>感覚細胞（T、P、N）は火が軽く、同じセグメントの肌に触れないように研磨された小さなガラス棒を使用してのいずれかで安定した細胞内記録を取得した後。から記録されたニューロンは、Nセルである場合、それ以上の圧力が皮膚に適用される必要がある。皮膚をピンセットで挟持されている場合、ほとんどの場合、Nセルにのみ応答する。 1が皮膚に損傷を与えたり、そのような方法で準備を乱すことにより、細胞内の再コーディングを置き換える可能性があるため、このような理由から、これらの細胞は最後に試行すべきである。 </li><li>一つは、あるべき十分にすぐに十分な詳細と、皮膚や神経節をスケッチすることができ、その触れた1が特定のニューロンに対する受容野を決定するために使用することができる場所のマップ。神経節の両側に可能な限り多くのTとP細胞から記録した後にN個のセルを試してみてください。 </li><li>感覚ニューロンは吻側または尾側の方法で、その後、皮膚に隣接するセグメントの根出接続詞を通過のプロセスを持っているかどうかを調べるためには、に関しての神経節の間に接続詞をカットすることができ、受容野は再検討検出の普及。受容野のロスがあった場合には、基本的に1を検討しています。 </li></ol> 5。蛍光色素を注入する<ol><li>上記のようなリーチの神経節を準備します。 </li><li>ルシファーイエロー-CH（3.0％）及び塩化リチウム（300ミリモル）の溶液を微小電極を埋める。 </li><li>説明したように神経節の腹側の感覚細胞またはRzの細胞の1を突き刺す上記の。 </li><li> 15分間電極を介して負の電流（3NA）を渡すことによって、細胞内に色素を注入する。 100ミリ秒と2 Hzまでの周波数にパルス幅を設定します。 </li><li>水銀ランプやFITC / GFPフィルターセットでエキサイティングな色素により、色素で満たされた神経細胞を可視化する。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

この一連の実験の目的は、1）指導、展示細胞内記録の基本原則を特定可能なニューロンからと2）大人のヒルを使用して、これらの特定の神経細胞のタイプから発生する可能性が電気信号の特徴的な形状を認識するようにすることでした。神経生理学的な調査·研究のためのリーチを使用して調査の豊かな歴史は、開発時だけでなく、シナプス修復および再生10の間、神経回路と遺伝子制御の問題に対処する上で進行中であります。ニューロモデュレーションは、特に生体アミン経路を介して、また、リーチで成功した研究の方向となっている。生理食塩水を介して中枢神経系へのドーパミンおよび他の薬理学的薬剤を添加することにより、ドーパミンが意思決定挙動24,25をクロールするためのモータ23と、パターンに関与する神経回路網を調節することが示されている。この実験的なアプローチは、あほですル（かつ安価）教授の研究室に変調を組み込むための方法、および生理食塩水のイオン化粧を調整するには、ネルンストゴールドマン·ホジキン·カッツの方程式を教えるための効果的な方法です。 神経節の準備と成功するためには、神経節前細胞内電極と細胞体を突くしようとすると張りつめていることが重要です。グリアパケットを押し下げた場合、その他の相馬が移動します。培養のための神経細胞を除去するための神経節をdesheathingとき神経を横断する際にこれらが削除されるように細胞体が損傷していないので、また、関心のある領域を避ける。また、酵素の過剰なインキュベーションは、ニューロンが削除されるにはあまりにも脆弱なものになることがあります。酵素の各バッチは、彼らの行動が若干異なるため、理想的なインキュベーション時間を達成するために、いくつかの試行錯誤が必要です。 培養培地を最適化するためのさらなる調査は、この方法を改善することができる。バリ例えば、インスリン、糖、または増殖因子の存在などのOU因子は、培養物の維持のために、より長い検査することができる。細胞は、Rzの細胞におけるセロトニン合成のような送信機を合成する能力を維持するかどうかを判断するには、ニュートラルレッド染色は、セロトニン作動性のプロセスをラベルに適用することができます。負傷し、組織再生にもミクログリア侵入が損傷後の核しみ日によって定量化することができる。 この準備は、再生および修復だけでなく、神経回路を調べるに提供する多くの利点がありますが、シナプスでの様々な受容体サブタイプの薬理学的および分子識別が十分に特徴付けられていない。発現配列タグライブラリが26用意されており、薬用ヒルゲノムは、現在27を組み立てているが、一部のモデルの製剤に比べてリーチの主な制限は、特定の細胞型に選択的な遺伝子についてゲノムを変更する機能です。胚Tにその制限は、28遺伝子発現を調節するDNAまたはdsRNAを注入することによって対処されてきた。遺伝子銃技術が最近リーチニューロンにおいて無脊椎動物コネキシン（innexin）タンパク質を発現するために使用されている。 ヒルドverbana（HVE-inx6）からinnexinの発現は、薬用ヒル29内の異所性ギャップ結合の形成のために十分である。薬用ヒル-またはHそれは30だったとしてバーベナは、今後数年間で電気シナプスの生理学と進化の理解を進めることでしょう。

リーチの準備が特定できる（感覚、運動、動物の中枢神経系（CNS）内でインターニューロンの機能を調査するのに便利です。リーチの神経細胞の有用な特性は、その活動電位および生物物理学的特性の形状はのために特徴的であるということである所与の細胞型（ すなわち P、N、T、Rz）はまた、ニューロン細胞があれ45日1,2ためのそれらの電気的特性を維持する適切な培地中で培養した動物から除去することができる。 電気生理学的記録を作る方法を学習するためのリーチの神経節の明確な利点は、細胞が特徴的にかつ確実に神経節にし、動物から動物に神経節とは異なる細胞種の同定を可能にするパターンで神経節内に配置されているということです。ユニークなロケーションとリーチ神経節の神経細胞の形態は、早ければ1891年3としてレチウスで注目された。目の知識電子同一性およびニューロンの機能は、神経回路を調査するため、所与の細胞型を用いた実験を行うのに有利である。による神経節内のニューロンの比較的大きな細胞体にそれらを解剖顕微鏡で可視であり、かつ細胞体を選択的にそれらの電気的特性を記録するための微小電極で突き刺され得る。 染料及び大分子は、個々の細胞およびパッチクランプによって研究チャネル特性に注入することができる。様々な神経細胞に特徴的な活動電位の様々な形状を生じるイオン電流は4-7同定されている。神経支配のパターンで調査し、CNS内の個々のニューロンの分岐から、シナプス結合は、識別されたニューロン2,8と文化の中で再現されている。リーチの神経節における研究では、Wholおよびでだけでなく、電気生理学を用いて測定することができる機能的な回路の開発への洞察を提供してきたE動物行動の研究。リーチは、CNSはまた、動物全体での文化4-6,9-12における神経修復および再生に関与するメカニズムを研究するための貴重な準備を務めている。 哺乳類の脳では、個々の識別された神経細胞の性質や接続の面での挙動を説明するための困難な作業である。原則として1は、リーチとしてはあまり複雑なシステムの研究では、高等動物で使用される基本的なメカニズムを定義するために助けることができることを願っています。水泳パターン13,14と心臓15のリズムの根底に使用されている接続がうまくリーチで特徴づけられている。電気的および化学的の両方の通信を形成するために、いくつかのリーチニューロンの能力が興味深い。他は単方向に化学が、双方向の電気7ている間、いくつかの接続が双方向である。動物内のシナプス結合を理解するだけでなく、同​​じ標準を再作成培養皿内の接続のeは、シナプス形成16〜18だけでなく、シナプス19の薬理学的プロファイリングを調査するための強力なツールです。ここで説明する細胞内記録と刺激技術は、薬理学的アッセイおよび神経動物行動学と開発研究のための基盤を提供します。 また、分節腹側神経索の神経支配、皮膚のパッチで解剖することができる。生きている皮膚のパッチと神経細胞を維持する能力、感覚受容野は、CNS内のそれぞれの腹部神経節内の感覚ニューロンの細胞体（ すなわち細胞体）からの電気信号を記録することで調べることができる。それによって、1は皮膚に力を様々な程度を適用することにより、感覚終末の感度を評価し、受容野をマップすることができます。軽いタッチ、圧力、および有害（痛みを伴う）20,21を刺激。 このリーチ神経節の皮膚の準備の利点は、1 CAN解剖学的に受容野マップを描き、電気的応答が記録されて一旦同定ニューロンへの神経突起をトレースします。以下の3つのリーチ実験は、すべての学術研究室のために、このコスト効果的な教育モジュールを作る単一の検体で複数回完了することができる。

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>182 silicone kit</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Tris/マレイン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>漂白剤&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>塩化銀線用</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>pH調整用</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td>pH調整用</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ/ディスパーゼ</td><td>Boehringer Mannheim</td><td>269-638</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン含有 Leibovitz L-15</td><td>Gibco</td><td>041-01415H</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Ready Systems Ag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>04-001</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース一水和物</td><td>Merck</td><td>8342</td><td></td></tr><tr><td>硫酸ゲンタマイシン&amp;nbsp;</td><td>任意のサプライヤー</td><td></td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>Gibco</td><td>043-0503H</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>3375</td><td>遊離酸、結晶</td></tr><tr><td>コンカナバリン A Type IV</td><td>Sigma</td><td>C 2010</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン・ヒドロブロミド</td><td>Sigma</td><td>P 7890</td><td>MW 15-30,000</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;マイクロウェルプレート、60 x 10 &amp;mu;l</td><td>Falcon</td><td>3034</td><td>平底、1袋10個入り</td></tr><tr><td>解剖器具</td><td>World Precision Instruments</td><td>アソートメント</td><td></td></tr><tr><td>細胞内電極プローブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ファラデーケージ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>昆虫ピン</td><td>Fine Science Tools, Inc</td><td>26001-60</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡 (100X)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ファイバーランプ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小型調整ミラー</td><td></td><td></td><td>光ビームを試料に向けるために使用</td></tr><tr><td>ガラス電極</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS7095B5X</td><td>200本入り、吸引電極</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>World Precision Instruments</td><td>MD4-M3-R</td><td>&amp;nbsp;ベースまたは金属ロッドに固定可能</td></tr><tr><td>高上げ試料台</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>銀線 (10/1,000 inch)</td><td>A-M Systems</td><td>782500</td><td></td></tr><tr><td>コンピューター</td><td>任意のメーカー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AC/DC差動増幅器</td><td>A-M Systems</td><td>Model 3000</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 26T</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td>27T</td><td></td></tr><tr><td>ヘッドステージ</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td></td><td>AC/DC増幅器に付属</td></tr><tr><td>LabChart7</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>電気リード線</td><td>任意のメーカー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラス製器具&amp;nbsp;</td><td>自作</td><td></td><td>神経操作用</td></tr><tr><td>ケーブルおよびコネクタ</td><td>任意のメーカー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>バルブ付きピペット&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7</td><td>500本入り</td></tr><tr><td>ビーカー</td><td>任意のメーカー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ワックスまたは造形粘土</td><td>任意のメーカーまたは小売店</td><td></td><td></td></tr><tr><td>刺激装置</td><td>Grass Instruments</td><td>SD9 または S88</td><td></td></tr><tr><td>吸引電極用プラスチックチップ</td><td>地域のホームセンター (Watt&amp;rsquo;s ブランド)</td><td>&amp;frac14; inch OD x 0.170 inch ID</td><td>小さく切断して使用する。火で加熱して引き伸ばし、先端を適切なサイズに切り戻す。</td></tr></tbody></table>

細胞内記録、感覚野のマッピング、および培養は、リーチのニューロンを同定しヒルドmedicinalis</i

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

淡水ヒル、 ヒルドmedicinalisは 、神経生理学、神経動物行動学、発生生物学の分野で科学的問題に対処するために使用されている汎用性の高いモデル生物である。この報告書の目的は、他の神経系製剤における専門知識を持つ生理学者に使用されるであろう、あるいはほとんど、またはまったく電気生理学の経験を持つ生物学の学生に一つの記事にリーチのシステムからの実験技術を統合することです。私たちは、神経節内の識別された神経回路から細胞内に記録するためのリーチを分析する方法を示します。次に、既知の機能を個々の細胞はシャーレに培養する神経節から削除する方法を示し、どのように文化の中で、これらのニューロンから記録します。その後、我々は、感覚や運動のフィールドをマッピングするために使用される神経支配皮膚のパッチを準備する方法を示しています。これらのリーチ製剤はまだ広く神経networの基本的な電気的特性をアドレス指定するために使用されるKS、行動、シナプス形成、および開発。彼らはまた、神経科学や生理学教授の研究室のための適切なトレーニングモジュールである。

リーチの神経節内の感覚ニューロンからの細胞内記録を図4（c）に示す、その個別の電圧-時間トレースによって特徴づけられる。健康なリーチ神経節細胞における休止細胞膜電位は-45〜-60 mVである。電位が小さい（より負）であれば1はガラス電極を変更する必要があり、または潜在的にはまだ低い場合には、神経索の別のセグメントに移動します。小振幅の自発的活動電位は、電極が運動ニューロンであることを示すことができる。これは神経節体壁内に発生する場合、電流注入は、ニューロンがまだ皮膚に取り付けられた筋肉のいずれかを神経支配するかどうかを決定するために使用することができる。環形エレクター運動ニューロン（AE）は神経節（ 図4B）の腹側にあり、それが輪の脊柱の筋肉を活性化することにより、上昇する円環（リッジまたはセグメント）を発生します。 感覚細胞に電流を注入すると、活動電位を呼び起こす必要があります図4Cに示す特性を有する波形sである。波形が異なって見える場合、それはアンバランスブリッジまたはオフセット容量補正が原因である可能性があります。一つは、細胞の内部でブリッジのバランスをとる方法の詳細については、信号取得部に付属のマニュアルを参照する必要があります。 図4Cに電流パルスの最初と最後に刺激アーティファクトに注目してください。これは、ブリッジがバランスしたときの成果物がどのように見えるかである。 リーチの神経節からの神経細胞の初代培養皿内の電気的および化学的シナプスを形成している。最初に培養細胞の電気的特性は、それらがインビボであるとまったく同じではない。しかし、数日後にインパルスが神経節に記録されたものとほとんど区別できます。これは、Rzは細胞の一対図6Cに示されている。培養7時間後にシナプス電位の振幅は1〜2 mVであった。培養SY 56時間後naptic電位は10 MV（ 図6Cのトップトレース）よりも大きかった。活動電位の形状も文化の中で56hr後に変更されます。記載された条件下で、これらの細胞は、数日間生存可能である。 細胞間の通信は、神経根や接続詞を刺激し、神経節の神経細胞から記録することにより証明することができる。これらの神経を刺激すると、別の神経節細胞における強固なシナプス電位と活動電位を発生させる。 図8Bにトレースは、動物から取り出して、皿に出ピン止めされていた神経節でレチウス細胞から記録した。黒いトレースが結合する細胞外電極を適用サブスレッショルド刺激によって誘発された。刺激電圧を大きくすると、細胞が活動電位（赤いトレース）を発射させる。蛍光色素または西洋ワサビペルオキシダーゼは、それらの形態を研究するために、これらの細胞に注入することができる。ルシファーイエローさRzに注入した電極を介して負の電流を流すことによりニューロン。代替的には、空気圧のパフを使用して色素を注入することである。 図9Aは、注入が始まった直後に染料を示している。 30分後、色素が既に神経根（ 図9B）中に拡散していた。色素の種類は、用途に依存するギャップジャンクションを通過することができ、例えば小さな分子量の色素が電気的シナプスを同定するために使用される。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig1.jpg" width="600px" /> 図1。腹ヒル郭清（A）は、動物が完全にリーチの生理食塩水で満たされたエラストマーで裏打ち皿に腹側を上に固定されている（B）が 、前方に広がる浅い切開：前後軸が神経の損傷を防ぐために、正中線のすぐ横作られているコー​​ド。ブラックブラッド洞（containsの腹側神経索）を容易に見ることができる。シースに比べて白い1さらさ神経節に注意してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig2.jpg" width="600px" /> 図2。黒洞の解剖。の血管（矢印）を慎重に腹神経索（二重矢印）を公開するために片側にカットする必要があります。解剖の記録の料理の間で転送するときに腹神経索を操作するためのハンドルとして使用するために、セグメントの根の周りの完全な血管のセグメントのままにしておきます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig2highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図3"FO：コンテンツ幅= SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50631/50631fig3.jpg&quot;幅 &quot;3インチ&quot; = &quot;400ピクセル&quot; /&gt; 図3。腹神経索の単離されたセクション。セグメント根上に残っている、血管断片によって腹側神経索の確保と分節接続詞の両端に電気生理学的記録のために神経を公開します。神経節の延伸ピンと張ったは1が識別可能な細胞体を見ることができ、シャープなガラス電極とグリアシースのより容易に浸透できるようになります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig3highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig4.jpg" width="600px" /> 図4。リーチの神経節の細胞の解剖学。（A）理想レチウス細胞（R）や他の大規模な細胞体（P-キーを押し顕微鏡と集光が適切に設定されている場合URE、T-タッチ、N-侵害受容、AE-弁輪エレクター）がはっきりと見えるようになります。神経節細胞（B）の模式図である。細胞体の位置のわずかな違いは、神経節が延伸され、ピンと張ったピン止めされているどのようにそれぞれの神経節に発生します。これらのニューロンの細胞体から記録された（C）活動電位が特徴的な波形を持っている。これらのスパイクは、セル（電圧-時間トレースをオーバーレイする矩形パルス）に正の電流を注入することにより誘発された。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig4highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig5.jpg" width="600px" /> 図5。個々の細胞体を除去して神経節をDesheathing。（A）グリア鞘慎重に関心の損傷細胞を避けるために、神経節を横断する必要があります。赤い線は、Rzのニューロンの細胞体をぶつからないようにカットを示している。シースを開くと、消化酵素が結合組織マトリックスにアクセスすることができます。（B）のグリアシースが開かれた後、神経節の外に膨れ健康な細胞体を。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig5highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig6.jpg" width="600px" /> 図6リーチ神経節由来のニューロンを培養する。（A）細胞を、マイクロピペットを用いて神経節から吸引し、培養培地を含む皿に転送される。（B）は 、互いに近傍に複数のセルを配置することは、識別可能なニューロン間のシナプス形成の速度を増加させる。ここSTU2つのニューロンのMPSは、シナプスを形成している。（C）ニューロン培養展示わずかに異なる電気的特性に。トップトレースは、細胞を播種した後に、隣接セル7時間と56時間を刺激することにより誘発シナプス電位を示している。下部トレースは直接Rzが細胞のいずれかに電流を注入することによって誘発した。シナプス電位振幅の増加に注意し、文化の中で56時間後に活動電位波形の変化。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig6highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig7.jpg" width="600px" /> 図7。受容野をマッピングするためのリーチ神経節体壁の準備を。（a）1つのアプローチ1-3神経節に沿って体壁のセクション全体を削除することです。ここでは1側の根はbにしているEENカットし、神経節は側へ固定されています。（B）より高倍率でのピンアウト神経節。（C）別のアプローチは、受容野をマッピングしながら、そのまま神経節から体壁やレコード内の小さなウィンドウを作成することです（DG）は、感覚ニューロンの各々は、機械的刺激に対する応答特性を示す。（D）軽いタッチではなく、PまたはN細胞におけるT細胞における活性を呼び起こす。（E）T細胞応答は、より強いに応答して遮断する刺激、P細胞の活性化への道を与える。刺激が強くなるようにN個のセルは、（FG）活性化される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig7highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig8.jpg" width="600px" /> Figur電子8。 リーチ神経節において活性を誘発。接続詞の細胞外刺激が神経索におけるシナプス伝達を駆動するために使用することができる。（A）は、これは、接続詞のいずれかに吸引電極を取り付け、小さな電圧を印加することによって行われる。シャープなガラス電極（矢印）が神経節にレチウスセルを突き刺す見ることができます。シナプス電位（黒）が続く刺激アーチファクトを示す（B）の電圧-時間トレースと活動電位（赤）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig8highres.jpg" target="_blank">拡大表示するには、ここをクリックしてください画像</a> 。 <img alt="図9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig9.jpg" width="600px" /> 図9リーチニューロンへの色素を注入する。（A）、ルシファーイエロー、現在のthroを通すことによって細胞体に注入することができる記録微小電極ぐふ。水銀ランプやFITCフィルターセットは、その後、蛍光を可視化するために使用することができます。（B）の染料のRz中に拡散しているの注射後約30分で軸索。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig9highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。

腹側神経節から神経細胞を培養し、感覚のフィールドをマッピングするために神経支配の皮膚のパッチから記録、腹側神経節の神経細胞からの細胞内記録：この記事では、ヒルを使って3神経系の準備について説明します。

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

本手順の全体的な目的は、個々のニューロンから細胞内記録を行うためのヒル神経節の調製方法、感覚受容野をマッピングするための皮膚パッチの調製方法、およびヒルニューロンの培養方法を習得することです。まず、氷を用いてヒルを麻酔し、腹側を上にした状態でピンで固定します。次に、約3つの独立した神経節を切り出し、記録のためにそれらを伸展させます。最終ステップは、個々のニューロンに電極を刺し、活動電位を記録することです。全体として、実験と併せてさまざまな細胞型の生理学的特性を明らかにすることで、神経ネットワークの挙動を特徴付けることができます。ナメクジや甲殻類などの他の単純な無脊椎動物の標本よりもヒルを用いる主な利点は、神経節に400個強のアクセスしやすいニューロンが存在し、これらのニューロンが培養状態で数日間にわたって活性を維持できることです。皮膚の準備と単一ニューロンの抽出を習得することは困難であるため、この手法を視覚的に提示することは極めて重要です。皮膚の一部に浸潤している神経節を損傷させたり、培養時にニューロンを傷つけてしまったりすることが容易に起こり得ます。ヒル（leach）の神経系に関する映像の視聴と文章の読解を行う際に、自然と湧き上がる疑問があるでしょう。それは、「ヒトの脳の方がはるかに興味深いのに、なぜあえて無脊椎動物の脳を研究するのか」ということではないでしょうか。では、なぜ無脊椎動物を研究対象とするとして、ヒルという、血を吸い、粘液を分泌する不快な動物を選ぶのでしょうか。それにはいくつかの正当な理由があります。まず第一に、ヒルは私たち人間に比べて、極めて単純な神経系を持っていることが挙げられます。そして、その中で個々の神経細胞を研究し、それらがどのように接続されているか、そしてそれらの接続がどのように動物の行動に結びつくかを確認することができます。これは、より複雑な動物では到底不可能なことです。もう一つの理由は、1960年にStephen Kofflerによって神経科学に初めて導入されたヒルが、私たちの脳の仕組みにも実際に関連する基礎的な問題の研究機会を提供してくれることです。これについては、多くの例を挙げることができます。一つは、私たちの脳にある細胞の大部分は神経細胞ではなく、いわゆるグリア細胞、すなわちサテライト細胞であるということです。これらはまずヒルで研究され、そこでの仕組みが判明した後、人間の脳でも同様であるかどうかが確認されました。結果として同様であることが分かり、それは多くの臨床的な事柄にとっても重要でした。しかし、この動物を研究対象とする最大の理由は、映像でご覧いただける通り、非常に優れた神経系を持っていることです。その神経系は、神経細胞の集団である神経節が鎖状に連なった構成になっており、その数は限られています。個々の細胞から記録を行うことが可能です。また、パリの地下鉄路線図を調べるように、細胞同士がどのように接続されているかを確認することができます。このような美しさと、ある種の基本的原理を発見できる能力が相まって、この標本調製は非常に魅力的な研究対象となっています。解剖を開始する前に。まず、録画ソフトウェアと記録電極を必ずセットアップしてください。リンガー液を満たし、シリコンエラストマーを敷いた大型のディッシュ内で、ピンを用いてヒルを解剖する準備をします。10番または11番のメスを使用し、動物を腹側が上になるように伸ばしてください。腹側正中線に沿って、ごく浅い切り込みを入れながら縦切開を行います。動物の体が完全に開き、腹側血腔が折れ曲がることなく伸展するまで、血腔を切り裂かないように注意してください。これでVNCが露出します。精細なアイリス剪刀を使用して、血腔に切り込みを入れます。剪刀の片方の刃を血腔の下に潜り込ませ、刃をわずかに持ち上げて血腔を神経組織から分離させます。次に、神経根、分節神経、または神経節間の結合組織を避けながら、VNCの長さに沿って血腔を切断します。その後、血管が神経根に接合している部位よりも遠位側で神経根を切断し、腹側神経索の一部を取り除きます。次に、神経節を生理食塩水で満たした清潔なディッシュに移し、神経根と連結部でピン留めして固定します。この標本を用いて、感覚ニューロンの細胞体から細胞内記録を行います。神経節を腹側が上になるようにして、L 15を含む清潔なディッシュ内でピン留めしてください。胎児FCSを用いて、細い鋏で根をわずかに伸ばします。一方の端にあるグリアカプセルに切り込みを入れ、鋏の片方の刃をカプセルの下に滑り込ませて、カプセルを横切るように切断します。次に、100 µLのコラゲナーゼ溶液をディッシュに加え、シェーカーで15分間振盪させます。その後、培養液を動かして露出した細胞体を観察し、細胞を確認します。細胞をシェーカーに戻し、さらに15分以上振とうします。細胞体が約50 µmの口径（細胞体径よりわずかに大きいサイズ）に火研磨されたピペットを用い、最小限の吸引で神経節から抽出できるようになるまで待ちます。細胞を細胞外マトリックス（ECM）から遊離させるため、FCS含有L 15培地を数滴加え、室温で数時間から24時間インキュベートします。準備が整ったら、基質コーティングされたマイクロウェルディッシュに細胞を隣接するように播種します。L 15培地を用いてください。FCSは使用しないでください。24時間後には電気生理学的測定が可能な状態になり、その後数日間は生存し続けます。当初、電気的特性はin vivoの標本と完全に同一ではありません。しかし、数日後には、インパルスはほぼ区別がつかなくなります。既述の方法に従い、エラストマーを敷いたディッシュにヒルを背面下にして固定します。次に、切断した神経節の反対側に根が来るように、皮膚を片側にピンで固定します。あるいは、体壁への根がすべて無傷である神経節上のヒル腹側にウィンドウを作成します。感覚細胞の1つで安定した細胞内記録が得られたら、火研磨した小さなガラス棒を用いて、同一セグメントの皮膚にあるt細胞およびp細胞に軽く触れます。皮膚に軽く触れると電気的反応が誘発されます。末端細胞（end cells）の場合、ロッドによるより強い圧力を必要とし、ほとんどの場合、ピンセットで皮膚をつまんだ時にのみ反応します。したがって、潜在的な組織損傷を最小限に抑えるため、調べたいニューロンが特定の場所に突起を持っているかを確認する際は、N細胞を最後に記録してください。神経節間の結合を切断し、受容野に消失が見られるか再検討することができます。ヒル神経節の感覚ニューロンからの細胞内記録は、その特徴的なタイムトレースによって定義されます。これらの静止電位は-45から-60 mVの間です。測定値がこれより低い場合は、新しいガラス電極を使用するか、新たに標本を調製する必要があります。振幅の小さい自発的な活動電位が観察される場合は、その細胞が運動ニューロンである可能性があります。神経節体壁標本では、電流注入を行うことで、そのニューロンがまだ付着している筋肉に支配しているかを確認できます。例えば、神経節の腹側にある環状挙筋運動ニューロンを刺激すると、環状眼が上昇します。電流注入後に不自然な波形が観察される場合、それはブリッジの不均衡またはオフセット容量補正が原因である可能性があります。ブリッジが均衡している場合、7時間後には電流パルスの開始時と終了時に刺激アーチファクトが観察されます。初代培養において、一対の網状細胞（retia cells）から測定を行いました。シナプス電位の振幅は約1〜2 mVでした。培養から56時間後には、シナプス電位は10 mVを超えました。活動電位の波形も変化しました。同一の標本において、神経根または結合組織を刺激しました。黒色のトレースは、細胞外電極を用いて結合組織に閾値下刺激を印加したことで誘発されたものです。赤色のトレースは、刺激電圧を上げることで細胞に活動電位が発生した様子を示しています。電極を通して負電流を流すことで、retia細胞にLucifer yellowを注入しました。注入直後、染料は細胞体に局在していました。30分後、染料は神経根の発達後すでに拡散していました。この手法は、神経生物学分野の研究者が活動電位の形状の背後にある基礎的なメカニズムを探索し、神経回路をさらに調査するのに役立ちます。また、特定可能なニューロンにおける再生と修復の理解を促進します。このビデオでは、一連の実験手法を紹介します。ヒルを用いた手法は、シナプス形成、ニューロモジュレーション、または神経生理学の基礎的な側面の研究に応用できます。

intracellular-recording-sensory-field-mapping-culturing-identified

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は、カナダ国立研究評議会で作製した平面パッチクランプチップは、滅菌プライミング、メディアをロードし、細胞を播種し、電気生理学的記録に使用される方法を示しています。...

NRCCパッチクランプチップ上で細胞の培養と電気生理学

このビデオは、一次マウススパイラル神経節ニューロン(SGN)培養からの自発的および刺激依存的な神経活動を多電極アレイ(MEA)で記録する方法を示しています。これには、MEAの洗浄と準備、自発的な神経活動の記録、および刺激依存性のニューロン活動を特定するための制御された電気刺激の適用が含まれます。...

多電極アレイを用いた初代マウス渦巻神経節ニューロンの神経活動の解析

我々は、無脊椎動物の嗅覚経路の最初の3つの段階で臭気誘発反応を特徴づける細胞外マルチユニット記録技術のバリエーションを示しています。これらの技術は簡単にだけでなく、他の神経系において、アンサンブル活動を調べるために適合させることができます。...

ローカスの神経活動を特徴づけるためにマルチユニット記録方法（<em&gt; Schistocercaアメリカーナ</em&gt;）嗅覚回路

我々は、海洋アメフラシの神経系の解剖を説明...

の感覚ニューロンの分離<em&gt;アメフラシカリフォルニ</em&gt;グルタミン酸作動電流のパッチクランプ記録のために

この記事では、ゴキブリ腹神経索の解剖とcercal神経と結合子から細胞外記録を記述する。誘発反応はcercal神経またはcercusの複数形の直接的な機械的刺激の電気刺激によって生成されます。...

無傷のゴキブリ神経系の神経回路の録音

求心性感覚ニューロンは、末梢から中枢神経系への感覚情報の信号伝達を行います。特定の求心性ニューロンを特定することは、それらの生理機能を理解するのに役立ちます。求心性ニューロンを同定するための逆行性標識の方法を説明し、パッチクランプ電気生理学および免疫細胞化学を使用して、これらのニューロンの電位依存性イオンチャネルを研究します。...

発現イオンチャネルの研究のための特定の感覚ニューロン集団の同定

2異なる脳neuropilesまたは2つの異なる解剖学的管から同時に細胞外の長期的な記録は、ミツバチに設立された。これらの録音は、単一のニューロンでだけでなく、行動する動物でのアンサンブルのレベルで異なる脳領域間での神経処理の時間的な側面の調査を可能にする。...

行動するミツバチの二つの神経の処理段階での同時長期レコーディング

私たちは、ニューロンの応答プロファイルを研究し、刺激パラメータを最適化するために、多電極アレイ上で一次マウススパイラル神経節ニューロン外植片を培養するためのプロトコルを提示します。このような研究は、人工内耳のニューロン電極インターフェースを改善して、患者の聴覚とデバイスのエネルギー消費に利益をもたらすことを目的としています。...

マルチ電極アレイ上のらせん神経節ニューロン外植片培養と電気生理学

アフリカツメガエル幼生の発達回路を勉強するセル全体パッチ ・ クランプ記録の 3...

準備やアフリカツメガエルの視蓋ニューロンの全体セル パッチ ・ クランプ記録のためのプロトコル

ここで提示されるNa+/K+ポンプの役割と、動的クランプを用いたリーチ心臓インターニューロンにおける持続Na+電流の調査方法を示す。...

Na+/K+ リシカルバーストへのポンプの寄与、モデリングとダイナミッククランプ解析で探索

ここでは、急性げっ歯類の脳スライスにおけるシナプス特異的な電気生理学的特性評価を可能にするために、光遺伝学的構築物を備えた個別の脳領域のウイルス形質導入を記述するプロトコルを提示します。...

エクスビボ 内側前頭前野から外側嗅内皮質への長距離シナプス伝達と可塑性の光遺伝学的調べ

学ぶ細胞内記録と感覚野マッピング、培養法を用いたヒルドmedicinalisの神経研究。個々のニューロンからの電位記録と神経回路の生理学的特性評価により、神経科学の基礎原理を解明する。

細胞内記録、感覚野のマッピング、および培養は、リーチのニューロンを同定しヒルドmedicinalis

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