大規模なSNPジェノタイピングアプリケーション用インフィニウムアッセイ

この手順の全体的な目標は、ジェノタイピングビーズチップを処理するためにInfiniumアッセイを成功裏に使用することです。これは、最初にDNAを増幅、断片化、および単離することによって達成されます。第2のステップは、変性したDNA鎖をアレイ上のビーズに結合したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることです。

次に、ビーズに結合したオリゴヌクレオチドを染色し、1塩基だけ選択的に伸長させます。最後のステップは、ビーズチップをスキャンして、標識されたヌクレオチドを検出することです。最終的に、遺伝子型の結果は、目的の部位に存在する対立遺伝子を決定するために使用されます。

この方法の視覚的なデモンストレーションは、ミツバチチップの染色とロードのステップの多くを学ぶのが難しいため、非常に重要です。マニューバーの多くは他のジェノタイピング法には見られず、多くの機器は非常によく似た響きの名前を共有しています。増幅の1日前に、DNAを調製し、ウェルあたり200ナノグラムのDNAをディープウェル96サンプルプレートに分注します。

試薬が無駄にならないように、少なくとも96個のサンプルを播種する必要があります。キットに付属のバーコードステッカーでプレートにラベルを付け、遠心分離して容量を正規化します。サンプルを引き出しまたはドラフトに一晩置いて、液体を蒸発させます。

プレートを蓋またはペーパータオルでゆるく覆い、翌朝のほこりを防ぎます。ウェルが乾燥したユーザー試薬ベイスンと10マイクロリットルの8チャンネルピペットで、4マイクロリットルのDNA Resusバッファーを各ウェルに分注してサンプルを再水和していることを確認します。液体に触れないように注意すれば、各カラム間でピペットチップを捨てる必要はありません。

次に、8チャンネルピペットと新鮮な試薬ベイスンを使用して、20マイクロリットルのMA 1試薬をプレートの各ウェルに分注します。再利用可能なシール、パルス遠心分離機、および渦で1600 RPMでプレートを覆い、室温で少なくとも30分間インキュベートするマイクロプレートシェーカーで1分間。増幅の残りのステップはこのビデオでは示されていませんが、プロトコルは添付の原稿に記載されています。

すべての試薬を添加したら、プレートを摂氏37度に設定された適切に校正されたオーブンに20〜24時間置きます。増幅後、DNAサンプルは、高速遠心分離機での沈殿後、原稿に記載されているように断片化および沈殿します。プレートの底面を反転させずに点検します。

サンプルが青色のペレットに沈殿したことを確認するには、蓋を捨て、プレートを反転させ、ペーパータオルで覆われたベンチトップに強く叩いて液体をすばやく取り除きます。プレートが反転したら、元に戻さないように注意してください。液体が繰り返し残っている間、すべての液体が除去されるまでプレートをベンチトップに軽くたたきます。

プレートを逆さまにした試験管ラックにセットし、室温で1時間ドライインキュベートします。続いて、DNAを再懸濁してハイブリダイゼーション手順を開始します。再懸濁されたDNAを含む96ウェルプレートを、摂氏95度のヒートブロックに20分間置きます。

20分後にDNAを変性させるには、サンプルプレートをヒートブロックから取り出し、サンプルプレートが冷却されている間に室温で30分間インキュベートし、ハイブチャンバーを準備します。処理された4つのビーチップごとに1つのチャンバーが必要になります。ハイブチャンバーベースの上部にゴムマットを置き、厚い穴をベースの前面に合わせます。

ベースにエッチングされたバーコード記号は、まだ表示されているはずです。1000マイクロリットルのピペットを使用して、ベースに刻まれた8つの加湿リザーバーのそれぞれに400マイクロリットルのPB2試薬を分注します。ハイチャンバーの蓋をベースに置き、斜めに反対側に2つの留め金を配置して両端を留めます。

まず、30分が終了する直前に使用した各hiチャンバーのベンチに4つのHiチャンバーインサートを置きます。冷える。シルバービーズチップパックを開けます。

ビーズに触れずに、透明なプラスチックスリーブからチップを取り出します。各ビーチップをハイチャンバーインサートに置きます。チップの上面にバーコード記号がエッチングされた状態でチップバーコードの向きを合わせます。

次のステップであるビーチップのローディングは、プロトコルの最も重要なステップかもしれません。それを正しく行うには、DNAプレートからビーチップへのサンプル移動を事前に視覚化し、サンプルプレートの蓋を剥がして廃棄する必要があります。マルチチャンネルピペットを使用してチップ上に液体を分注することができますが、プレート上の列数がチップ上の列数と常に一致するとは限らないため、ミツバチチップ上に安全に配置できるサンプル数のみを吸引するために先見の明が必要です。

サンプルプレートから15マイクロリットルのサンプルを取り出し、インレットからアレイにゆっくりと分注します。正しいサンプルを正しいビーチップ上のビーズチップと一致する正しい位置に配置するには、細心の注意を払う必要があります。以前に記録された注文。

ハイチャンバーを開き、インサートを加湿リザーバーの上に置きます。チップのバーコードは、バーコードエッチングの上をハイブチャンバーベースに配置する必要があります。ハイブチャンバーカバーを元に戻し、斜めに反対側の留め金を閉じて、4つの留め金をすべて閉じます。

まず、ハイブリダイゼーションの完了時にhiチャンバーを48°Cのオーブンで16〜24時間インキュベートし、ハイチャンバーをオーブンから取り出し、室温で25分間インキュベートして冷却します。ハイチャンバーが冷えたら、1つのハイチャンバーを開きます。ビーチップからカバーシールをはがすには、シールの片方の角をつかみ、斜めにそっと剥がします。

シールを剥がしたら、すぐにチップをビーチップトレイに置き、ビーズに触れずにPBトレイに沈めます。トレイにビーズチップがいっぱいになるまで繰り返します。チップが乾かないように注意してください。

トレイを静かに攪拌して気泡を取り除き、チップを1分間沈めたままにします。トレイを再度攪拌します。ビーチップのトレイをPBで満たされた2番目の洗浄皿に移動します。1つは穏やかに攪拌し、1分間石鹸で洗う。

その後、組み立てステーションを通る液体の流れで再び攪拌します。溝に4つの黒いプラスチック製のフロースルーブレースを配置します。液体が一度に1つずつ8つのアセンブリブラケットの高さにほぼ達するまで、ステーションにPB1を充填します。

トレイからビーズチップを取り外し、ブレースを介してプラスチックフローでアセンブリステーションに配置すると、チップバーコードはアセンブリステーションにエッチングされたバーコード記号の上に位置合わせする必要があります。4つのチップが組み立てステーションに入ったら、各ビーズチップの上に透明なプラスチックスペーサーを置きます。スペーサーの外縁は、組み立てステーション内のブラケットを囲む必要があります。

プラスチック製のアセンブリバーを溝に取り付けて、アセンブリステーションに配置します。スライドの後端をアセンブリバーに押し付け、前面をゆっくりと液体に下げて、プラスチック製のスペーサーの上にガラススライドをそっと置きます。スライド上部の溝は、チップのバーコードの真上を下向きにし、ビーチップとバーコード端のスライドとの間に隙間を残します。

チップとスライドの間に気泡がないことを確認した後、ガラスの周りに2つの金属留め金をスナップします。1つをバーコードの端にスライドさせ、もう1つを後ろにスライドさせます。プラスチック製の留め金の端は、チップの下のブレースを通るプラスチックの流れをつかむ必要があります。

この図は、組立図の完全な流れを示しています。すべてのビーズがアセンブリを流れるようになったら、手術用ハサミを取り、スペーサーの両端をできるだけスライドガラスの近くで切り取ります チャンバーラックが44度になったら、この手順を開始します アセンブリを下にスライドさせ、ブレースを上部に引っ掛けて、チャンバーラックにビーチップフロースルーアセンブリを配置します。ビーチップの裏側がチャンバーラックに接触している必要があります。

スライドガラスは、試薬リザーバーを形成するために上部に溝があるように外側を向いている必要があります。すべてのビーチップアセンブリをチャンバーラックに配置したら、200マイクロリットルのピペットを使用して、150マイクロリットルのRA One試薬をフロースルーアセンブリに追加します。液体をガラスリザーバーに分注することにより、試薬は自然にスライドを流れ落ちてアセンブリの基部から出るため、将来の試薬を直接リザーバーに入れることができます。

エクステンションを染色するための残りのステップは示されていません。染色および伸長の完了時に添付の原稿のプロトコールを参照してください。留め金とブレースの間に細い金属バーを挿入して、アセンブリを通る流れを分解します。

次にピボットします。スライドガラスを脇に置き、ビーチップを取り外し、すぐにビーチップを垂直のビーチップトレイに置き、PB1に沈めます。各ミツバチチップが同じ方向を向くように注意し、空気への曝露を最小限に抑えます。

その後、この手順を完了します。添付のテキストのプロトコルによれば、適切に処理されたミツバチチップは、伸長および染色ステップ中に付着した標識ヌクレオチドが2つのレーザーの光の下で蛍光を発するため、スキャンすると明るく明瞭な赤と緑のレーザー光強度を示すはずです。ここに示されているのは、カスタムパネルSNPジェノタイピングアレイ切片にハイブリダイズされた標準的なゲノムDNAサンプルで、強度を通過させたものです。

QCは、左側のセクションのビーチップディスプレイで緑色に強調表示されます。インテンシティの低下。QCは、ビーチップディスプレイで赤く強調表示されます。

スキャンが完了すると、赤と緑のディスプレイがオーバーレイされます。これらのヌクレオチドが、断片化されたDNA鎖にハイブリダイズされたビーズオリゴヌクレオチド鎖を選択的に伸長させる様子を拡大表示した画像をここに示しています。また、ヌクレオチド鎖はバリアントの部位で終点するように設計されているため、結果として得られるシグナルの色と強度を使用して、SNP部位に存在する対立遺伝子を決定できます。

スキャナーの出力ファイルは、クラスタープロファイルを生成するGenome Studio Analysisソフトウェアにインポートされます。これは、aa、A、B、B、B、Bの遺伝子型がそれぞれ赤、紫、青に着色された3つの異なるクラスターを持つ有効なSNPの例です。この強度プロットは、ホモ接合であるはずの黒色中央クラスターの編集が必要だったSNPを示しています。

AB は呼び出されないままになります。BB クラスターは誤って ab と呼ばれます。最後の強度プロットは、パフォーマンスの低いSNPを示しています。

この強度プロットからは、明確なクラスターが存在しないため、遺伝子型を取得することはできません。この手順を試みるときは、ミツバチチップをすばやく処理することを覚えておくことが重要です。長時間空気にさらさないでください。