ヒアルロン酸ナトリウムの網膜下注入によるげっ歯類における網膜剥離モデル

本手順の全体的な目的は、網膜下出血を伴わずに、再現性があり持続的な剥離高さを有する実験的網膜剥離を作成することである。まず、後方角膜縁で耳側結膜を切開し、結膜を強膜から分離させることでこれを達成する。第二段階では、30ゲージ針の先端を用いて、自己封鎖性の強膜切開および角膜穿刺を行う。

次に、神経感覚網膜をその下の網膜色素上皮から剥離させるため、尿酸ナトリウムを網膜下に注入します。最終ステップとして、強膜の創傷部にシアノアクリレート接着剤を塗布し、結膜を元の位置に再固定することで、尿酸ナトリウムの漏出リスクを低減します。最終的に、カバーガラスを用いて眼底を観察し、網膜下出血のないバルク状の網膜剥離が形成されていることを確認します。

げっ歯類における網膜剥離を誘発させる既存の手法では、剥離の高さや持続性にばらつきが生じ、その結果、測定される細胞死の率に一貫性がなくなる可能性があります。本手法を用いることで、網膜下出血のリスクを低減しつつ、再現性のある水疱状で持続的な網膜剥離を作成でき、げっ歯類における信頼性の高い網膜剥離モデルを構築することが可能です。げっ歯類における実験的な網膜剥離は、比較的容易に実施でき、経過時間も適切であり、ヒトの疾患に非常に類似しています。

したがって、本モデルは光受容細胞死のメカニズムの研究や、視力喪失を防ぐための治療法の研究に適しています。網膜変性疾患において、剥離した網膜における多様な光受容細胞死を解析する場合、網膜下出血を伴わずに再現性のある剥離を作成することが有利となります。これは、網膜剥離の期間の長期化や網膜下出血の発生が、光受容細胞死に影響を及ぼす可能性があるためです。

生後8週齢のマウスを麻酔した後、動物のひげを刈り取り、手術顕微鏡下で5%フェニレフリンおよび0.5%トロピカミドを含む溶液を用いて瞳孔を散瞳させます。動物の睫毛を切除し、0.5%プロカイン塩酸塩点眼液を用いて局所麻酔を施します。マウスを鼻が術者側に向くように側位に固定し、後角膜縁で側方結膜を切開し、ピンセットを用いて結膜を強膜から剥離させます。

輪部で結膜を把持し、眼球を固定します。次に、30ゲージの針の刃を上に向けて保持します。針の先端を用いて強膜にトンネルを作成し、網膜を貫通させることなく、強膜から脈絡膜まで穿刺します。

次に、30ゲージの針を虹彩と平行に保持し、角膜を穿刺して眼圧を下げます。続いて、針先を下に向け、Hamilton 10 µLシリンジに接続した33ゲージの針を網膜下腔に挿入し、3.5 µLのウラジンナトリウムを注入します。

これにより、神経感覚網膜の約50%が下層の網膜色素上皮から剥離します。ピンセットを用いて、角膜穿刺部位の周囲の角膜を押し、房水を角膜穿刺部位から流出させます。その後、外科用セルローススピアを使用して、強膜創からの漏出がないことを確認し、尿酸ナトリウムの漏出リスクを軽減します。強膜創にシアノアクリレート系接着剤を塗布し、結膜を元の位置に再固定します。

カバーガラスを用いて眼底を確認し、網膜下出血を伴わない局所的な網膜剥離が形成されていることを確認します。最後に、感染のリスクを低減させるため、眼に抗生物質軟膏を塗布します。低体温を防ぐため、マウスをヒートパッドの上に置いて保持してください。

低血圧の状態になった後、動物が麻酔から覚めたらケージに戻します。本プロトコルで誘発した網膜剥離の持続性を評価するため、剥離誘発後の3日目、7日目、および14日目に凍結切片を作成しました。

各時間点につき6つの眼を使用し、ヘマトキシリン・エオジン染色を用いて切片を可視化したところ、いずれにおいても水晶体に近接する網膜剥離の塊が認められた。

どの眼にも感染や水晶体損傷の兆候は見られませんでした。習得すれば、この手術は約5分で完了できます。この手順を行う際は、ナトリウムの漏出、強い光による網膜下出血、または水晶体損傷を引き起こさないよう、各ステップを慎重に行うことが重要です。これらはすべて、剥離した網膜における受容体細胞死に影響を及ぼす可能性があります。このビデオを視聴することで、網膜下出血を起こさず、再現性と持続性のある剥離高さを維持した、げっ歯類における実験的網膜剥離の作製方法について十分に理解できるはずです。