STA-PUTの速度沈降を使用して造精細胞型の分離
2013年10月9日
STA-PUTメソッドは、大きさや密度に基づいて精子形成細胞の異なる集団の分離を可能にする。
この手順の全体的な目標は、精巣に見られるさまざまな種類の細胞を分離することです。まず、マウスから細胞の混合集団を採取します。精巣は、細胞とBSA勾配をステイプット装置にロードします。
次に、細胞がBSA勾配を通って沈降するのを待ちます。次に、フラクションを収集し、細胞組成に基づいてそれらを組み合わせます。最終的に、ステイプットによる速度沈降は、サイズと密度の違いに基づいて、さまざまな種類の細胞を精巣から分離するために使用されます。
この技術が事実のような既存の方法よりも優れている主な利点は、単純なガラス器具と重力を使用して、かなり高い純度で大量の異なる細胞タイプを分離できることです。2リットルのシリンダーとセルローディングチャンバーを上部のプラットフォームに固定し、チューブクランプ付きの2つの小さなチューブですべてを接続します。すべてのチューブを閉じた状態でクランプし、右端の2リットルシリンダーの注ぎ口を密封します。
セルローディングチャンバーに小さな攪拌子を置き、左端の2リットルシリンダーに大きな攪拌子を置きます。次に、2リットルの沈降チャンバーをプラットフォームに置きます。金属製バッフルを沈降チャンバー底部の開口部の真上に配置して、フラクション収集中の液体のボルテックスと細胞勾配の乱れを防ぎます。
次に、沈殿チャンバーに蓋をします。三方ストップコックのすりガラスジョイントにごく少量の真空グリースを塗布します。次に、ストップコックを沈殿室の底部に固定し、ストップコックと沈殿室のすりガラスジョイントを接続します。
次に、セルローディングチャンバーをストップコックの右側の出口にチューブで接続します。ストップコックを閉じてから、細胞分画チューブをストップコックの左出口に取り付け、小さなチューブを一番下に固定します。左の2リットルシリンダーに2%BSA溶液を注ぎます。
4%BSA溶液を右側の2リットルシリンダーに注ぎます。これらのシリンダーを接続するチューブに大きな気泡がないことを確認してください。クレブス緩衝液をセルローディングチャンバーに注ぎ、このチャンバーと沈降チャンバーを接続するチューブを充填します。
グラデーションを乱す可能性のある大きな気泡がないことを確認します。必要に応じて、チューブを軽く絞るかフリックして気泡を取り除きます。すべてのクレブがセルチャンバーではなくチューブ内にあることを確認します。
少量のクレブス緩衝液を沈殿チャンバーに流入させます。次に、ほぼすべてのバッファーを細胞分画チューブに排出します。チューブを充填して大きな気泡を取り除くには、フラクションコレクターを沈殿チャンバーの真下に置きます。
すべてのフラクションチューブが所定の位置にあることを確認し、汚染を防ぐためにラップで覆います。精巣を8ミリリットルのクレブスを含む別のプレートに解凍します。精細管を囲む薄い膜を1対の鉗子で切開します。
次に、別の鉗子でメンブレンを保持します。尿細管をメンブレンから押し出し、メンブレンから押し出します。尿細管を含む 4 ミリリットルのクレブスを、25 ミリリットルのコラゲナーゼ溶液を含む各円錐形チューブに移します。
尿細管がスパゲッティのような外観になるまで、摂氏33度で10分間振とうします。次に、細管がチューブの底に5分間落ち着くのを待ちます。上清を注ぎ、室温で25ミリリットルのクレブスで2回洗浄し、毎回尿細管がチューブの底に沈殿するようにします。
各チューブに約5ミリリットルのクレブスを残します。尿細管をトリプシンでインキュベートした後。広口径ピペットを使用して、尿細管を含む溶液を攪拌します。
ピペッティングで約10回イン・アウトします。溶液は、シングルセル懸濁液のように見え始めるはずです。次に、各30ミリリットルの単一細胞懸濁液を100ミクロンメッシュのセルストレーナーでろ過します。
細胞懸濁液を結合した後、細胞の総数を数えます。ストップコックが、セルチャンバーから沈降チャンバーに流れを導くように配置されていることを確認してください。両方の攪拌棒プレートを低い設定に回します。
次に、細胞懸濁液を細胞チャンバーに注ぎます。ストップコックを開くと、細胞が毎分10ミリリットルの速度で沈殿チャンバーにゆっくりと流れ込みます。次に、ストップコックを閉じて、細胞を細胞チャンバーから洗い流します。
5ミリリットルの0.5%BSA溶液を注ぎ、毎分10ミリリットルの速度で沈殿チャンバーに排出します。ストップコックを閉じて、BSAウォッシュをさらに4回繰り返します。次に、セルチャンバーと2つの2リットルシリンダーとの間のクランプを開き、毎分40ミリリットルの速度で液体を沈殿チャンバーにすぐに排出し、BSA勾配を沈殿チャンバーにロードするのに約20〜30分かかるように流量を調整します。
BSAグラディエントの上に横たわる細胞の薄い乱されていない層を監視します。BSAの大部分が装填されたら、ストップコックを閉じ、沈殿チャンバーから分画チューブに液体が排出される位置に回します。次に、攪拌板をオフにし、細胞を1時間45分間沈殿させます。
沈降が完了したら、フラクションチューブをフラクションコレクターに取り付けます。ストップコックで流量を調整し、45秒ごとに収集チューブあたり10ミリリットルが収集されるようにします。すべてのフラクションが収集されたら、さまざまな細胞集団のフラクションを顕微鏡で分析します。
細胞サイズと核の形態に基づいて異なる細胞タイプを区別し、各画分の純度を決定できます。10マイクロリットルのDPI染色細胞をスライドに移します。カバースリップをセットし、蛍光顕微鏡で分析します。
サイズと核の形態が類似している画分を引っ張って、細胞の集団を作成します。約22個の精巣の典型的な調製。このステイプット手順では、約10〜8番目のセルが得られます。
Perperメタジェニック細胞型画分は、光学顕微鏡と蛍光顕微鏡の組み合わせを使用して迅速に分析できます。筋細胞、精子細胞、および体細胞二倍体細胞は、精巣に見られる最大の細胞であり、dpiで比較的均一に染色する大きな核を含みます。丸い精子細胞は、より小さな丸い核を持つ小さな細胞であり、一般に、明るく染色された色素中心が凝縮する細長い精子細胞は、鎌状の核を持つ小さな細胞です。
細胞画分を結合すると、細胞溶解物のウェスタン血液分析により、純度をさらに決定できます。筋細胞の一般的なマーカーは、Synap Neal Complex oneタンパク質です。凝縮性精子細胞の一般的なマーカーは、遷移タンパク質またはプロタミンです。
このテクニックは、一度習得すれば、開発後に適切に実行すれば7時間で完了します。この技術は、精子形成の分野の研究者が精巣からさまざまな細胞タイプの細胞プロセスを探求する道を開きました。
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概要
STA-PUT法を用いることで、サイズと密度の違いに基づいた精子形成細胞の異なる集団の分離が可能になります。この手法は、さらなる解析のために精巣から特定の細胞型を単離させるために不可欠です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 生殖生物学
背景
- 精子形成の理解は、生殖健康において極めて重要です。
- 精巣内の異なる細胞型は、それぞれ固有の役割と特性を持っています。
- 分離技術を用いることで、これらの細胞型の研究をより深化させることができます。
- STA-PUT法は、細胞のサイズと密度の差を利用して細胞分離を行います。
研究目的
- さまざまな精細胞集団を単離すること。
- 精巣における細胞組成の理解を深めること。
- 精細胞の機能に関するさらなる研究を促進すること。
使用した手法
- マウス精巣から混合細胞集団を回収する。
- 細胞およびBSA勾配をSTA-PUT装置にロードする。
- 細胞をBSA勾配を通して沈降させる。
- 細胞組成に基づいて分画を回収し、統合する。
主な結果
- 異なる種類の精子形成細胞の分離に成功したこと。
- STA-PUT法の有効性を実証したこと。
- サイズと密度に基づいた細胞集団の同定。
- 精子形成に関するさらなる研究への潜在的な応用。
結論
- STA-PUT法は、細胞分離のための信頼性の高い手法です。
- この手法は、精原細胞の多様性に関する理解を深めます。
- 今後の研究は、本研究で得られた知見に基づいて展開することが可能です。
よくある質問
業界における重要性
精子形成細胞の効率的な分離は、哺乳類の精子形成の根底にある分子メカニズムを解明するために極めて重要です。このプロセスは、まだin vitroで再現されていません。STA-PUT速度沈降法は、異なる精巣細胞集団の高収率かつスケーラブルな濃縮を可能にし、生殖生物学のパイプラインにおける早期発見およびメカニズムのリスク低減を支援します。この機能は、高度な細胞ソート設備を利用できない研究開発チームにとって特に価値があり、強固なターゲット検証および機能研究を促進します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 濃縮された細胞集団を用いることで、精子形成における細胞型特異的なパスウェイの解析が可能になります。
- 機能的に異なる生殖細胞段階を単離し、メカニズム研究に利用することで、生物学的なリスク低減（de-risking）を支援します。
- ダウンストリームアッセイに十分な細胞数を提供することにより、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を高めます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 定量的かつ再現性のあるアッセイ開発に向けた、検証済みで濃縮された細胞分画を調製します。
- 実験間で定義された細胞型の安定した分離を可能にし、アッセイの標準化をサポートします。
- スケールアップ可能な化合物スクリーニングやプラットフォームの再利用に適した、高収量の出力を提供します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 生殖生物学におけるトランスレーショナルなバイオマーカー探索のための、疾患に関連した細胞集団を提供します。
- 機能研究用の初代細胞を供給することで、初期探索から前臨床検証までの継続性を可能にします。
- 観察された効果を特定の細胞型に正確に帰属させることができ、前臨床モデルにおけるメカニズムの曖昧さを軽減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
STA-PUT法は、初期のターゲットバリデーションからアッセイ開発、さらには前臨床研究に至るまでの創薬プロセスに統合されており、特にin vitro分化系が不足している場合に有用です。
- 発見生物学：特定の精子形成段階を分離することで、仮説検証および経路の解明を支援します。
- スクリーニング：ダウンストリームの機能解析向けに、再現性と定量性のある細胞分画を提供します。
- 分析：顕微鏡観察やイムノブロッティングを介した、細胞型特異的なマーカーおよびアウトプットの測定を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：バイオマーカーの整合性確認や疾患モデリングのための一次細胞集団を供給します。
- エンタープライズ再利用：複数の研究プログラムに適用可能な、スケーラブルで設備負担の少ないソリューションを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：生殖ターゲットのバリデーションにおける予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを低減する。
- 運用上の価値：汎用的な機器を用いて、高収量で再現性の高い細胞分画を提供する。
- 戦略的価値：堅牢な早期段階のデータ生成をサポートし、より適切なgo/no-go判断と資本効率を実現する。
- ポートフォリオへの影響：リスク調整に基づいた生殖生物学プログラムの優先順位付けを促進する。
実施上の検討事項
- 精巣の解剖、細胞操作、および密度勾配遠心分離の専門知識が必要です。
- 特殊な器具が必要ですが、一般的なガラス器具およびコールドルームまたは大型冷蔵庫へのアクセスがあれば対応可能です。
- 分画の回収および純度評価について、チーム間での標準化が求められます。
- さまざまなげっ歯類モデルに適応可能ですが、他の種を用いる場合は最適化が必要な場合があります。
- 分画の純度は中程度であるため、後続のバリデーション（顕微鏡観察やイムノブロッティングなど）が不可欠です。
