コレラ毒素とビオチン化デキストランアミン二重標識が続く仮性狂犬病ウイルスとペリフェラルターゲットからトレース経シナプス

この手順の全体的な目標は、特定の末梢標的に衝突する分布細胞の中央運動前ネットワークを発見し、脳内のそれらの細胞間の特定の接続を確認することです。これは、最初に逆行性を起こし、筋肉を介して末梢に送達されるトランスシナプスウイルスベクターを運動前回路に感染させることによって達成されます。手順の2番目のステップは、感染した細胞を光蛍光顕微鏡で視覚化することです。

3番目のステップは、運動前回路の以前に特定されたノードを標的としたモノスシナプストレーサーを注入することにより、脳内の特定の接続を確認することです。最終的に、結果は、トランスシナプスウイルストレーシングと従来のモノシナプス神経解剖学的技術の組み合わせを通じて、分布した運動前ネットワーク内の細胞が互いにどのように接続されているかを示すことができます。従来のモノシナプスニューロトレーシングのような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、分布したニューロネットワークのノードを特定し、そのネットワーク内の細胞間の特定の接続を麻酔マウスで解決できることです。

髪をトリミングし、ベタジンと70%アルコールの少なくとも3つの交互のスクラブで皮膚を消毒することにより、手術部位を準備します。次に、喉の領域に皮膚を切開し、目的の筋肉を明らかにします。例えば、輪状甲状喉頭筋にアクセスするには、まず、Sterno舌骨筋の上にある部分を取り除き、横断した筋肉を獣医接着組織接着剤で

次に、10マイクロリットルのナノフィルマイクロシリンジシステムに解凍したばかりのPRVRV溶液をロードします。デッドスペースをゆっくりとクリアし、溶液がマイクロシリンジチップから出ることを確認します。液体をバイオハザード廃棄物として廃棄し、脳定位固定装置に慎重に取り付けます。

マイクロポジショニングデバイスを使用して、針先を目的の筋肉に慎重に配置します。次に、わずかな腫れが見えるまでゆっくりと筋肉を満たします。次に、シリンジを次の関心のある筋肉(この場合は外側輪状突起テノイド)に移動し、繰り返します。

注入手順は、各筋肉のみを穿刺します。一度注入速度は、筋肉のサイズと注入する量によって異なります。例えば、輪状甲状筋を満たすために、200ナノリットルを毎秒4ナノリットルの速度で5回注射し、同じ部位で1分間隔で行う必要があります。

マイクロシリンジを引っ込めた後、獣医用ボンド組織接着剤を使用して筋膜の切れ目を密封します。すべての注射が終了したら、獣医用ボンド組織接着剤を使用して傷口を閉じます。それが胸骨の横臥を示すまで動物を監視します。

その後、施設の動物が必要とする鎮痛剤、餌、水、およびケアを提供します。使用ガイドライン。EGFP発現およびPRV感染ニューロンの解析手順は、テキストプロトコルで詳細に説明されています。

組織の処理は、このビデオの後半で説明するものと非常によく似ています。成虫のマウスに麻酔をかけ、目を保護し、頭の位置を固定することから始めます。次に、前に概説したように、ベタジンと70%アルコールを交互にスクラブして手術部位を準備します。

次に、頭皮を切開し、頭皮を脳の上に引っ込めます。関心のある領域。適切な脳定位固定座標でドリルを使用して小さな開頭術を行います。

例えば、成体マウスのPRVトレーシングによって同定された喉頭接続運動皮質の座標は、bgmaに対して横方向に1.2mm、吻側に0.2mmです。次に、滅菌水中のビオチン化デキストランアミンの7.5%溶液を調製します。次に、Nano Jet 2マイクロピペットシステムに、計画された注入に十分なBDA溶液をロードします。

デッドスペースをゆっくりとクリアし、溶液がマイクロピペットチップから出ていることを確認します。マイクロポジショニングデバイスを使用して、マイクロピペットの先端を慎重に脳の関心のある領域に下げ、BDA溶液をゆっくりと注入します。ラベルを付ける領域のサイズに応じてレートを調整します。

例えば、4.6ナノリットルの注射を12回、0.2ミリメートル間隔の4つの異なる場所で行う必要があります。成体マウスの喉頭接続された運動皮質を覆うためのStro coddle。

最終的な注入量は、関心領域のサイズに応じて調整する必要があります。標識は、注射コアから脳組織を通って、標識されたニューロンのプロセスに沿って拡散する可能性があることに留意してください。滅菌生理食塩水で開頭術を清潔で湿らせ、獣医用ボンド組織接着剤を使用して頭皮の傷を閉じます。

それが胸骨の横臥を示すまで動物を監視します。その後、施設の動物が必要とする鎮痛剤、餌、水、およびケアを提供します。使用ガイドライン。

6日後、コレラ毒素サブユニットBを動物の筋肉に注射することができます。それから3日で、動物は分析のために犠牲にされるべきです。クライオスタットで切片を40ミクロンで切断し、浮遊切片を0.1モルPBSで保存し、0.3%過酸化水素を含む切片をPBSで30分間急冷し、振とうし、光から保護します。

切片をPBSで3回、1回の洗浄につき5分間洗浄します。次に、室温で新たに調製したA、b、C溶液で1時間反応させます。次に、切片をリン酸緩衝液で3回、洗浄ごとに10分間洗浄します。

次に、DAB過酸化水素と塩化ニッケルを含むpH 7.4のリン酸緩衝液中で攪拌しながら切片を8分間現像します。細胞内のDAB反応生成物は黒く見えるはずです。

次に、0.3%tween 20を含むPBSで30分間振とうしながら、ベクターステインエリートキットの通常のウサギ血清で切片をブロックします。次に、ブロックされた切片をヤギ抗CTBで室温で2時間振とうしながらインキュベートします。次に、セクションをPBSでさらに3回、1回の洗浄につき5分間洗浄します。

VEキットからウサギアンティゴ二次抗体をアプライし、室温で1時間振とうしながら切片をインキュベートします。切片をPBSで3回、1回の洗浄につき5分間洗浄し、次いで室温で新たに調製したA、b、C溶液中で30分間反応させます。切片をリン酸緩衝液で10分間3回洗浄し、切片を8分間インキュベートします。

開発ソリューションでは、細胞内のDAB反応生成物が茶色に見えるはずです。次に、セクションをスーパーフロストとスライドに取り付け、等級付けされたアルコールシリーズで組織を脱水し、続いてキシレンで2回洗浄します。次に、スライドをパラマウントで覆い、スリップしてイメージングを進めます。

EGFPの染色は、P RV 1 52を注入してから72時間後に一次運動ニューロンに弱いシグナルを示し始め、90時間後には染色が強くなります。喉頭運動ニューロンを収容するこのあいまいな核は、7つの喉頭筋のうちの2つにP RV 1 52を注入してから94時間後に見られます。ウイルスは、感染した筋肉を神経支配するニューロンを介して脳に侵入したためです。

舌下核などの他の運動ニューロンプールは、90時間後にEGFPを発現しません。EGFPは2次細胞で見ることができます。これらの脳幹ニューロンは、曖昧な核で一次感染後に染色されました。

注射は片側性であり、結果として生じる脳幹の標識パターンは、同側核の感染を示しています。曖昧で孤立した網様体ニューロン核も感染し、EGFPに対して強く染色されました。これらの神経間細胞は、運動神経細胞プールや対側核など、さまざまな構造をつないでいます。紛らわしい。

しかし、ウイルスは逆行性方向にしか拡散しないため、遠心性標的は標識されないままです。PRVによる生存時間は限られていますが、末梢注射部位に対してEGFPを発現した運動皮質の運動前ニューロンに感染した3次および高次の細胞でEGFP染色を示すことができます。おそらく、喉頭筋組織の運動皮質表現を構成する細胞の集団のみが感染した。

BDAは、矢印でマークされた曖昧な核のレベルで軸索を標識し、喉頭筋への注射によって逆行性に標識されたCTB陽性運動ニューロンと接触し、茶色で見られる軸索は、喉頭運動ニューロンの樹状突起の近くと喉頭運動ニューロンの体細胞の近くに静脈瘤と推定末端警棒を形成します。これらの静脈瘤がシナプスを表しているかどうかを判断するには、電子顕微鏡または電気生理学を使用したさらなる実験が必要です。喉頭接続された運動皮質に配置されたBDAの両側注射は、BDAが方向性特異的ではないため、求心性接続と遠心性接続の両方がラベル付けされている場合があるため、黒色で見られます。

例えば、視床には、前行性標識の投影野と逆行性によって標識された細胞体の両方が見られます。視床細胞は矢印で識別され、内部カプセルは配向性がラベル付けされます。偽狂犬病ウイルスやDABを扱うことは、非常に危険であり、滅菌などの予防措置が取られる可能性があることを忘れないでください。

10%漂白剤溶液を使用してPRVまたはDABと接触したすべての材料。この手順を実行する際には、施設の規制に従ってバイオハザードの固体および液体廃棄物を適切に処分する必要があります。