不定冠詞インビトロ準備

この手順の全体的な目標は、機能的に生存可能なニューロンとCLIAを成体マウスの筋腸神経叢から分離することです。これは、まず無菌細胞培養表面をポリリジンとラミニンでコーティングすることによって達成されます。2番目のステップは、腸管叢分離のための溶液と手術領域を準備することです。

次に、消化管を切除し、目的のセクションを分離して、縦方向の筋腸神経叢の準備を作成します。最後のステップは、コラゲナーゼとトリプシンでLMMPを順次消化し、続いて事前にコード化された細胞培養表面に細胞をプレーティングすることです。最終的には、電気生理学、免疫細胞化学、およびシングルセルPCRを使用して、腸管ニューロン、グリア、またはこれら2つの細胞タイプ間の相互作用の影響を研究することができます。

手順のデモンストレーションは、すべての研究室のポスドクフェローであるトリシャ・ハー・スミス博士であり、彼女を支援するのは、すべての研究室の博士号候補であるジョイ・ゴンベです。この技術が既存の技術よりも優れている点は、ニューロンとグリアが成体マウスに由来することです。これにより、遺伝子組み換え動物に由来する可能性のある完全に機能するニューロンとグリアが可能になります。

しかし、この方法では、ニューロンの電気的特性に関する洞察を得ることができます。また、免疫細胞化学、シングルセルPCR、リアルタイムカルシウムイメージングなど、他の方法論にも適用できます。この手順は、安楽死させたマウスを手術面の背側横臥に置くことから始めます。

次に、70%エタノールで腹部の皮膚をきれいにします。次に、鉗子で持ち上げ、ハサミで腹腔を開いて内部の消化器官を露出させます。その後、回腸の一部を持ち上げて、腸筋を明らかにします。

胃腸管を切除し、ハサミで腸間膜を切り取ります。次に、回腸と結腸をそっと取り除き、解きほぐします。全長の腸が解けた後、腸間膜を回腸と結腸から引っ張らないように注意してください。

胃の遠位と盲腸の近位にある腸を切開して回腸を取り除きます。この手順は、結腸を遠位から盲腸、肛門の近位まで切除することにより、結腸組織でも実行できます。次に、回腸を3つ以上の大きな部分にセクション化します。

すべての糞便が別の廃棄物容器に移されるまで、腸の部分を通してクレブ溶液を優しくこすります。クリーンセクションをクリーンとラベル付けされたクレブスの容器に入れ、回腸全体がクリーニングされるまで手順を繰り返します。LMMPを取り外すには、回腸を2〜4センチメートルの小さなセグメントに切ります。

その後、回腸の一部をプラスチックまたはガラスの棒に置きます。回腸はぴったりとフィットする必要がありますが、緩んだりぴんと張ったりしてはいけません。親指でチューブをロッドにそっと固定することにより、GI管がロッドの周りを回転するのを防ぎます。

次に、鉗子で消化管にまだ付着している腸間膜の断片をそっと取り除きます。その後、LMMPをその下にある円形筋から分離します。最初に、腸間膜がセグメントの上から下に付着した線全体に沿って鉗子の端を優しくこすります。

その後、縦筋にやさしく隙間を作ります。次に、ギャップの上部から隙間を縫った綿棒を使用して、縦筋が円形筋から分離し始めるまで非常に軽い圧力をかけながら、最も軽い水平ストロークを使用して、縦筋をそっと引き出します。これを、中間アタッチメントポイントに沿ってストリップ全体に沿って行います。

次に、GIチューブを上から下へ、そして戻して、GIチューブの周りを優しく動かします。縦筋が円筋からゆっくりと分離されるため、チューブの周りをずっと離れています。完了すると、LMMPは残りのGIチューブから自然に外れます。

次に、得られた縦筋の細いストリップをLMMPとラベル付けされたビーカーに入れ、この手順のすべてのセグメントに対して手順を繰り返します。リンス液をLMMPセグメントに注入し、消化液に入れます。次に、LMMPをハサミで細かく切り取ります。

次に、それらを60分間消化します。摂氏37度の水浴で、カーでやさしく泡立てられながらシェーカーで。消化が完了したら、細胞を356Gで8分間遠心分離し、摂氏4度に冷却して細胞を採取します。

その間に、1ミリリットルの温めた0.25%トリプシンと4ミリリットルの温めたHBSSを無菌の50ミリリットルの細胞培養チューブに加えることにより、細胞培養フードに0.05%トリプシン溶液を調製します。遠心分離後、上清を捨て、細胞ペレットを慎重に取り除き、5ミリリットルの0.05%トリン溶液を入れたきれいなチューブに入れます。次に、0.05%トリン溶液中で37°Cの水浴中で7分間振とうしながら細胞を消化し、10ミリリットルの冷たいリンス培地でトリンを中和します。

7分間のトリプシン処理後、細胞を356 gで8分間遠心分離します。その間に、滅菌されたTXメッシュのバランスセクションを滅菌した15ミリリットルの細胞培養チューブの上に置きます。遠心分離後、上清を廃棄し、細胞混合物を3ミリリットルでトリガーすることにより、細胞混合物を穏やかに再懸濁します。

完全なニューロンメディア。すべての変更は、気泡の発生を避けるために、NYXメッシュを介して細胞溶液をろ過し、15ミリリットルのクリーンな細胞培養チューブに入れます。細胞を356 gで8分間遠心分離して収集します。

その後、上澄み物を取り除いて捨てます。1200マイクロリットルの完全なニューロン培地に細胞を再懸濁します。次に、1ミリリットルのプラスチック製ピペットチップを使用して細胞を穏やかにtします。

気泡が発生しないように注意してください:ほとんどのチャンクが分解され、細胞が液体に懸濁されるまで、ピペットでゆっくりと穏やかにピペットします。次に、事前にコード化されたガラスカバースリップを含む12個のウェルのそれぞれに、750マイクロリットルの完全な培地を追加します。次に、定格細胞溶液100マイクロリットルを追加します。

細胞培養インキュベーターで37°Cの細胞培養インキュベーターでニューロンをインキュベートし、二酸化炭素を5%変化させます。細胞培地の半分を2日ごとに。ニューロンは、培養で1〜2日後に電気生理学的記録の準備が整います。

ここに示されているのは、腸管ニューロンの免疫組織化学的特性です。マウスから分離されたリー。縦筋共焦点顕微鏡法により、マウスのマウント回腸縦筋全体のニューロン特異的β 3チューブリン染色が明らかになりました。

そして、これらはLMMP調製物から単離された細胞であり、ここに示されたcal結合とレチングリア細胞に対して陽性に染色されたニューロンを含み、グリア特異的マーカーGFAPで可視化されました。しかし、一次抗体を省略した場合、染色は見られませんでした。これは、マウスの縦筋から分離されたニューロンとグリアが互いに近接して成長しているところです。

共焦点顕微鏡の画像は、緑色のニューロンと赤色のgglが互いに隣接して容易に成長し、in vitroで相互作用しているように見えることを示しています。この図は、電流クランプモードにおける培養腸管ニューロンとCLIAの電気生理学を示しています。すべてのニューロンは、電流注入時に活動電位を示しました。

CLIAには活動電位はありませんが、電流注入に応答して大きな電気張電位を示します。マウス回腸から培養されたニューロンは、電気生理学的不均一な集団です。電流クランプ・モードでは、ニューロンに0.09ナノアンペアの電流を注入すると、活動電位が発生します。

HP陰性ニューロンは、刺激後すぐに静止膜電位に戻ります。一方、HP陽性ニューロンは、静止膜電位がベースラインを下回る前にゆっくりと初期値に戻る刺激後にA HPを示します。一度習得すると、このテクニックは適切に実行すれば4時間で完了することができます。

この手順を試みるときは、ガラス器具と手術器具をできるだけ清潔に保つことを忘れないでください。また、この手順の2日ごとに細胞を静かに反復して泡立て、細胞培養培地の半分を交換します。電気生理学および免疫細胞化学のような方法は、薬物治療に対する腸内のイオンチャネルの応答方法、およびニューロンおよびliaにおけるタンパク質の発現について学ぶための追加の質問に答えるために、そしてこれら2つの細胞型の相互作用が様々な治療によってどのように変化するかを学ぶために実施することができるその開発後。

この技術は、神経生物学の分野の研究者が、遺伝子組み換え動物の腸神経系の神経障害およびg神経障害の基本的な機能を探求する道を開きました。このビデオを見れば、成体マウスの腸神経系のTER神経叢からニューロンとグリアを分離する方法を十分に理解できるはずです。