Name: コレラ毒素とビオチン化デキストランアミン二重標識が続く仮性狂犬病ウイルスとペリフェラルターゲットからトレース経シナプス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 12 s
Description: 学ぶ 経シナプスウイルス追跡と古典的追跡法を組み合わせて、末梢標的を制御する中枢前運動回路を解析する方法。この技術は神経回路の接続性と分布ネットワークの可視化に有用である。

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我々は、喉頭手術技術を教えるため、神戸大学、日本の博士俊夫寺島に感謝し、PRV-バーサを供給するためのプリンストン大学のDr.リンEnquist。研究は、エーリッヒ・D・ジャービスとグスタボ・アリアガにNSF大学院研究フェローシップ賞にNIHのパイオニア賞DP1 OD000448によってサポートされていました。適切に入金前作からフィギュアは、ジャーナルの編集方針に従ってPLoSのONEオープンアクセスクリエイティブ・コモンズ・ライセンス（CC-BY）の下で使用されています。

注：すべての動物の手順を見直し、デューク大学施設内動物管理と使用委員会により承認されています。 1.保存仮性狂犬病ウイルス<ol><li>私たちは、1×10 9 PFU /メートルの力価でプリンストン大学で博士リンEnquistの研究室から生ウイルス（PRV152）を得ました。ウイルスを生成するためのプロトコルは、2を公開されています。 </li><li>適切なバイオセーフティ条件の下で-80℃でBSL-2バイオセーフティキャビネットや店舗内チューブあたり20μlのでウイルスを等分。 </li><li>注入の直前にPRVのアリコートを解凍します。 </li></ol>筋肉内に注射するための2外科の準備<ol><li>ケタミン - キシラジン（100ミリグラム/ kgのケタミン、10mg / kgのキシラジン）の筋肉内注射により全身麻酔を誘導し、イソフルランを使用して、適切な麻酔薬平面を維持します。 </li><li>眼用軟膏で角膜を保護します。 </li><li>トンを準備彼の髪をトリミングし、ベタジンのスクラブと70％のアルコール（3サイクルの最小値）を交互に手術部位を消毒することにより、無菌技術による手術部位。外科的領域をカバーするために、滅菌ドレープを使用してください。手順を通して無菌技術に準拠していることを確認してください。 </li><li>皮膚切開を行い、目的の筋肉を明らかにしました。例えば、輪状甲状喉頭筋にアクセスするためには、まず胸骨筋の上に重なる部分を除去する必要があります。 </li><li> VetBond組織接着剤を用いて任意の離断筋肉をシール。 </li></ol>筋肉にPRVの3インジェクション<ol><li> 34 Gステンレス鋼針を取り付け、解凍したてのPRV溶液で10μlのNanoFilのマイクロシステムをロードし、慎重に定位デバイスにマウントします。 </li><li>ゆっくりとデッドスペースをクリアし、そのソリューションは、マイクロチップを出ることを確認します。 bioharzard廃棄物などの流体捨てます。 </li><li>定位micropを使用ositioningデバイスは慎重に興味のある筋肉にマイクロチップを配置し、わずかな腫脹が表示されるまで、ゆっくりと筋肉を埋めます。注入速度は、注入されるべき筋肉とボリュームのサイズに依存して変化します。例えば、4 NL /秒の速度で200 NL（1μlの合計）の5回の注射は、輪状甲状筋を埋めるために同じサイトに1分間隔で行われるべきです。関心の次の筋肉に注射器（この場合は横方向の輪状披裂）を移動し、注入手順を繰り返します。一度だけ各筋肉を穿刺。 </li><li> 5分後にマイクロシリンジを撤回。 </li><li> VetBondの組織接着剤を使用して、筋膜の断線をシール。 </li><li>すべての注射が完了した後、VetBond組織接着剤を使用して創傷を閉じます。お近くのinstitional動物使用のガイドラインに応じて、縫合糸または創傷クリップを使用することができます。 </li><li>胸骨の横臥位まで動物を監視し、鎮痛、食料、水を提供し、yで必要とされるケア当社の機関の動物の使用に関するガイドライン。 </li><li> （この場合、2 回目にラベルを付ける皮質ニューロンを注文する90時間）実験的に決定生存期間の後、ペントバルビタール過剰投与により動物を犠牲にし、0.1M PBS中の4％ホルムアルデヒドに続いて0.9％生理食塩水で経灌流。 </li><li> 24時間4％ホルムアルデヒドで脳を削除し、ポスト固定してください。 </li><li>少なくとも48時間、30％スクロースを含有するリン酸緩衝液中で脳をCryoprotect。 </li></ol> eGFPの4免疫化学的検出<ol><li>スライディングミクロトーム上で40μmのセクションをカットし、0.1MのPBSに浮遊セクションを保存します。取り付けられた切片を染色する際に薄肉部は、例えば、30μmとするために、使用されてもよいです。 </li><li>光から保護し、PBS中0.3％H 2 O 2で30分間、切片をクエンチしました。 </li><li> VECTASTAINエリートキット（キットVE）から正常ヤギ血清、0.3％Tween20を含むPBSで30分間、切片中の非特異的抗原を遮断します。 </li><liRTで：&gt;インキュベートは（千1）ウサギ抗-EGFPで3.5時間のためのセクションをブロックされています。 </li><li>インクルードを室温でキットをVEから、その後ヤギ抗ウサギ二次抗体で1時間のためにそれらをインキュベート、5分間のセクションをPBSで3回洗浄します。 </li><li>インクルードは、製造元の指示に従ってキットをVEからABC溶液を調製します。 </li><li> 5分間、切片をPBSで3回洗浄し、その後ザをRTでキットVEからABC溶液中で1時間のためにそれらを反応させます。 </li><li> 0.05％DAB（3、3&#39;-ジアミノベンジジン）および0.015％のH 2 O 2を含有する 、10分間、リン酸緩衝液中で切片を3回洗浄し、リン酸緩衝液中で8分間、pH7.4のために開発します。 </li><li>スーパーフロストプラススラ​​イド上のマウント部と段階的アルコールシリーズ（70％、95％、100％、5分間、それぞれ100％）を介してそれらを脱水します。 </li><li> 2キシレン回洗浄（各5分）を​​介してのセクションをクリアし、パーマウント封入剤でスライドをカバースリップ。 </li><li>画像顕微鏡に取り付けられたセクション。 DAB反応製品insidE細胞は茶色に表示されます。デジタル化された画像は色が細かいプロセスを強調するために反転させることができます。 </li></ol> PRVトレースによって検出された脳領域へのトレーサーの注射用5。外科の準備<ol><li>ケタミン - キシラジン（100ミリグラム/ kgのケタミン、10mg / kgのキシラジン）の筋肉内注射により全身麻酔を誘導し、イソフルランを使用して、適切な麻酔薬平面を維持します。 </li><li>眼用軟膏で角膜を保護します。 </li><li>適切な定位フレームに頭部を固定してください。 </li><li>髪をトリミングし、ベタジンのスクラブと70％のアルコール（3サイクルの最小値）を交互にサイトを消毒することにより、無菌技術による手術部位を準備します。 </li><li>頭皮の切開を行い、目的の脳領域上の皮膚を撤回。 </li><li>適切な定位座標で小開頭手術を行います。例えば、laryngeally接続運動皮質の座標はでPRVトレースによって識別n個の成体マウスは、1.2ミリメートル、横方向とブレグマに0.2ミリメートル吻側です。 </li></ol>脳へのビオチン化デキストランアミンの6インジェクション<ol><li>滅菌生理食塩水の333μlのBDA 25mgの（10,000 MW）を溶解することにより、7.5％のビオチン化デキストランアミン（BDA）を準備します。 </li><li>計画された注射用の十分なBDA溶液でNanoject IIマイクロピペットシステムをロードします。 </li><li>ゆっくりとデッドスペースをクリアし、そのソリューションは、マイクロピペットチップを出ていることを確認します。 </li><li>定位微細位置決め装置を使用して、慎重に関心のある脳領域にマイクロピペットの先端を下げ、ゆっくりBDAを注射します。領域の大きさに応じて、噴射率を標識するために調整します。例えば、4.6 NLの12注射は離れて0.2ミリメートル（吻側 - 尾側方向）は成体マウスでlaryngeally接続運動皮質をカバーするために、四つの異なる場所でも行われなければなりません。最終噴射量は、対象の脳領域の大きさに応じて調整されるべきです、ラベルは脳組織を通って、ラベルされたニューロンのプロセスに沿って拡散することにより、射出コアから広がる可能性があることを念頭に置いて。 </li><li>歯科用セメントを使用して開頭術を密封し、VetBond組織接着剤を使用して頭皮の傷を閉じます。 </li><li>胸骨の横臥位まで動物を監視し、鎮痛、食料、水を提供し、あなたの制度的動物使用のガイドラインによって要求されるように気になります。 </li></ol>筋肉へのコレラ毒素サブユニットBの7インジェクション<ol><li>滅菌生理食塩水100μlのCTbを1mgを溶解させることによって、1％コレラ毒素サブユニットB（CTB）を準備します。 </li><li>六日の脳へのBDA注射後、筋肉にPRV注射のために上記のように外科手術の準備を行います。 </li><li> 34 Gステンレス鋼針を取り付け、CTbを溶液で10μlのNanoFilのマイクロシステムをロードし、慎重に定位デバイスにマウントします。 </li><li>以前デとして関心の筋肉（複数可）にマイクロインジェクションを実行しますPRVのためのスクライブ。 </li><li>胸骨の横臥位まで動物を監視し、鎮痛、食料、水を提供し、あなたの制度的動物使用のガイドラインによって要求されるように気になります。 </li><li>三日のCTB注射の後、ペントバルビタール過剰投与により動物を犠牲にし、0.1M PBS中の4％ホルムアルデヒドに続いて0.9％生理食塩水で経灌流。 </li><li> 24時間4％ホルムアルデヒドで脳を削除し、ポスト固定してください。 </li><li>少なくとも48時間、30％スクロースを含有するリン酸緩衝液中で脳をCryoprotect。 </li></ol>同じセクション内BDAとCTbを8.検出<ol><li>ミクロトーム上で40μmのセクションをカットし、0.1MのPBSに浮遊セクションを保存します。 </li><li>光から保護し、PBS中0.3％H 2 O 2で30分間、切片をクエンチしました。 </li><li>インクルードは、製造元の指示に従ってキットをVEからABC溶液を調製します。 </li><li>切片を5分間PBSで3回洗浄し、その後、室温でABC溶液中で1時間のためにそれらを反応させます。 </LI&gt; <li> 10分間、リン酸緩衝液中で切片を3回洗浄し、0.05％DAB（3、3&#39;-ジアミノベンジジン）、0.015％のH 2 O 2、及び0.05％の塩化ニッケルを含有し、リン酸緩衝液中で8分間、pH7.4のために開発します。細胞内でのDAB反応生成物は、黒表示されます。 </li><li> VECTASTAINエリートキットから正常ウサギ血清を0.3％Tween 20を含むPBS中で30分間ブロックセクション。 </li><li> RTで：インキュベートは、（10,000 1）ヤギ抗CTbをで2時間のセクションをブロックされています。 </li><li>セクション5分間PBS中で3回洗浄し、その後、インクルードをRTでキットをVEからウサギ抗ヤギ二次抗体で1時間のためにそれらをインキュベートします。 </li><li>インクルードは、製造元の指示に従ってキットをVEからABC溶液を調製します。 </li><li> 5分間、切片をPBSで3回洗浄し、その後、室温でABC溶液中で30分間、それらを反応させます。 </li><li> 0.05％DAB（3、3を含む、10分間のセクションをリン酸緩衝液で3回洗浄し、リン酸緩衝液中に最大8分、pHが7.4のために開発「-diaminobenzidine）と0.015％H 2 O 2。細胞内でのDAB反応生成物は茶色に表示されます。 </li><li>スーパーフロストプラススラ​​イド上のマウント部と段階的アルコールシリーズ（70％、95％、100％、5分間、それぞれ100％）を介してそれらを脱水します。 </li><li> 2キシレン回洗浄（各5分）を​​介してのセクションをクリアし、パーマウント封入剤でスライドをカバースリップ。 </li><li>画像顕微鏡に取り付けられたセクション。 </li></ol>

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</ol>

利益相反は宣言されていません。

PRV152 4,21を用いた実験を計画する際に考慮に入れなければならない多くの問題があります。最も重要なのは、仮性狂犬病ウイルスは致命的です。前述したように、ヒトを含む大型類人猿は、感染に対して感受性ではなく、適切なケアは、他の動物を保護するために行使されなければなりません。成体マウスは通常、5〜7日間の弱毒PRV152株を接種​​した後に生き残ります。したがって、PRV152は1週間以上の生存時間を必要とする実験のために適切ではありません。また、感染した動物は、一般的に、それによって正常な行動の観察を必要とする実験のためPRV152の有用性を制限し、生存期間中に病気の兆候が表示されます。 さらに、PRV152は、細胞傷害性免疫応答22をトリガーします 。複製やウイルスの送信は時間依存4 titer-とされているので、ニューロンのパターンは、ビラの免疫化学的検出によって明らかに細胞は、感染の段階を経て進行としてのLタンパク質またはEGFPレポーター遺伝子は、生存期間の過程で変更されます。五日間筋肉内接種後、 <s...

経シナプストレースは多シナプス回路を介して周辺の目標を調整する中央遠心性を分析するために使用される強力なツールとなっています。このアプローチは、最も広くブタ病原体仮性狂犬病ウイルス（PRV）、PRV-バーサは、最初1961 12に記載とりわけ弱毒株を利用して、げっ歯類の脳に使用されている。ここでは、特定の筋肉の運動皮質の表現を識別するためのプロトコルを提示強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）レポーター遺伝子2を発現する組換え仮性狂犬病ウイルス株（PRV152）を使用して、または筋肉群。記載されている方法は、クロスシナプスが機能回路3,4,13内の他のニューロンに感染することは感染性の子孫を生み出す神経向性ウイルスの挙動を利用しています。 PRV-バーサと同質遺伝子であるPRV152は、唯一の&lt;離れ感染部位3,5からのシナプス結合の階層的なシーケンスを逆行性シナプスを横切ります/ SUP&gt;。正確感染末梢部位を制御することにより、運動ニューロンの特定のサブセットを介して脳へのウイルスの侵入を制限することができます。ウイルス順次接続されているニューロンのチェーンに感染したように、脳全体のeGFP信号の得られたパターンは、その後、最初に感染した細胞に接続されているニューロンのネットワークを解決します。 ニューラルトレースのウイルスを使用することのさらなる利点は、感染細胞内のレポータータンパク質（この場合はEGFP）の増幅です。この信号増幅も疎突起の検出を可能にする感度のレベルを提供します。例えば、ウィスカーを制御顔面運動ニューロンへの感覚毛の運動野からのスパース投影がウイルス発現緑色蛍光タンパク質14を用いて、ラットで発見されました。以前の研究は、レポーター遺伝子増幅11,15なしで古典的なトレーサーを使用して、この投影法を見つけることができませんでした。残念ながら、多くのウイルスベクターがトレース挙げ研究で使用したものと同様に、それによって多シナプス回路をトレースするためのそれらの使用を制限し、シナプスを横断しません。 モータ回路に参加した細胞のネットワークを識別するための明確な利点を提示しながら、PRV-152を使用したトレースの経シナプスの分散性が困難な回路内の特定の接続を解釈することができます。したがって、我々は、ビオチン化デキストランアミン（BDA）およびコレラ毒素サブユニットB（CTB）を使用して、二重標識によってPRV-152を使用して識別回路内の特定の接続を検証するための簡単​​な方法を提示します。 BDAとCTbをの併用は、ニューロン6-8,11の特定のセットの間の接続をトレースするための十分に確立された手法です。一緒に使用する場合、これらの二つのトレーサーは、2色DAB（3、3&#39;-ジアミノベンジジン）手順16を使用して同じ部分に可視化することができます。高分子量BDA（BDA10kDaは）それYので、このプロトコルを選択しました神経プロセス6,7,9の詳細なラベル付けをields。 BDA10kDaのさらなる利点は、以下のものがあります。それは、優先的に順行方向6-8に搬送されます。それは、イオン導入や圧力注入6-8で配信することができます。それは、単純なアビジン-ビオチン化HRP（ABC）の手順17で視覚化することができます。それは、光または電子顕微鏡6,7,18によって画像化することができます。それは、遠位樹状突起10,19を含む細胞プロセスを明らかにするのに有効であるため、ペルオキシダーゼおよびDABとCTbをの免疫化学的検出は、運動ニューロンの逆行性標識のために選ばれました。我々は最近、マウスでのボーカル運動経路を特定するために、以前に20存在しないと仮定した喉頭運動ニューロンへの一次運動野から疎な接続を明らかにするために、このアプローチを使用していました。

<table><tbody><tr><td>試薬名/材料</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>NanoFil マイクロインジェクションシステム</td><td>ワールド 精密機器</td><td>IO-Kit</td><td>34 G オプション</td></tr><tr><td>固定装置フレーム</td><td>David Kopf Instruments</td><td>モデル 900</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II オートナノリットルインジェクター</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-204</td> スライディングミクロトーム<td></td></tr><tr><td></td><td>ライカ</td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>VetBond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>イソフルオラン(フォラン)</td><td>Baxter&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1001936060 ベタジン スワブ スティック</td><td>Cardinal Health</td><td>2130-01</td><td>200 カウント</td></tr><tr><td>パーマウント マウント ミディアム</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>スーパーフロスト プラス スライド</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化デキストラン アミン</td><td>Invitrogen</td><td>D-1956</td><td>10,000 MW</td></tr><tr><td>偽狂犬病ウイルス</td><td>博士の研究室Lynn Enquist (プリンストン大学)</td><td>PRV152</td><td>力価 >1 x 107</td></tr><tr><td>抗コレラ毒素 B サブユニット (ヤギ</td><td>)リスト 生物研究所</td><td>703</td><td></td></tr><tr><td>コレラ毒素 B サブユニット</td><td>リスト 生物学研究所</td><td>103B</td><td></td></tr><tr><td>抗eGFP</td><td>オープンバイオシステム</td><td>ABS4528</td><td></td></tr><tr><td>3, 3'-ジアミノベンジジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td>10 mg錠剤</td></tr>エ<tr><td>タノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200プルーフ</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>4%</td></tr><tr><td>過酸化水素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3410</td><td>30%</td></tr><tr><td>ケタミンHClに希釈キシラジンHCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4138</td><td>80 mg/ml & 6 mg/ml</td></tr><tr><td>塩化ニッケル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339350</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3619</td><td>1.0 M; pH 7.4</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>10x; pH 7.4</td></tr><tr><td>ペントバルビタールナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3761</td><td>50 mg/mL</td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td>組織学的グレード</td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6101 (ウサギ);PK-6105 (ヤギ)</td><td></td></tr><tr><td>Optixcare 眼軟膏</td><td>Vet Depot</td><td>1017992</td><td></td></tr></tbody></table>

コレラ毒素とビオチン化デキストランアミン二重標識が続く仮性狂犬病ウイルスとペリフェラルターゲットからトレース経シナプス

Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling

経シナプストレースは多シナプス回路を介して周辺の目標を調整する中央遠心性を分析するために使用される強力なツールとなっています。このアプローチは、最も広くブタ病原体仮性狂犬病ウイルス（PRV）1を利用して脳内で使用されています。 PRVは、ヒトを含む大型類人猿を、感染していないので、それは、最も一般的に小型哺乳類、特にげっ歯類での研究で使用されています。仮性狂犬病株PRV152は、高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）レポーター遺伝子を発現し、逆行だけ離れた感染部位から2,3シナプス結合の階層的なシーケンスを機能的シナプスを横切ります。他のPRV株は、異なる微生物学的特性を有し、両方向（PRV-ベッカーとPRV-カプラン）4,5に搬送することができます。このプロトコルは、PRV152を独占的に扱います。筋肉のような末梢部位にウイルスを送達することによって、それがTへのウイルスの侵入を制限することが可能です神経細胞の特定のセットを通じ、彼は脳。脳全体のeGFP信号の得られたパターンは、その後、最初に感染した細胞に接続されているニューロンを解決します。仮性狂犬病ウイルスを使用したトレースの経シナプスの分散性が困難な識別されたネットワーク内の特定の接続を解釈させるように、私たちは使用して識別されたセル間の接続を確認するために、ビオチン化デキストランアミン（BDA）およびコレラ毒素サブユニットB（CTB）を使用する高感度かつ信頼性の高い方法を提示PRV152。彼らは、遠位樹状突起6-11を含む細胞プロセスを明らかにするのに効果的であるため、ペルオキシダーゼおよびDAB（3、3&#39;-ジアミノベンジジン）とBDAとCTbをの免疫化学的検出を選択しました。

eGFPのための染色は、一次運動ニューロンの筋肉にPRV152を注入した後、約72時間の弱い信号を示す開始する必要があります。ウイルスの複製および経シナプス輸送はtiter-と時間依存4されています。約90時間の注入後、eGFPの染色は、2 番目の順に感染した細胞において強いシグナルを明らかにします。より長い生存期間は、3 回目を明らかにし、より高次の細胞が、生存時間は約5日間接種後PRVの致死性によって制限されています。 図1aは、7つの喉頭筋の二つに94時間PRV152を注入した後、PRV152は喉頭運動ニューロンを収容疑核、におけるEGFPを発現する感染したニューロンを示しています。ウイルスが感染した筋肉は、そのような舌下神経核などの他の発声運動ニューロンプールを、神経支配ニューロンを介して脳に入ったので、eGFPを発現しない（ 図1B）。 <pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt; 図2...

Transsynaptic tracingは、多シナプス回路を通じて周辺標的を調節する中心遠心性神経を分析するための強力なツールとなっています。ここでは、シナプス経性偽狂犬病ウイルスを利用して機能的な脳回路を同定し、局在化するプロトコルと、同定されたニューロングループ間の回路内の特定の接続を検証するための古典的なトラクトトレース技術を紹介します。

Transsynaptic tracing has become a powerful tool used to analyze central efferents that regulate peripheral targets through multi-synaptic circuits. This ...

本手順の全体的な目的は、特定の末梢標的に影響を与える分散した細胞からなる中心的な運動前ネットワークを特定し、その後、脳内におけるそれらの細胞間の特異的な接続を確認することです。これはまず、筋肉を介して末梢から導入される経シナプス性ウイルスベクターを用いて、運動前回路に逆行性感染させることで達成されます。本手順の第2ステップでは、蛍光顕微鏡を用いて感染細胞を可視化します。第3のステップは、事前に特定した前運動回路のノードを標的として単シナプス追跡剤を注入し、脳内の特異的な接続を確認することです。最終的に、経シナプス・ウイルス追跡と従来の単シナプス神経解剖学的手法を組み合わせることで、分散した前運動ネットワーク内の細胞が互いにどのように接続しているかを示すことができます。従来の単シナプス神経追跡などの既存手法に対するこの技術の主な利点は、麻酔下にあるマウスにおいて、分散神経ネットワークのノードを特定し、そのネットワーク内の細胞間の特異的な接続を解明できる点にあります。被毛を刈り取り、ベタジンと70%アルコールを用いて皮膚を少なくとも3回交互に洗浄・消毒し、手術部位を準備します。次に、喉の領域に皮膚切開を加え、目的の筋肉を露出させます。例えば、輪状甲状筋に到達させるには、まずその上層にある胸骨甲状筋の一部を除去し、切断した筋肉はVetBond組織接着剤で封鎖する必要があります。次に、解凍したばかりのPR RV溶液を10 µLナノフィルマイクロシリンジシステムに充填します。デッドスペースをゆっくりと排除し、溶液がマイクロシリンジのチップから出ていることを確認してください。溶液はバイオハザード廃棄物として廃棄し、慎重にステレオタキシス装置に取り付けます。マイクロポジショニングデバイスを使用して、目的の筋肉に針先を慎重に挿入します。その後、わずかな腫れが見えるまで、ゆっくりと筋肉内に注入します。次に、シリンジを次の目的の筋肉（この場合は側輪状披裂筋）に移動し、同様の操作を繰り返します。注射の手順では、各筋肉に穿刺のみを行います。注射速度は、筋肉のサイズと注入量によって異なります。例えば、輪状甲状筋を充填させるには、同一部位に200 nanolitersの注射を、4 nanoliters/secondの速度で1分間隔で5回行います。マイクロシリンジを回収した後、Vetbond組織接着剤を用いて筋膜の切開部を封鎖します。すべての注射が完了したら、Vetbond組織接着剤を用いて創部を閉鎖します。動物が胸腹臥位（sternal recumbent）になるまで観察してください。その後、施設の動物実験ガイドラインに従い、必要に応じて鎮痛剤の投与、餌と水の提供、およびケアを行ってください。EGFP発現およびPRV感染ニューロンの解析手順については、テキストプロトコルに詳しく記載されています。組織処理の手順は、このビデオの後半で説明される内容と非常に似ています。まず、成体マウスを麻酔し、眼球を保護して頭部の位置を固定します。次に、以前に概説した通り、ベタジンの洗浄と70%アルコールの拭き取りを交互に行い、手術部位を準備します。次に、頭皮を切開し、脳上の頭皮を牽引します。関心領域です。適切な立体定位座標に従い、ドリルを用いて小さな開頭術を行います。例えば、成マウスにおいてPRVトレーシングにより同定された喉頭連結運動皮質の座標は、bgmaから外側に1.2 millimeters、吻側に0.2 millimetersです。次に、滅菌水を用いて7.5%のビオチン化デキストランアミン溶液を調製します。その後、計画している注入に必要な量のBDA溶液をnano jet twoマイクロピペットシステムに充填します。デッドスペースをゆっくりと排除し、マイクロピペットのチップから溶液が出ていることを確認します。マイクロポジショニングデバイスを使用して、マイクロピペットのチップを標的となる脳領域まで慎重に下げ、BDA溶液をゆっくりと注入します。ラベル化する領域の大きさに応じて、注入速度を調整してください。例えば、成マウスの喉頭結合運動皮質をカバーするように、4箇所の異なる部位に4.6 nanolitersの注入を12回ずつ行います。各注入部位の間隔は0.2 millimetersとします。最終的な注入量は、関心領域の大きさに合わせて調整してください。ラベルは注入中心部から脳組織を介して、またラベルされたニューロンの突起に沿って拡散する可能性があることに留意してください。滅菌生理食塩水で頭蓋開窓部を洗浄し、濡らした後、Vetbond組織接着剤を用いて頭皮の傷口を塞ぎます。動物が胸腹臥位（sternal recumbent）になるまで観察します。その後、所属機関の動物実験ガイドラインに従い、必要に応じて鎮痛剤の投与、給餌、給水、およびケアを行ってください。6日後、コレラトキシンBサブユニットを動物の筋肉内に注射します。その後3日後に、分析のため動物を安楽死させます。クライオスタットを用いて40 µmの厚さで切片を作成し、浮遊切片を0.1 MのPBSに保存します。切片を0.3%過酸化水素含有PBSで、遮光下にて30分間振盪しながらクエンチ処理します。切片をPBSで5分間×3回洗浄します。次に、室温で、調製したばかりのA b、C溶液を用いて1時間反応させます。その後、切片をリン酸緩衝液で10分間×3回洗浄します。次に、DAB、過酸化水素、および塩化ニッケルを含むpH 7.4のリン酸緩衝液中で、攪拌しながら8分間発色させます。細胞内のDAB反応生成物は黒色に呈色します。次に、Vector Stain Eliteキットの正常ウサギ血清および0.3% tween 20を含むPBS中で、30分間振とうしながら切片をブロッキングします。続いて、ブロッキングした切片をヤギ抗CTB抗体中で、室温にて2時間振とうしながらインキュベートします。その後、PBSで5分間ずつ3回、切片を洗浄します。VEキットのウサギ抗Go二次抗体を適用し、室温で1時間振盪しながら切片をインキュベートします。PBSで5分間ずつ3回切片を洗浄し、その後、室温で調製直後のA、b、C溶液中で30分間反応させます。リン酸緩衝液で10分間3回切片を洗浄し、切片を8分間インキュベートします。現像液中では、細胞内のDAB反応生成物が茶色に呈色します。次に、切片をSuperFrost Plusスライドグラスに貼り付け、段階的なアルコール系列で組織を脱水し、続いてキシレンで2回透徹洗浄を行います。その後、パラマウントでカバーグラスを掛け、イメージングに進みます。EGFPの染色は、PRV 1 52の注入後72時間で一次運動ニューロンに弱いシグナルが現れ始め、90時間後には強くなります。喉頭の7つの筋肉のうち2つにPRV 1 52を注入した場合、喉頭運動ニューロンが存在する疑核は注入後94時間に確認されます。これは、ウイルスが感染した筋肉を支配するニューロンを介して脳内に侵入するためです。舌下神経核などの他の随意運動ニューロンプールでは、90時間後にEGFPは発現していません。EGFPは二次ニューロンで確認できます。これらの脳幹ニューロンは、疑核における一次感染の後に染色されました。注入は片側的に行われ、その結果、脳幹におけるラベルのパターンから同側の迷走神経背側核への感染が示されました。疑義核および孤束核の網様体介在ニューロンも感染し、EGFPに対して強く染色されました。これらの介在ニューロンは、鰓弓運動ニューロンプールや対側の疑義核を含む様々な構造と接続しています。しかしながら、ウイルスが逆行性にのみ伝播するため、その遠心性標的はラベルされないままとなります。PRVを用いた生存期間は限られていますが、3次以上の細胞でのEGFP染色を確認することが可能です。運動皮質の前運動ニューロンにおいて、末梢注入部位と対側でEGFPが発現していました。おそらく、喉頭筋の運動皮質表現を構成する細胞集団のみが感染したと考えられます。矢印で示された疑核レベルのBDA標識軸索は、喉頭筋への注入によって逆行性に標識されたCTB陽性運動ニューロン（茶色で表示）と接触しています。これらの軸索は、喉頭運動ニューロンの樹状突起近傍および細胞体近傍に、バリコシティ（静脈瘤様膨大部）および終末ボタンと思われる構造を形成しています。これらのバリコシティがシナプスを形成しているかを確認するには、電子顕微鏡または電気生理学を用いたさらなる実験が必要です。喉頭に接続する運動皮質へBilateral（両側性）に注入されたBDAは黒色で表示されています。BDAは方向特異性を持たないため、求心性および遠心性の両方の接続が標識される可能性があります。例えば、視床において、順行性標識の投射野と逆行性に標識された細胞体の両方が観察されます。視床細胞を矢印で示し、方向の指標として内包を標識しています。偽狂犬病ウイルスおよびDABを用いた操作は極めて危険であるため、滅菌などの予防措置を忘れないでください。PRVまたはDABに接触したすべての器具は、10%次亜塩素酸ナトリウム溶液を用いて洗浄してください。本手順の実施中は、常に所属機関の規定に従い、バイオハザード固形廃棄物および液体廃棄物の適切な処理を行ってください。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

シナプス接続されたニューロンをトレースする方法が記載されている。我々は、目的の細胞集団は遺伝的に定義された種類の細胞からシナプス入力を受け取るかどうかを調べるために上流の細胞のTVAの特異性を利用する。...

遺伝的に定義された神経回路のトレースウイルス

二元的な遺伝的戦略を利用して、Creを介した組換え後に相補的な経シナプストレーサーを発現するマウスの神経回路トレースのための詳細なプロトコルを提供します。細胞特異的トレーサー産生は遺伝的にコードされているため、私たちの実験的アプローチは、マウス胚の脳発生中の神経回路の形成と成熟を単一細胞分解能で研究するのに適しています。...

マウス胎児の脳のトレース条件付き遺伝経シナプス

我々は、in vitroでの調製物を用いて脳核に順行性または逆行性トレーサー注射を介して、神経細胞とそのプロセスを標識する技術が記載されています。我々 は 、nラベリング精度を高めるために、蛍光標識されたマウスの変異体および基本光学機器を利用して、トレーサーエレクトロ体 ​​外 I既存の方法を変更しました。...

脳の外植片にレーザー誘導神経トレース

このビデオは、Thy1-GFPトランスジェニックラインのin vivo...

同時2光子<em&gt;インビボ</emマウス脳梁膨大後部皮質におけるシナプス入力とシナプス後ターゲットの&gt;イメージング

このプロトコルは、選択的ニューロン集団の大規模な再構成を説明し、蛍光マーカーを発現する修正された狂犬病ウイルス、および独立した、公平なクラスタとラベルされた次の逆行性感染症は、それが明確なニューロンのサブクラス間の形態学的評価指標の包括的な特性評価を可能に分析します。...

大規模な再建と選択的集団のニューロンを分類するために形態学的指標に基づいて独立、不偏クラスタリング

ここでは、効果的に相互神経経路を通じて染色蛍光ラベリング ビオチン標識デキストラン アミン (BDA) を明らかにする洗練されたプロトコルを提案します。微細構造の解析に適しています bda...

トレースのラットにおける視床皮質投射のビオチン標識デキストランの高分子量アミンの運用の改善

シナプス小胞 (SV) 培養神経細胞におけるリサイクルの光分析について述べる。このプロトコルを組み合わせて二重トランスフェクション シナプス...

シナプス小胞の培養神経細胞シナプス蛋白質の過剰発現でリサイクルのため光アッセイ

現在のプロトコルは、海馬への腹側テグメンタル領域(VTA)グルタミン酸突起をトレースするための簡単な方法を示しています。VTAグルタミン酸ニューロンの光刺激をCA1記録と組み合わせて、VTAグルタミン酸末端が生体内での推定ピラミッド発火率を調節する方法を示した。...

海馬の腹側テグメンタル領域グルタミン酸末端のインビボ解剖学的および機能的なトレース

ここでは、急性げっ歯類の脳スライスにおけるシナプス特異的な電気生理学的特性評価を可能にするために、光遺伝学的構築物を備えた個別の脳領域のウイルス形質導入を記述するプロトコルを提示します。...

エクスビボ 内側前頭前野から外側嗅内皮質への長距離シナプス伝達と可塑性の光遺伝学的調べ

トランスジェニック蛍光マウスを用いて、生きた動物における無傷の坐骨神経の運動軸索および感覚軸索内のシグナル伝達エンドソームおよびミトコンドリアの インビボ 軸索輸送を評価するための詳細なプロトコールが記載されている。...

軸索輸送の In Vivo イメージングのためのツールキットの拡張

シリアル2光子断層撮影法(STPT)イメージングは、2光子イメージングと自動ステージ制御およびミクロトームスライスを組み合わせて、組織の塊を3次元形状でイメージングする技術です。ここでは、マーモセットの脳がその構造的特徴をよりよく理解するために、それを実装するためのプロトコルについて説明します。...

神経解剖学的解析のためのマーモセット脳全体の連続2光子断層撮影法

学ぶ 経シナプスウイルス追跡と古典的追跡法を組み合わせて、末梢標的を制御する中枢前運動回路を解析する方法。この技術は神経回路の接続性と分布ネットワークの可視化に有用である。

コレラ毒素とビオチン化デキストランアミン二重標識が続く仮性狂犬病ウイルスとペリフェラルターゲットからトレース経シナプス

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