共焦点光シート顕微鏡全体マウスの脳のミクロンスケールの分解能光トモ

この手順の全体的な目的は、マウス脳全体をミクロンスケールの解像度で再構成し、可視化することです。まず、固定されたマウス脳のテトラヘドロン連続切片を脱水します。次に、ベンジルエーテルを用いてサンプルの透明化を行います。

次に、共焦点ライトシート顕微鏡を用いて脳をイメージングします。最終ステップとして、ソフトウェアを使用して取得した画像スタックの整列とスティッチングを行います。最終的に、マルチレゾリューション可視化ツールを使用して、再構築された画像ボリューム内をナビゲートすることが可能です。

共焦点顕微鏡や2光子顕微鏡などの他の手法と比較した本手法の主な利点は、マウス脳の全容積をわずか数日でイメージングできる点にあります。この手法は、脳全体における異なる神経細胞型の分布など、神経科学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法は、脳の微細な解剖学的構造に関する洞察を提供できるでしょうか。

本手法はマウス胚やショウジョウバエにも適用可能であり、手順の再現性が実証されています。私の研究室の大学院生が担当しました。本プロトコルを開始するには、経心腔灌流によるマウス脳の標準的な固定を行い、脱水および透明化を行う前に一晩後固定してください。

脱水溶媒であるTHFはXFP蛍光を強く消光するため、クロマトグラフィーカラムを用いて塩基性活性酸化アルミニウムでろ過し、過酸化物を除去します。その際、カラムのひび割れを避けてください。ひび割れが生じると過酸化物の除去効率が低下するため、最終溶液に安定剤を添加します。ろ過前にTHFがすでに安定化されていたとしても、安定剤は酸化アルミニウムによって除去されます。安定剤を含まないTHFは大量の過酸化物を生成する可能性があり、爆発の危険があることに注意してください。

次に、マウス脳全体の統合切片シリーズを純水を用いてTHFで脱水します。その後、サンプルが入ったバイアルを回転ホイールに設置し、光への曝露を避けます。バイアルをアルミホイルで包んでください。

最後に、ろ過漏斗を用いて酸化アルミニウムで透明化溶媒をろ過します。その後、100%DBEでサンプルを透明化し、脳が透明に見えるまで3時間後と6時間後に溶液を交換します。通常、2回目のDBE交換から1時間後に、ここで示されたいずれかの方法を用いて、傾斜イメージングプレートにマウントします。

アグロスディスクを用いた直接マウント、またはアグロスホルダーを用いたマウントによる直接的な固定を行う場合、アグロスディスクプランジを用いて、サンプルの端を先端の一方にゆっくりと浸します。先端には6%アグロスゲルで作られたディスクが装着されています。その後、アクリル接着剤でサンプルをアグロスディスク上に静かに固定し、硬化してマウントされるまで約1分間待ちます。

Agrosビーカープランジを使用し、3% Agrosゲルのビーカーの先端にゲルの層を形成させます。その後、サンプルをビーカーの底にそっと配置します。これらの方法のいずれかで標本を固定した後、ピンセットを用いてイメージングプレートを試料室内に配置します。

次に、チャンバーに透明化溶液を満たします。続いて、トモグラフィーの準備を行います。まず、可能な限り多くの蛍光を収集するためにスリットを取り除き、その後、低出力のレーザーでサンプルを照射します。

光退色を防ぐため、ソフトウェア制御のマイクロポジショニングシステムを用いて、サンプルをx、y、zの3方向へ移動させます。各方向について、サンプルがカメラの視野内に入り、かつ照明が当たっている最小座標と最大座標を特定してください。その後、特定した座標をプレトモグラフィーサブルーチンのパラメータとして入力します。

また、トモグラフィーおよびトモグラフィー前サンプリングステップで使用する、Z方向の隣接するスタック間の距離を指定します。最後に、前のステップで指定したZサンプリングパラメータに従って、各スタックの画像を収集するトモグラフィー前撮影を開始します。撮影を開始するには、まずマイクロポジショニングシステムを使用して、試料をライトシートの外へ移動させてください。

次に、レーザー出力を上げ、すべてのスキャニングシステムの動作を停止させ、視野の中心にある固定線のみを照射するようにします。続いて、スリットを装着し、透明化剤の自家蛍光シグナルを用いてアライメントを行います。これで、視野の中心にスリット線がはっきりと見えるはずです。

次に、スキャンシステムを再起動させます。レーザー出力を下げ、マイクロポジショニングシステムを用いて試料をライトシート内に移動させます。スリットを使用する場合のレーザー出力は、使用しない場合よりも高くなることに注意してください。

空間フィルターによってかなりの割合の光が遮断されるため、画像が鮮明で明るくなるまで、制御ソフトウェアを用いて走査およびd走査システムの振幅とオフセットを調整してください。次に、実験に適したZステップを設定し、トモグラフィー撮影ソフトウェアを実行します。ボリュームは、部分的に重複する多くの並行スタックでイメージングされ、画像は階層的なフォルダ構造に保存されます。

ステッチングソフトウェアを完全な立方体ボリュームで動作させるために、自動化ソフトウェアを使用して、取得したボリュームを合成ブラック画像（収集した画像と同じタイプおよび寸法でありながら、強度がゼロの画像）で補完します。次に、Terra、Stitcher、tarlyのプラグインをインストールしたVA A 3Dソフトウェアを起動し、Terra Stitcherプラグインをロードします。画像化されたボリュームを含むディレクトリを選択し、基準となる右手座標系に対する各軸の相対的な方向およびボクセルサイズを指定します。

ここでスティッチングの第1段階を開始します。ソフトウェアがスタックペア間の相対的な変位を算出し、すべてのスタックを合わせた全体的な最適配置を決定します。次に、スティッチング後のボリュームを単一解像度またはマルチレゾリューション形式で保存することを選択してください。後者の形式を選択すると、tarlyプラグインによるマルチレゾリューション可視化が可能になります。

どちらの場合でも、高解像度画像が数GBを超える場合は、マルチスタック保存モードを選択し、個々のサブスタックのサイズを指定してください。これにより、保存されたデータへの効率的なアクセスが可能になります。次に、ステッチングの第2パートを開始します。

ソフトウェアがアライメント済みのスタックをマージし、シングルスタックまたはマルチスタックモードのいずれかで保存します。完了したら、Terra Stitcherプラグインを閉じてください。次に、terra flyプラグインをロードします。

マルチスタック・マルチレゾリューションボリュームが含まれるフォルダを選択し、フォックスホールサイズと軸の方向を指定します。ボリュームは最小解像度でロードされます。より高い解像度でズームするには、マウスホイールを使用してください。

あるいは、画像の特定の点をダブルクリックするか、既存のランドマーク周辺をズームインするように選択するか、あるいは関心領域の座標を直接指定することも可能です。低解像度に戻すには、マウスホイールを使用してズームアウトしてください。本プロトコルを用いることで、物理的な切片作成を行うことなく、マウス脳全体または摘出した部位をミクロンスケールの解像度で再構築できます。

代表的な結果として、生後10日目のL7-GFPマウスの小脳全体をここに示します。すべてのパーキン遺伝子ニューロンがEGFPで標識されています。ズームすると小脳皮質の典型的な層状構造が見え、さらにズームすることで各プルキニェ細胞の細胞体を明確に区別することができます。

したがって、記述したプロトコルは、さまざまな神経発達研究におけるニューロンの空間的組織化をスクリーニングするために利用できます。2つ目の代表的な結果として、ここでは成人GFPMマウスのUN切片脳の画像を示します。このトランスジェニック動物では、EGFPがランダムかつ希薄なニューロンサブセットで発現しています。

ここでは脳の右半分を示しています。さらにズームしていくと、神経突起が識別できるようになります。この結果は、記述したプロトコルによって成体マウスの脳全体においてミクロンスケールの解像度でのイメージングが可能となり、細胞解像度で全脳解剖学を研究できる可能性が開かれたことを示しています。

神経変性疾患のマウスモデルにおいて、本手法を習得すれば、適切に実施することで3〜4日間で完了させることができます。この手順を行う際は、GFP蛍光を維持するために、脱水溶液および洗浄溶液を適切にろ過することが重要である点に注意してください。ここで提示する多解像度可視化ツールは、マイクロ光学的切片トモグラフィーなどの他の手法で得られた非常に大規模なデータセットの探索にも利用可能です。

このビデオを視聴することで、固定したマウス脳の脱染色（dating）、透過処理（rating）、および洗浄（clear）の方法を十分に理解することができます。また、共焦点シート顕微鏡を用いたイメージングを行い、Telyプラグインを使用してVR 3Dで再構成されたボリュームを可視化する方法を学びます。