STA-PUTの速度沈降を使用して造精細胞型の分離
October 9th, 2013
STA-PUTメソッドは、大きさや密度に基づいて精子形成細胞の異なる集団の分離を可能にする。
この手順の全体的な目標は、精巣に見られるさまざまな種類の細胞を分離することです。まず、マウスから細胞の混合集団を採取します。精巣は、細胞とBSA勾配をステイプット装置にロードします。
次に、細胞がBSA勾配を通って沈降するのを待ちます。次に、フラクションを収集し、細胞組成に基づいてそれらを組み合わせます。最終的に、ステイプットによる速度沈降は、サイズと密度の違いに基づいて、さまざまな種類の細胞を精巣から分離するために使用されます。
この技術が事実のような既存の方法よりも優れている主な利点は、単純なガラス器具と重力を使用して、かなり高い純度で大量の異なる細胞タイプを分離できることです。2リットルのシリンダーとセルローディングチャンバーを上部のプラットフォームに固定し、チューブクランプ付きの2つの小さなチューブですべてを接続します。すべてのチューブを閉じた状態でクランプし、右端の2リットルシリンダーの注ぎ口を密封します。
セルローディングチャンバーに小さな攪拌子を置き、左端の2リットルシリンダーに大きな攪拌子を置きます。次に、2リットルの沈降チャンバーをプラットフォームに置きます。金属製バッフルを沈降チャンバー底部の開口部の真上に配置して、フラクション収集中の液体のボルテックスと細胞勾配の乱れを防ぎます。
次に、沈殿チャンバーに蓋をします。三方ストップコックのすりガラスジョイントにごく少量の真空グリースを塗布します。次に、ストップコックを沈殿室の底部に固定し、ストップコックと沈殿室のすりガラスジョイントを接続します。
次に、セルローディングチャンバーをストップコックの右側の出口にチューブで接続します。ストップコックを閉じてから、細胞分画チューブをストップコックの左出口に取り付け、小さなチューブを一番下に固定します。左の2リットルシリンダーに2%BSA溶液を注ぎます。
4%BSA溶液を右側の2リットルシリンダーに注ぎます。これらのシリンダーを接続するチューブに大きな気泡がないことを確認してください。クレブス緩衝液をセルローディングチャンバーに注ぎ、このチャンバーと沈降チャンバーを接続するチューブを充填します。
グラデーションを乱す可能性のある大きな気泡がないことを確認します。必要に応じて、チューブを軽く絞るかフリックして気泡を取り除きます。すべてのクレブがセルチャンバーではなくチューブ内にあることを確認します。
少量のクレブス緩衝液を沈殿チャンバーに流入させます。次に、ほぼすべてのバッファーを細胞分画チューブに排出します。チューブを充填して大きな気泡を取り除くには、フラクションコレクターを沈殿チャンバーの真下に置きます。
すべてのフラクションチューブが所定の位置にあることを確認し、汚染を防ぐためにラップで覆います。精巣を8ミリリットルのクレブスを含む別のプレートに解凍します。精細管を囲む薄い膜を1対の鉗子で切開します。
次に、別の鉗子でメンブレンを保持します。尿細管をメンブレンから押し出し、メンブレンから押し出します。尿細管を含む 4 ミリリットルのクレブスを、25 ミリリットルのコラゲナーゼ溶液を含む各円錐形チューブに移します。
尿細管がスパゲッティのような外観になるまで、摂氏33度で10分間振とうします。次に、細管がチューブの底に5分間落ち着くのを待ちます。上清を注ぎ、室温で25ミリリットルのクレブスで2回洗浄し、毎回尿細管がチューブの底に沈殿するようにします。
各チューブに約5ミリリットルのクレブスを残します。尿細管をトリプシンでインキュベートした後。広口径ピペットを使用して、尿細管を含む溶液を攪拌します。
ピペッティングで約10回イン・アウトします。溶液は、シングルセル懸濁液のように見え始めるはずです。次に、各30ミリリットルの単一細胞懸濁液を100ミクロンメッシュのセルストレーナーでろ過します。
細胞懸濁液を結合した後、細胞の総数を数えます。ストップコックが、セルチャンバーから沈降チャンバーに流れを導くように配置されていることを確認してください。両方の攪拌棒プレートを低い設定に回します。
次に、細胞懸濁液を細胞チャンバーに注ぎます。ストップコックを開くと、細胞が毎分10ミリリットルの速度で沈殿チャンバーにゆっくりと流れ込みます。次に、ストップコックを閉じて、細胞を細胞チャンバーから洗い流します。
5ミリリットルの0.5%BSA溶液を注ぎ、毎分10ミリリットルの速度で沈殿チャンバーに排出します。ストップコックを閉じて、BSAウォッシュをさらに4回繰り返します。次に、セルチャンバーと2つの2リットルシリンダーとの間のクランプを開き、毎分40ミリリットルの速度で液体を沈殿チャンバーにすぐに排出し、BSA勾配を沈殿チャンバーにロードするのに約20〜30分かかるように流量を調整します。
BSAグラディエントの上に横たわる細胞の薄い乱されていない層を監視します。BSAの大部分が装填されたら、ストップコックを閉じ、沈殿チャンバーから分画チューブに液体が排出される位置に回します。次に、攪拌板をオフにし、細胞を1時間45分間沈殿させます。
沈降が完了したら、フラクションチューブをフラクションコレクターに取り付けます。ストップコックで流量を調整し、45秒ごとに収集チューブあたり10ミリリットルが収集されるようにします。すべてのフラクションが収集されたら、さまざまな細胞集団のフラクションを顕微鏡で分析します。
細胞サイズと核の形態に基づいて異なる細胞タイプを区別し、各画分の純度を決定できます。10マイクロリットルのDPI染色細胞をスライドに移します。カバースリップをセットし、蛍光顕微鏡で分析します。
サイズと核の形態が類似している画分を引っ張って、細胞の集団を作成します。約22個の精巣の典型的な調製。このステイプット手順では、約10〜8番目のセルが得られます。
Perperメタジェニック細胞型画分は、光学顕微鏡と蛍光顕微鏡の組み合わせを使用して迅速に分析できます。筋細胞、精子細胞、および体細胞二倍体細胞は、精巣に見られる最大の細胞であり、dpiで比較的均一に染色する大きな核を含みます。丸い精子細胞は、より小さな丸い核を持つ小さな細胞であり、一般に、明るく染色された色素中心が凝縮する細長い精子細胞は、鎌状の核を持つ小さな細胞です。
細胞画分を結合すると、細胞溶解物のウェスタン血液分析により、純度をさらに決定できます。筋細胞の一般的なマーカーは、Synap Neal Complex oneタンパク質です。凝縮性精子細胞の一般的なマーカーは、遷移タンパク質またはプロタミンです。
このテクニックは、一度習得すれば、開発後に適切に実行すれば7時間で完了します。この技術は、精子形成の分野の研究者が精巣からさまざまな細胞タイプの細胞プロセスを探求する道を開きました。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概要
STA-PUT法は、サイズと密度に基づいて異なる精子形成細胞の集団を分離することができます。この技術は、精巣から特定の細胞タイプを単離してさらなる分析を行うために不可欠です。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 生殖生物学
背景
- 精子形成を理解することは生殖健康にとって重要です。
- 精巣の異なる細胞タイプには異なる役割と特徴があります。
- 分離技術はこれらの細胞タイプの研究を強化します。
- STA-PUT法は細胞分離のためにサイズと密度の違いを利用します。
研究の目的
- 様々な精子形成細胞の集団を単離すること。
- 精巣における細胞組成の理解を深めること。
- 精子形成細胞の機能に関するさらなる研究を促進すること。
使用された方法
- マウスの精巣から混合した細胞集団を収集すること。
- STA-PUT装置に細胞とBSA勾配をロードすること。
- 細胞がBSA勾配を通して沈殿するのを待つこと。
- 細胞組成に基づいてフラクションを収集し組み合わせること。
主な結果
- 異なるタイプの精子形成細胞の成功的な分離。
- STA-PUT法の有効性の実証。
- サイズと密度に基づく細胞集団の同定。
- 精子形成に関するさらなる研究のための潜在的な応用。
結論
- STA-PUT法は細胞分離のための信頼できる技術です。
- この方法は精子形成細胞の多様性の理解を深めます。
- 将来の研究は、この研究からの知見に基づいて構築することができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Efficient separation of spermatogenic cell types is critical for dissecting the molecular mechanisms underlying mammalian spermatogenesis, a process not yet recapitulated in vitro. The STA-PUT velocity sedimentation method enables high-yield, scalable enrichment of distinct testicular cell populations, supporting early discovery and mechanistic de-risking in reproductive biology pipelines. This capability is particularly valuable for R&D teams lacking access to advanced cell sorting infrastructure, facilitating robust target validation and functional studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell-type specific pathways in spermatogenesis using enriched populations.
- Supports biological de-risking by isolating functionally distinct germ cell stages for mechanistic studies.
- Facilitates predictive confidence in target validation by providing sufficient cell numbers for downstream assays.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, enriched cell fractions for quantitative and reproducible assay development.
- Supports assay standardization by enabling consistent isolation of defined cell types across experiments.
- Delivers high-yield outputs suitable for scalable compound screening and platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Provides disease-relevant cell populations for translational biomarker discovery in reproductive biology.
- Enables continuity from early discovery to preclinical validation by supplying primary cells for functional studies.
- Reduces mechanistic ambiguity in preclinical models by allowing precise cell-type attribution of observed effects.
Pipeline & Workflow Integration
The STA-PUT method integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and preclinical research, especially where in vitro differentiation systems are lacking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating specific spermatogenic stages.
- Screening: Provides reproducible, quantitative cell fractions for downstream functional assays.
- Analytics: Enables measurement of cell-type specific markers and outputs via microscopy and immunoblotting.
- Translational Research: Supplies primary cell populations for biomarker alignment and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, equipment-light solution adaptable across multiple research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in reproductive target validation.
- Operational Value: Delivers high-yield, reproducible cell fractions using accessible instrumentation.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by supporting robust early-stage data generation.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of reproductive biology programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in testis dissection, cell handling, and gradient sedimentation.
- Needs specialized but widely available glassware and cold-room or large refrigerator access.
- Demands cross-team standardization for fraction collection and purity assessment.
- Adaptable to various rodent models but may require optimization for other species.
- Fraction purity is moderate; downstream validation (e.g., microscopy, immunoblotting) is essential.
