新生児と大人の中枢神経系から培養ミクログリア

この手順の全体的な目標は、新生児マウスの皮質または成体マウスの脊髄から初代ミクログリア細胞を単離することです。これは、最初に出生後の0日目または2日目のマウスの子犬または成体の脊髄の脳を切除することによって達成されます。次に、新生児組織から皮質を採取するか、脊髄組織を消化します。

次に、皮質組織細胞と脊髄組織細胞を実験で使用するまで培養します。最終的に、採取された新生児および成体のミクログリア細胞は、免疫蛍光顕微鏡法で分析できます。混合皮質プレート用のミクログリア細胞を振盪するなどの既存の方法に対する当社の新生児ミクログリア培養プロトコルの主な利点は、細胞が容易に休止状態に戻り、in vivoでのミクログリア細胞の挙動をより正確に把握できることです。

成体脊髄からのミクログリアでの培養の主な利点は、解剖前に主に成体中枢神経系に影響を与える病状の文脈で細胞を引用できることです。Preco 10センチメートル組織培養皿、ポリデリシンまたはPDLのミリリットルあたり5マイクログラムをオートクレーブ水で希釈 摂氏37度で3時間後、PDLを吸引し、新生児ミクログリアの解剖を開始する直前にオートクレーブ水でプレートを一度洗浄します。UV光の下で、組織培養フード内でプレートを20分間乾燥させます。

次に、70%エタノールに浸したキムワイプを使用して、はさみで頭を取り除いた後、麻酔をかけた出生後0日目から2匹の子犬の頭を消毒します。氷冷ハンクス緩衝生理食塩水を含む10センチメートルのペトリ皿にプレートごとに4つのヘッドを置きます。湾曲した鉗子を使用して、頭を眼窩に通して固定し、次にまっすぐなマイクロ鉗子を使用して、頭蓋骨を覆っている皮膚を慎重に取り除きます。

次に、小脳の近くから始めて、皮質を穿刺したり損傷したりしないように注意しながら、頭蓋骨を切除します。小さなヘラを使用して、氷のように冷たいHBSSが入った新鮮なペトリ皿に臓器を溜めている脳を取り出します。次に、脳の腹側から始めます。

小脳をマイクロ鉗子で保持して組織を固定し、組織全体を切開せずに中脳の両側に2つの小さな切開を行います。中脳と小脳を皮質から一体でそっとからかい、形の凹面を形成するはずです。次に、孤立した皮質を分離し、内側を上にして単一の皮質を向けて、さらに解剖します。

新生児と成人の両方のプロトコルで、最も複雑なステップの1つは、髄膜の適切な除去です。また、海馬を切除することも困難です。新生児プロトコルでは、氷冷ハンクス緩衝生理食塩水を使用して組織を硬化させ、細断を最小限に抑えるためにゆっくりとした系統的な解剖手順を使用します。

皮質の尖った端に小さな結節として現れる嗅球の反対側にある三日月形の海馬を取り除きます。次に、皮質を裏返して背側を表示します。次に、嗅球を出発点として、皮質からすべての髄膜と嗅球自体を取り除きます。

次に、解剖した皮質を、氷の上に14ミリリットルの氷冷HBSSが入った15ミリリットルの円錐管に引き込みます。次に、CordisからHBSSを吸引し、P 1000ピペットチップを使用して皮質を数回三角化します。4ミリリットルのトリプシンEDTAを組織に加え、次に組織を摂氏37度でインキュベートします。

15分後、4ミリリットルの完全ミクログリア培地で酵素反応を停止し、細胞懸濁液をGの1000倍および室温で5分間スピンダウンします。4ミリリットルの完全培地resusで2回目の洗浄を行った後、細胞ペレットを10ミリリットルの完全ミクログリア培地に懸濁し、次いで40ミクロンメッシュの細胞ストレーナーで細胞懸濁液を濾過する。最後に、PD Lでコーティングされた10センチメートルの組織培養プレートの1つに、ミクログリア培地10ミリリットルあたり8皮質の密度で細胞をプレートし、細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートします。

細胞培養10日後、HBSS中の60ミリモルリドカイン400μLを組織培養プレートに添加してミクログリアを剥離し、室温で10〜15分間インキュベートします。次に、再懸濁したセルを収集します。プレートをHBSSで一度すすぎ、洗浄液を集めて残っているミクログリアを回復します。

次に、0.5モルのEDTAを細胞懸濁液に添加して最終濃度を5ミリモルにし、細胞をスピンダウンします。1%FBSを含む1ミリリットルのDMEMで口蓋を懸濁し、トライアンブルーの排除により生存細胞の数を決定します。次に、細胞を目的の実験密度で培養します。

例えば、免疫蛍光顕微鏡による分析のために、18ミリメートルあたり10倍から4番目の細胞の2.5倍の細胞を成体ミクログリア組織採取用のカバースリップで解析する。安楽死させた成体マウスの背骨を洗浄するために70%エタノールを使用することから始めます。次に、ハサミを使用して脊髄の上の皮膚を切り取り、領域T1からT12までのコードを切り取ります。

脊髄の側面から残りの筋肉を切り取り、片手の指先で脊髄を優しく保持します。マイクロハサミを使用して、コードを穿刺せずにゆっくりと椎骨を切断します。次に、一対のマイクロ鉗子を使用して脊髄をゆっくりと抽出し、氷冷HBSSが入ったシャーレに脊髄を沈めてから、顕微鏡で目に見える髄膜をすべて取り除きます。

次に、脊髄を横方向のセグメントに切断し、効率的な消化を容易にするために2ミリメートル以下の厚さにしてから、断片を氷上で冷却されたHBSSの1ミリリットルを含む15ミリリットルの円錐管に移します。脊髄組織の断片を消化するには、組織を乱さないように注意しながら、脊髄組織からHBSを吸引することから始まります。次に、組織を摂氏37度のトリプシン1ミリリットルでインキュベートします。

30分後、トリプシンを取り出し、血清を含む一次ミクログリア培地を3ミリリットル追加して酵素消化を停止します。.ピペッティングを数回上下させて組織を取り除いた後、40ミクロンの細胞ストレーナーで細胞懸濁液をろ過します。次に、細胞懸濁液のアリコートを等量のDPIと混合し、蛍光顕微鏡で細胞をカウントして、生存細胞の総数を決定します。

最後に、解離した脊髄組織細胞をPD Lコーティングプレートに適切な実験密度でプレートします。めっきの4時間後に完全な培地交換を行い、余分な細胞の破片を取り除きます。この最初の画像セットでは、ミクログリアをめっきしてから24時間後に静止および活性化したミクログリア細胞が示されており、プライミング試薬細菌のリポ多糖類への分岐または錆びた形態への曝露により、細胞が活性化されるにつれてミクログリアの形態がよりアメーバ状に変化します。

眼球は、マクロファージやミクログリア細胞表面タンパク質に特異的なマーカーを染色し、緑色で現れ、細胞の可視化を容易にします。明視野画像は細胞集団全体を示し、青色のDPIは核を強調し、培養の純度を示しています。この代表的な成体マウス脊髄から単離された細胞の画像では、10倍から5番目の生存細胞までの約7倍が得られました。

明視野顕微鏡と蛍光顕微鏡の設定を組み合わせて、DAPI陽性細胞とヘモサイトメーターグリッドを視覚化し、正確な細胞数を取得しました。ミクログリアは、約2日後にPD Lコーティング培養プレートに完全に取り付けられました。ここでの培養では、ミクログリアとマクロファージプロモーターCSF one Rの制御下でGFPを発現するMac緑色マウスの脊髄から分離されたミクログリアが明視野画像に示されています。

青矢印で示されたミクログリアと赤矢印で示されたアストロサイトは、習得すると観察できます。この手法は、この手順に続いて約1時間で完了できます。ミクログリアが他の細胞に及ぼす影響を研究するために、他の細胞タイプとのミクログリアのアカルチュレーションなどの他の方法を実行できます。

この手順に従うと、新皮質細胞と成体の脊髄細胞を培養するために必要な繊細な解剖を行い、これらの細胞を下流のアプリケーションで使用する方法について十分に理解している必要があります。