Name: 大規模なSNPジェノタイピングアプリケーション用インフィニウムアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-19T14:10:00.000+00:00
Duration: 13 min 33 s
Description: 学ぶIllumina Infiniumアッセイを用いた大規模SNPジェノタイピングプロトコル。DNA増幅、ハイブリダイゼーション、ビーズチップスキャンにより、数百サンプルの遺伝子型を3日間で正確に解析する方法を解説します。

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</ol>

この記事の著者は、開示することなく、競合する金融利害関係はありません。

大規模な遺伝子型決定アプリケーションは、より良好な多くのヒト疾患の根底にある遺伝的機構を理解するために使用されてきた。ゲノムワイド関連解析を介して任意の大幅な改変体の発見は、さらなる研究のための候補領域にフラグをすることができます。また、遺伝子型データは、配列決定プロジェクトでの品質管理のための優れたツールです。 サンプルスループットを最大化するために、複数のサンプルプレートを増幅し、その断片化され、再懸濁させた状態で保存することができる。 8枚のプレートには、複数のバッチのためのプロトコルの最初の24時間を組み合わせるとチップの処理〜2-8日間、十分な材料を提供し、一日で増幅することができる。増幅されたプレートをあらかじめ備蓄している場合は、新たなサンプルがスキャンは前回の実行から始まり直後にチップにハイブリダイズされる場合には、処理は追加のサンプル調製のために一時停止することなく、継続的に実行することができます。そのため、サンプルが完全に受けることが3日かかるでしょうがアッセイは、データは、毎日生成することができる。 Assuming24チップは毎​​日処理され、5日制は、12サンプルのビーズチップ上で実行される1,000以上のDNAサンプルを可能にします。いずれかのステップまたは試薬が失敗した場合は任意の補正を適用する前に、しかし、複数のバッチは、パフォーマンスの低下のリスクがあるかもしれません。配列がスキャンまたは分析されるまで、エラーが通知を免れるかもしれません。スループットが最大化されている場合、したがって、プロトコルの様々な段階におけるサンプルの数百人は、すでに発見に同じ欠陥の治療を受けている可能性があります。失われた試薬およびデータを復元することはできませんように、ユーザは、加速されたワークフローの必要性と、これらのリスクを比較検討する必要があります。 GenomeStudio解析ソフトウェアは、本当に遺伝子型判定プロセスの成功を測定する最初のチャンスである。 NORM-シータ強度プロット対NORM-Rが適切にクラスタ化されている場合、この値はSLI異なるが、サンプルの平均コールレートは、（全体のSNPの割合が正常に入力された）、99％に近づく必要がありますghtlyアレイタイプに応じ。 85から90パーセントよりも低いコールレートとの任意のサンプルからのデータが信頼できるものではなく、廃棄されるべきである。品質管理の目的のために、結果は、以前に知られている遺伝子型、可能な限りと比較すべきである。そのようなデータが存在しない場合は、意図的なサンプルの複製は、プレートまたはアレイの配置を確認するのに有用なツールである。これらの重複したペアは別個のチップ、プレート、バッチ、またはプロジェクトに配置する必要があり、その遺伝子型は生成時にチェックした。具体的な品質管理の制約が調査者の好みに応じて異なるが一般的なサンプル制約はコールレート、メンデルの矛盾、あるいは相互参照に基づいていますが、一般的なSNP制約は、症例と対照の間でサンプル呼出成功、ハーディ·ワインベルグ平衡、または欠測に基づいています臨床性別データへのX染色体のヘテロ接合性の[13]。 何らかの問題が発生した場合、分析スイートで見つかったコントロールダッシュボードは、、に提出することができます原因を特定するために、会社。これらのコントロールは、多くの場合、最有力ステップまたは試薬障害のために問題を絞り込むことができます。興味のある任意のSNPはインフィニウムジェノタイピング実験により発見された場合、さらなる研究が行われる前に、その強度プロットは、クラスタリングエラーをGenomeStudioをダブルチェックする必要があります。 失敗したのInfiniumジェノタイピング実験は、人間の処理エラーや低品質の投入DNAに起因する可能性が高い。サンプル定量化は、正確かつ精密である必要があります。最良の結果を得るには、任意のサンプルまたはチップに追加された試薬は、プロトコルが設定した音量で分配されなければなりません。ピペットは、適切に校正する必要があります。試薬が満了した後に実行すべきではないとRA1試薬保存、解凍した一回再凍結すべきではありません。可能な染色および伸長誤差を最小にするために、ホルムアミド/ EDTA混合物を毎月新たに調製すべきである。すべて-20℃の試薬は、手動霜取り冷凍庫に保管してください。 STで使用されるすべての実験器具aining、プロトコルの拡張、および洗浄の部分はすぐに廃止すると水と中性洗剤で十分に洗い流してください。 HYB室内の加湿貯水池を試験管ブラシと中性洗剤でこすりする必要があります。週に一度、自分のユーザーマニュアルの指示に従って、ガラススライドは、10％の漂白剤で洗浄する必要があります。

一塩基多型（SNP）を入力すると、疾患に関連するリスク変異体を同定する重要な方法である。歴史的に、遺伝子型決定実験の範囲は、利用可能な技術によって制限されてきた。ゲル電気泳動に基づく遺伝子型決定方法は、サンプルSNPスループットが制限されている[1]。これらのアッセイの開発は、多くの場合、最適化のためのバリアントを囲む領域のメイクや構造に依存する、労働集約的であることができます[1]。ライフテクノロジーズが開発したTaqManジェノタイピングアッセイは、すぐに大量のサンプルを実行し、最小限の技術者の関与と[2]が、SNP多重化の制限は一日だけでなく下に百万に遺伝子型の総数を制限し続けることができます[3,4 ]。未満百SNPが一緒に多重化することができるようにシーケノムのIPLEXプラットフォームはまた、一度に多くのサンプルを実行することができますが、スループットが全体的に比較的低い[5]。ベックマン·コールターのSNPストリーム技術理論的には一日あたり300万人以上の遺伝子型を生産するが、反応あたりわずか四〇から八SNPの最大化するためにこの技術を制限し、プロジェクトの範囲[4,6]ことができます。 GoldenGateのアッセイは、サンプルあたりのSNP数百または数千に毎日ほぼ200 DNAサンプルを処理することができますが、遺伝子型あたりの価格は、高度な、超高スループット技術と競合しないで、一度に3000以上のSNPを入力するときに[4,7 ]。一日あたり数百万の遺伝子型を処理するために、大規模なゲノムワイド関連研究のために必要なスケールは、アレイハイブリダイゼーションアッセイは、市場で最もコスト効率の良い選択肢となっている。 ハイブリダイゼーションアレイのAffymetrix社のラインとのInfiniumベースのアレイのイルミナのラインは、サンプルの潜在的に何百ものパラレル[4,8]内のSNPの数千または数百万、数百で入力することができます。これらのSNPは、元のように利益の地域でローカライズさ、ゲノム全体に散在することができますomes、またはユーザの好みに合わせてカスタマイズ。これらのアレイは、正確に一度試料100万のSNPの遺伝子型を決定することが、また、潜在的に発表染色体異常をコピー数の変化を測定することができない唯一の利点を有する。インフィニウムアラインOMNIビーズチップアレイは現在、毎日ほぼ百サンプルまでに50万カスタム座を含むサンプルあたりほぼ500万マーカーまでの遺伝子型と能力を持っている。 ほとんどの疾患は遺伝的要素を持っているように、これらの大規模な実験は、疾患に関連する遺伝子を発見する上で重要であることができる。ハイスループット遺伝子型決定は、試料中の効率的な遺伝子型生成を可能にする説得力の低いマイナーアレル頻度で遺伝的関連を検出するのに十分な大きさに設定する。全ゲノムジェノタイピングプロジェクトは、統計的に有意な症例対照対立遺伝子頻度やコピー数の違いで領域を特定するために使用することができる[9,10,11]。国家人権のGeによると、ノーム研究所は、ゲノムワイド関連研究は、P-1未満の値×10 -5で8283個のSNPの発見に端を発する、2008年11月25日およ ​​び2013年1月25日の間で1490の別々の出版につながった（http://を参照してくださいwww.genome.gov/gwastudies/）。高さから精巣癌に至るまでの条件を調査し、これらの研究は、ゲノムワイドな解析によってもたらされる幅広いアプローチから恩恵を受けた。タイピングの範囲が厳しすぎるされていたこのような場合には、対象となる全領域は、予告を免れた可能性があります。したがって、大規模なアソシエーション分析のため、ゲノムワイドな遺伝子型決定技術は、選択された技術である。 のInfiniumアッセイの異なるバージョンは、それぞれが特定のタイプのアレイで使用するためのものが存在する。または24サンプルアレイチップ - 以下に詳しく説明InfiniumUltraアッセイは、多くの12に適している。これらは多くの場合、DNAサンプルあたりの10万以上のSNPを遺伝子型とTに焦点このようなexomeやカスタムパネルのようargeted地域。他のアッセイのバージョンでは、全ゲノムジェノタイピングアレイのような他のチップタイプのために必要になることがあります。すべてのインフィニウムアッセイは共通の基盤を共有し、主に試薬名、試薬容量、または正確な染色試薬手順のみが異なるしかし、1アッセイのバージョンに完成の技術は、多くの場合、普遍的に適用することができます。このようなメチル化アレイのような他の配列は、だけでなく、ほぼ同一のプロトコルを使用する場合があります。お手入れは、使用中のチップタイプに必要なアッセイのバージョンを使用するように注意しなければならない。このような遺伝子発現レベルを測定するものなど、いくつかのタイプは、nonInfiniumプロトコルの使用を必要とする場合があります。 サンプルは、バッチで処理しなければならない。例えば、InfiniumUltraアッセイで、プレハイブリダイゼーション試薬チューブは、96のサンプルを実行するのに十分な量が含まれており、チューブが再凍結することはできません。そのため、サンプルは一度に96サンプルのバッチで実行する必要があります。サンプルはモミ上で増幅されますTの日。ベンチワークの約1時間後、サンプルを20〜24時間、対流式オーブン内で加熱しなければならない。次の日、ほぼ4時間で沈殿させること、断片化過ごし、サンプルはいずれの将来の使用のために凍結またはチップにハイブリダイズさせることができる、その時点でサンプルを再懸濁します。チップをロードすると、サンプルは16〜24時間、一晩ハイブリダイズされるまでの、ほぼ2時間かかります。三日目に、染色および拡張手順は、〜4時間かかります。さらに1時間の洗浄、コーティング過ごし、チップを乾燥されます。最後に、配列は使用されるタイプに応じて、15〜60分/チップからかかることがあり、スキャンされます。 標準的な実験室の安全性と清潔予防措置が適用されます。増幅はPCRベースないが、前およびpostamplification手順のための別個のワークステーションは、汚染の可能性を最小限にするために必要である。使用されているすべてのキットが提供する試薬の識別番号は、追跡シートにログインする必要があります。レアージュ国税庁は、使用直前に解凍し、分配する前に数回反転する必要があります。タイプされるDNAは、高品質のゲノムDNA（280分の260 1.6〜2.0の吸光度比、230分の260以下の3.0の吸光度比）、標準的な方法で単離し、蛍光光度計で定量化しなければならない。 DNAの分解は、多くの場合、低品質のアッセイ結果における寄与因子である。この量は、いくつかのチップの種類によって異なる場合がありますが、通常、DNAの200 ngの、必要とされている。テカンの液体処理ロボットはプロトコルの多くのステップを自動化し、要素として、ヒューマンエラーを最小限に抑えることができます。

<table><tbody><tr><td><強力>消耗品または機器</強力></td><td><強力>メーカー</強力></td><td><強力>部品番号</強力></td><td><強>最小96サンプル</強力></td></tr><tr><td>0.8mlのディープウェルプレート</td><td>に</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>必要<tr><td></td><td>最小Scientific</td><td>13-681-502</td><td>9</td></tr>ヒート<tr><td>シールシート</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0559</td><td>1</td></tr><tr><td>フロースルースペーサー</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9563984</td><td>6</td></tr><tr><td>ピペットチップ - 200 &mu;l</td><td>レイニン</td><td>GP-L200F</td><td>192</td></tr><tr><td>ピペットチップ - 10 &mu;l</td><td>レイニン</td><td>GP-L10F</td><td>16</td></tr><tr><td>ピペットチップ - 1,000 &mu;l</td><td>レイニン</td><td>GP-L1000F</td><td>16</td></tr><tr><td>DNA 懸濁液バッファー</td><td>Teknova</td><td>T0220</td><td>0.5 ml</td></tr><tr><td>0.1 N NaOH</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>AC12419-0010</td><td>0.5 ml</td></tr><tr><td>イソプロパノール (HPLC グレード)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A451</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>エタノール (200 プルーフ)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>459836</td><td>330 ml</td></tr><tr><td>ホルムアミド (100%)</td> <td>トーマス・サイエンティフィック</td><td>C001K38</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>EDTA (0.5 M)</td><td>Amresco</td><td>E177</td><td>0.2 ml</td></tr><tr><td>10 &mu;l 8チャンネルピペット</td><td>レイニン</td><td>L8-10XLS</td><td>1</td></tr><tr><td>200 &mu;l 8チャンネルピペット</td><td>レイニン</td><td>L8-200XLS</td><td>2</td></tr><tr><td>1,000 &mu;l シングルチャンネルピペット</td><td>レイニン</td><td>L-1000XLS</td><td></td></tr><tr><td>1 マイクロプレートシェーカー</td><td>VWR</td><td>13500-890</td><td>1</td></tr><tr><td>冷蔵マイクロプレート遠心分離機</td><td>VWR</td><td>BK369434</td><td>1</td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションオーブン</td><td>イルミナ</td><td>SE-901-1001</td><td>1</td></tr><tr><td>ハイベックスマイクロサンプルインキュベーター</td><td>SciGene</td><td>1057-30-0</td><td>1</td></tr><tr><td>ハイベックス MIDI ヒートブロックインサート</td><td>イルミナ</td><td>BD-60-601</td><td></td></tr><tr><td>1 ヒートシーラー</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>AB-0384</td><td>1</td></tr><tr><td>ハイブチャンバー インサート&マット付</td><td>イルミナ</td><td>BD-60-402</td><td>2</td></tr><tr><td>手術用ハサミ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-804-20</td><td>1</td></tr><tr><td>フロースルー 組立部品</td><td>イルミナ</td><td>WG-10-202</td><td>8</td></tr><tr><td>ウォッシュラック&ディッシュ</td><td>イルミナ</td><td>BD-60-450</td><td>1</td></tr><tr><td>Genepaint チャンバーラック</td><td>Tecan</td><td>760-800</td><td>1</td></tr><tr><td>温度プローブ</td><td>イルミナ</td><td>A1-99-109</td><td>1</td></tr><tr><td>染色ラックとディッシュ</td><td>イルミナ</td><td>WG-10-207</td><td>1</td></tr><tr><td>自己閉鎖ピンセット</td><td>テッド・ペラ社</td><td>5374-NM</td><td>1</td></tr><tr><td>真空マニホールド</td><td>テッド・ペラ社</td><td>2240</td><td>1</td></tr><tr><td>iScanまたはHiScan</td><td>イルミナ</td><td>-</td><td>1</td></tr></tbody></table>

大規模なsnpジェノタイピングアプリケーション用インフィニウムアッセイ

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

ヒトゲノムにおける遺伝子型決定の変異体は、表現型と遺伝的関連を同定する効率的な方法であることが証明された。家族又は集団内の変異の分布は、疾患の遺伝因子の同定を容易にすることができる。遺伝子型決定BeadChip製品のイルミナのパネルは、研究者は、一塩基多型（SNP）の数千または数百万の遺伝子型を決定するか、またはそのようなコピー数のような他のゲノムの変異体を分析するために、DNAの多数のサンプルにわたって可能にする。これらのSNPは、ゲノム全体に広がるか、潜在的な発見を最大化するために、特定の領域に標的とすることができる。のInfiniumアッセイは、迅速に、高品質で正確な結果を得るために最適化されている。適切なセットアップを使用すると、単一の技術者は、アレイの種類に応じて、週に1000人以上のDNAサンプルには数百から処理することができます。このアッセイは、ゲノムDNAから開始して、アレイのスキャンで終わる、すべてのステップを使用してユーザーをガイドします。適否レアージュを使用してNTSは、サンプルが増幅され、断片化し、沈殿した再懸濁し、染色された単一の塩基により拡張チップにハイブリダイズされ、のiScanまたはハイスキャン高分解能光学イメージングシステムのいずれかでスキャン。一晩のステップは、DNAを増幅するために必要とされている。 DNAを変性し、等温的に全ゲノム増幅によって増幅され、従って、全くPCRは必要とされない。試料は、第一晩ステップ中にアレイにハイブリダイズされる。 3日目までに、サンプルがスキャンされ、分析される準備ができている。増幅されたDNAは、ビーズアレイ、それにより、スループットを最大化する、毎日を処理することができ、大量に貯蔵されてもよい。

スキャンしながら、適切に処理されたビーズチップは明るく明瞭な赤と緑のレーザー光強度を表示する必要があります。 図6では、のiScanスキャンソフトウェアが正常カスタムパネルのSNPジェノタイピングアレイにハイブリダイズ標準ゲノムDNAサンプルが表示されます。延長および染色工程の間、付着させた標識ヌクレオチドは、2つのレーザの光の下に蛍光を発する。これらのヌクレオチドは、選択的に断片化したDNA鎖にハイブリダイズしたビーズのオリゴヌクレオチド鎖を延長し、オリゴヌクレオチド鎖が変異の部位で終端するように設計されているように、得られた信号の色及び強度は、存在する対立遺伝子を決定するために使用することができるようにSNP部位。 会社から直接得CHIPIDと位置に、サンプルIDと臨床情報と一致するユーザが生成したサンプルシート、およびアレイ固有のSNPマニフェストは、SCAをインポートするために、両方の必要なGenomeStudio解析ソフトウェアへのnner出力ファイル。例のサンプルシートは、同社のウェブサイトに掲載されています。 GenomeStudioプロジェクトが構築されると、遺伝子型はソフトウェアによって自動的に生成された結果の強度クラスタから取得することができます。複数の表示オプションが存在しますが、デフォルトのビュー、NORM-シータ（対立遺伝子の強度比）対ノーム-R（正規化された強度値）は、多くの場合、三つの異なるクラスタを区別するための最も簡単なプロットである。大部分のSNPは、マイナーアレル頻度に応じて、1つ、2つ、または3つのクラスターを示すべきである。 3クラスタは（ 図7を参照）、AA、AB、またはBBの対立遺伝子を実証するサンプルを表す。これらのクラスタは、ソフトウェアの分析ツールバーから「すべてのSNPをクラスタ化」を選択することにより、会社から直接、標準的なクラスタリング位置テンプレートをインポートすることによって、またはクリックして手動でEDI強度プロット上で色付きの円をドラッグしてどちらかの遺伝子型を割り当てることができます<html> T·コール。 （赤、紫、青）強度プロット上のサンプルの色はコール（AA、ABまたはBBのそれぞれ）を示し、黒はコールがないことを示します。ソフトウェアのフルデータペインにリストされているのSNPをスクロールすることにより、各SNPのためのクラスタリングは、表示または呼び出すことができます。クラスタは、満足の呼び出しを割り当てられると、ソフトウェアのフルデータペインには、各々の特定のSNPにおける各々のサンプルのための遺伝子型を示しています。テーブルの上の列の選択オプションは、データ形式を切り替えることができます。 データは、詳細な分析のための分析ツールバーを介して、または直接フルデータテーブルのいずれかからエクスポートできます。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig1.jpg" width="600px" /> 図1。概要-インフィニウムアッセイプロトコル。683/50683fig1highres.jpg &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt;拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig2.jpg" width="600px" /> 図2。完全Hybをチャンバーベースとマットに加え、蓋[12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig2highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig3.jpg" width="600px" /> 図3ビーズチップのロード-入口ポート上のサンプルを分注[12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig3highres.jpg" target="_blank">で拡大表示するには、ここをクリックしてください</a><html>画像。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig4.jpg" width="600px" /> 図4ビーズチップCoversealの削除 - 。コーナーでシールをつかみ、ゆっくりと斜めに剥離[12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig4highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig5.jpg" width="600px" /> 図5。完全なビーズチップフロースルーアセンブリ -ビーズチップは、スペーサを用いてガラススライドから分離し、留め金でバインドされている。&gt;拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。 <img alt="図6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig6.jpg" width="600px" /> 図6。成功したビーズチップスキャン - A）ビーズチップの両方赤と緑のレーザーでスキャンされ、スキャンソフトウェアの両方を同時に表示します。強度QCを渡すのセクションでは、左にビーズチップのディスプレイに緑の強調表示されます。強度QCを失敗のセクションでは、ビーズチップのディスプレイに赤くハイライト表示されます。B）のスキャンが完了すると、ソフトウェアは、赤と緑のディスプレイをオーバーレイします。ズームインした画像が表示されます。個々のビーズの色と強度はアレル存在を示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig6highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <p class="jove_content" fo:keep-together.wi薄ページ= &quot;常に&quot;&gt; <img alt="図7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig7.jpg" width="500px" /> 図7。 NORM-θクラスタのプロファイル対SNP NORM-R - AA AB、およびBB遺伝子型、赤、紫、青、B色）のSNPが必要な編集を表す3つの異なるクラスタとA）有効なSNP。ホモ接合ABであるべきミドルクラスタは、国連と呼ば残っている。 BBクラスタが誤ってA-B、C）悪いパフォーマンスのSNPと呼ばれています。明確なクラスターが存在しないように何の遺伝子型は、この強度プロットから得ることができない。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig7highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。

プロトコルは、大規模な遺伝子型決定を行うためにイルミナインフィニウムアッセイを使用することが記載されている。これらのアッセイは、確実に3日間で、個々のDNAサンプルの数百人を越えSNPの何百万人の遺伝子型を決定することができます。一度生成された、これらの遺伝子型は異なる疾患または表現型の様々な関連性をチェックするために使用することができる。

大規模なSNPジェノタイピングアプリケーション用インフィニウムアッセイ

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

本手順の全体的な目的は、Infiniumアッセイを用いてジェノタイピングビーズチップの処理を正常に完了させることです。まず、DNAの増幅、断片化、および単離を行います。次に、変性させたDNAストランドを、アレイ上のビーズに結合したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせます。次に、ビーズに結合したオリゴヌクレオチドを染色し、1塩基を選択的に伸長させます。最終ステップとして、ビーズチップをスキャンしてラベル化されたヌクレオチドを検出します。最終的に、ジェノタイプの結果を用いて、目的部位に存在するアレルを決定します。ミツバチ用チップの染色およびロードにおける多くの手順は習得が困難であるため、本手法の視覚的なデモンストレーションが不可欠です。多くの操作は他のジェノタイピング法には見られず、また多くの装置が非常に似た名称を持っています。増幅の前日にDNAを調製し、ディープウェル96検体プレートの各ウェルに200 nanogramsのDNAを分注します。試薬の無駄をなくすため、少なくとも96つのサンプルをプレートに分注する必要があります。キットに付属のバーコードステッカーでプレートにラベルを貼り、遠心分離して液量を均一にします。その後、サンプルをドロワーまたはドラフトチャンバー内に一晩放置し、液体を蒸発させます。翌朝まで埃が入らないよう、プレートを蓋またはペーパータオルで軽く覆っておきます。ウェルが乾燥していることを確認し、試薬リザーバーと10 µL 8チャンネルピペットを用いて、各ウェルに4 µLのDNA Resus bufferを分注し、サンプルを再懸濁させます。液体に触れないよう注意すれば、各列の間でピペットチップを交換する必要はありません。次に、8チャンネルピペットと新しい試薬リザーバーを使用して、プレートの各ウェルに20 µLのMA one試薬を分注します。プレートを再利用可能なシールで密閉し、パルス遠心分離後、マイクロプレートシェーカーを用いて1600 RPMで1分間ボルテックスし、室温で少なくとも30分間インキュベートします。増幅に関する以降の手順はこのビデオでは示しませんが、プロトコルの詳細は付属の論文で確認できます。すべての試薬を添加した後、適切に校正された37°Cに設定されたオーブンにプレートを20～24時間置きます。増幅後、DNAサンプルを原稿の記載に従って断片化し、高速遠心機で沈殿させます。プレートを反転させずに底面を確認してください。サンプルが青色のペレットとして沈殿していることを確認し、蓋を廃棄して、プレートを反転させ、ペーパータオルを敷いたベンチトップに強く叩きつけることで速やかに液体を除去します。一度プレートを反転させたら、元の向きに戻さないように注意してください。液体が残っている間は、すべての液体が除去されるまで、プレートを繰り返しベンチトップに叩きつけてください。プレートを試験管ラックの上に逆さまに置き、室温で1時間乾式インキュベートします。その後、ハイブリダイゼーションの手順を開始するためにDNAを再懸濁します。再懸濁したDNAを含む96ウェルプレートをヒートブロックに置き、95 °Cで20分間加熱します。20分後にDNAを変性させるため、サンプルプレートをヒートブロックから取り出し、室温で30分間インキュベートします。サンプルプレートが冷却されている間に、ハイブチャンバーを準備します。処理するビーチップ4枚につき、1つのチャンバーが必要になります。ハイブチャンバーベースの上面にラバーマットを置き、厚い穴をベースの前方に合わせます。ベースに刻印されたバーコード記号がまだ見えていることを確認してください。1000 µL ピペットを使用して、ベースに設けられた8つの加湿リザーバーに PB two 試薬を 400 µL ずつ分注します。ベースに hi チャンバー蓋を載せ、対角線上の両端に2つのクラスプを取り付けて固定してください。まず、30分の冷却が完了する直前に、使用するHi chamberごとに4つのHi chamberインサートをベンチ上に配置します。シルバービーズチップパックを開封します。ビーズに触れないように、チップを透明なプラスチックスリーブから取り出します。各ビーチップをhiチャンバーインサートの上に配置します。チップのバーコードを、インサートの上面に刻印されたバーコード記号に合わせて方向を調整してください。次のステップであるビーチップへのローディングは、本プロトコルにおいて最も重要な工程である可能性があります。正しく行うには、DNAプレートからビーチップへのサンプル転送をあらかじめ視覚的にイメージしておく必要があります。サンプルプレートの蓋を剥がして廃棄します。チップへの液分注にはマルチチャンネルピペットを使用できますが、プレートの行数とチップの行数が常に一致するとは限らないため、ビーチップに安全に配置できるサンプル数のみを吸引するように十分に注意してください。サンプルプレートから15 µLのサンプルを採取し、アレイの入口にゆっくりと分注します。ビーズチップと一致する正しい位置の正しいビーズチップに、正しいサンプルを配置するよう細心の注意を払ってください。順序は事前に記録したものに従います。hiveチャンバーを開き、加湿リザーバーの上にインサートを配置します。チップのバーコードを、hiveチャンバー底面のバーコード刻印に合わせて配置してください。hiveチャンバーのカバーを戻し、対角線上のクラスプから順に、4つのクラスプすべてを閉じて固定します。まず、ハイブリダイゼーション完了後、hiチャンバーを48 °Cのオーブンで16〜24時間インキュベートします。その後、hiチャンバーをオーブンから取り出し、室温で25分間インキュベートして冷却します。hiチャンバーが冷却されたら、1つのhiチャンバーを開けます。beeチップのカバーシールの一角をつかみ、斜め方向にゆっくりと剥がして取り除きます。シールを剥がしたら、直ちにチップをビーチップトレーに載せ、ビーズに触れないようにPB oneに浸します。トレーがビーズチップでいっぱいになるまでこれを繰り返します。その際、どのチップも乾燥させないように注意してください。トレイを静かに揺らして気泡を取り除き、チップを1分間浸漬させます。再度トレイを揺らします。ビーチップのトレイを、PB.Oneを満たした2つ目の洗浄皿に移します。静かに揺らし、1分間洗浄させます。次に、液体フロースルーアセンブリステーション内で再度撹拌します。4つの黒色プラスチック製フロースルーブレースを溝に配置します。液体が8つのアセンブリブラケットの高さにほぼ達するまで、PBを1回ずつステーションに満たします。ビーズチップをトレイから取り出し、プラスチック製のフロースルーブレースの上に載せてアセンブリーステーションに配置します。この際、チップのバーコードがアセンブリーステーションに刻印されたバーコード記号の上に揃うようにしてください。4つのチップをアセンブリーステーションに配置したら、各ビーズチップの上に透明なプラスチックスペーサーを置きます。スペーサーの外縁がアセンブリーステーション内のブラケットを囲むように配置してください。プラスチック製アセンブリバーを、溝に合わせてアセンブリステーションに設置します。スライドの背面端をアセンブリバーに押し当て、前面をゆっくりと液体の中に下ろすことで、プラスチックスペーサーの上にガラススライドをそっと置きます。スライド上部の溝がチップのバーコードの真上で下を向くようにし、バーコード端においてbeeチップとスライドの間に隙間を設けます。チップとスライドの間に気泡がないことを確認した後、2つの金属製クラスプをガラスの周囲にスナップして固定します。1つをバーコード側へ、もう1つを後方へスライドさせます。プラスチック製クラスプのエッジで、チップの下にあるプラスチック製フロースルーブレースを固定してください。この図は、完全なフロースルーアセンブリの構成図を示しています。すべてのビーズがフロースルーアセンブリ内に配置されたら、外科用ハサミを用いて、スペーサーの両端をガラススライドにできるだけ近い位置で切断します。チャンバーラックが44度に達したら、bee chipフロースルーアセンブリを下にスライドさせ、上部の固定具を引っ掛けてチャンバーラックに設置し、この手順を開始してください。bee chipの背面がチャンバーラックに接している必要があります。ガラススライドを外側に向かせ、溝を上にすることで試薬リザーバーを形成させます。すべてのbeeチップアセンブリをチャンバーラックに配置した後、200 µLピペットを使用して、フロースルーアセンブリに150 µLのRA one試薬を加えます。液体をガラスリザーバーに分注することで、試薬は自然にスライドを流れ落ちてアセンブリの底部から流出し、以降の試薬をリザーバーに直接注入することが可能になります。伸長部分の染色の残りの手順はここでは示しません。染色および伸長の完了後は、付随する論文のプロトコルを参照してください。クラスプとブレースの間に細い金属棒を挿入し、フロースルーアセンブリを分解します。次に、ピボット操作を行います。ガラススライドを脇に置き、ビーチップをすぐに取り出します。ビーチップを垂直のビーチップトレーに配置し、PB1に浸します。これをすべてのフロースルーアセンブリで繰り返します。その際、各ビーチップをすべて同じ方向に向かせ、空気への露出を最小限に抑えるように注意してください。その後、この手順を完了します。付属テキストのプロトコルに従えば、適切に処理されたビーチップをスキャンした際、伸長および染色ステップで付着した標識ヌクレオチドが2つのレーザー光の下で蛍光を発するため、明るく鮮明な赤色および緑色のレーザー光強度が表示されるはずです。ここでは、カスタムパネルSNPジェノタイピングアレイのセクションにおける強度パスに成功した、標準的なゲノムDNAサンプルのハイブリダイゼーション結果を示しています。QCが成功すると、左側のビーチップディスプレイ上のセクションが緑色に点灯します。強度が不足している場合、QCはビーチップディスプレイ上で赤色に点灯します。スキャンが完了すると、赤と緑のディスプレイがオーバーレイされます。ここでは拡大画像を示していますが、これらのヌクレオチドが、断片化されたDNA鎖にハイブリダイズしたビーズ上のオリゴヌクレオチド鎖を選択的に伸長させています。ヌクレオチド鎖はバリアントの部位で停止するように設計されているため、得られたシグナルの色と強度によって、SNP部位に存在するアレルを判定できます。スキャナーの出力ファイルをGenome Studio Analysisソフトウェアにインポートし、クラスタープロファイルを生成します。これは、赤、紫、青でそれぞれ色分けされたaa、A、B、およびB, B遺伝子型を表す3つの明確なクラスターを持つ、有効なSNPの例です。この強度プロットは、ホモ接合体であるべき中央の黒いクラスターの編集が必要であったSNPを示しています。ABは判定されませんでした。BBクラスターが誤ってabと判定されています。最後の強度プロットは、性能の低いSNPを示しています。明確なクラスターが存在しないため、この強度プロットからジェノタイプを得ることはできません。この手順を行う際は、ビーチップを迅速に処理することが重要です。長時間空気にさらさないようにしてください。

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