制限酵素、又はエンドヌクレアーゼは特定配列を認識しDNAを切断します。本来この酵素はバクテリオファージ(バクテリアに感染するウイルス)に対する防御機構としてバクテリアが作り出すものです。バクテリアの制限酵素は侵入したバクテリオファージのDNAを切断します。しかしバクテリア自身のゲノムDNAはメチル基が付加されているため制限酵素により認識されません。
このビデオでは、まず制限酵素の基本原理: 制限酵素の名前の由来、認識部位のタイプ、について説明しています。また、制限酵素処理のセットアップ方法、反応混合液の調製方法、一般的なインキュベーション温度や時間などの一般的手法を段階的に紹介しています。その中で、スター活性を防止するための制限酵素不活性化の必要性に触れ、さらに複数の制限酵素を用いた処理法やコントロール使用などのヒントも紹介しています。
制限酵素、別名制限エンドヌクレアーゼは、様々な分子生物学の実験に利用されています。この種の酵素は、制限酵素部位と呼ばれるDNA配列を特異的に認識し切断します。 このビデオでは、この素晴らしいテクニックについての基本的な知識と制限酵素処理のセットアップ方法を紹介していきます。
一体制限酵素はどこからやってきたのでしょうか?この酵素は、バクテリオファージというウイルスに対する防御機構としてバクテリア自身が作り出すものです。バクテリアDNAの制限酵素部位にはメチル基が付加されており、制限酵素はファージDNAのみを認識し切断します。このようにしてバクテリアは感染を制御しているのです。
制限酵素には風変わりな名前がつけられています。例えば、HindIII、NotI、EcoRI、BamHIなどがあります。名前の最初の3文字で由来生物を示します。この制限酵素EcoRIは大腸菌から単離されたものであることが分かります。必要に応じて4番目の文字にその菌株名を入れます。最後のローマ数字でその特定の生物から分離された何番目の酵素であるのか、1番目なのか、2番目、3番目なのかということを知ることができます。
制限酵素処理は入念な計画が必要となります。一般的な制限酵素反応には、脱イオン水、切断するDNA、使用する酵素に特異的なバッファー、それから必要ならばBSAが用いられます。BSAは酵素処理を行う際に酵素が容器の側面に付着するのを防ぎ、反応の安定化を図るために利用されます。制限酵素はバッファーの条件、インキュベーション温度、BSAの有無などがそれぞれ異なります。これら必要な情報は制限酵素の販売元から提供されているのでその都度確認することができます。
制限酵素処理は、まず冷凍庫もしくは冷蔵庫から制限酵素を取り出すところから始まります。最適活性を保つために制限酵素は氷の上又は耐熱性の容器に置いておきます。各試薬をマイクロチューブに以下の順で加えます。まず最終反応液が20μLになるよう滅菌済みヌクレアーゼフリーの水。次に制限酵素の10xバッファー、それから必要ならばBSA、1μg以下のDNA、それに対し2から10ユニットの酵素を加えます。ユニットとはコントロールDNA1μgを、1時間、37°C、酵素反応液50μL中で完全に分解する酵素量のことです。ボルテックスで混合後、12000 xgで短時間の遠心を行い、チューブの底の混合液を回収します。そして制限酵素の最適温度、通常はヒーティングブロック上37℃で、1時間から4時間インキュベートします。
反応終了後、65°Cで加熱し酵素を不活性化します。制限酵素が特異的な切断を行っている最中のインキュベーション時間が長くなると、スター活性が生じる可能性があります。これは、典型的な認識部位とは同一でなく類似した配列を切断してしますことです。
インキュベーションに続き、完全に処理されているか確認するためにアガロースゲル電気泳動を行います。
ここで制限酵素処理を成功させるためのヒントをいくつかお伝えします。
実験を進める中で特異的なDNA断片を得るために複数の酵素が必要になるかもしれません。その場合は二つの酵素のバッファー条件とインキュベーション温度を確認します。もし一致すれば同じ反応液中で同時に切断可能です。しかしながら、もし二つの制限酵素で条件が異なる場合は、別々に酵素処理を行う必要があります。まずは、一つ目の酵素を用いて切断を行った後、二つ目の酵素に最適なバッファーに変更するという方法があります。もう一つ、バッファー条件の不適合を打開し連続して酵素処理を行うために、最初の酵素処理を行った後にDNAを精製し、それから二回目の酵素処理を行う方法があります。
処理がうまくいかないときの問題解決にはコントロールの使用が有用です。例えば、酵素を含まないコントロールを用いることで、DNAサンプルの状態とエキソヌクレアーゼ活性の有無を確認できます。また、既知の認識部位をもつコントロールDNAを使用することで酵素活性を確認できます。
ここまで酵素処理の方法を学んできました。ここからは制限酵素を使った様々な応用例を見ていきましょう。
制限酵素は診断にも応用でき、サンプルの検査に利用されます。特別なチップにDNA断片をロードし、バイオアナライザで分析します。ここでは魚サンプルの酵素処理によって生じたDNA断片の長さを分析し、その信頼性を確認しています。同一遺伝子を同様に酵素処理したにもかかわらず、バンドのパターンが異なることを制限酵素断片長多型と呼びます。
さらに制限酵素はサブクローニングにも用いられます。処理後のDNA断片を他のベクターに挿入し、バクテリアを利用して目的の断片を複製することが可能になります。
ポリメラーゼ連鎖反応すなわち PCRにより、制限酵素部位を遺伝子の特定の場所に導入することができ、制限酵素を用いて、同一遺伝子内での多型すなわち対立遺伝子での単一ヌクレオチドの違いを確認することができます。これら一塩基多型、SNPsはPCRや電気泳動だけでは検出に困難を極めます。SNP内に制限酵素部位を導入することで、酵素処理により簡単に対立遺伝子との識別が可能になります。
ここまでJoVE制限酵素編をご覧いただきました。制限酵素の由来、役割についての基本的な知識、酵素処理のセットアップ方法、そして最後に制限酵素の分子生物学への応用例を紹介しました。ご覧いただきありがとうございました。
制限酵素、または制限エンドヌクレアーゼは、分子生物学のさまざまな用途で使用されています。これらの酵素は、制限部位と呼ばれる特定のDNA配列を認識して切断します。これから見るビデオでは、これらの奇跡的な分子に関する背景情報を提供し、制限酵素消化器の設定方法を示しています。
そもそも制限酵素はどこから来るのでしょうか? これらの酵素は、バクテリオファージとして知られるウイルスに対する防御メカニズムとして機能する細菌の適応です。細菌のDNA上の制限酵素部位にメチル基を付加することで、制限酵素はファージDNAのみを認識して切断し、感染を防ぎます。
制限酵素には、かなり奇妙な名前が付けられています。 たとえば、HindIII、NotI、EcoRI、BamHIなどです。 制限酵素名の最初の3文字は、単離された生物を指します。 例えば、制限酵素EcoRIは大腸菌から単離された。4番目の文字は、必要に応じて、酵素が単離された細菌株を指します。ローマ数字は、その特定の生物から単離された1番目、2番目、3番目の酵素であるかどうかを示します。
制限酵素は、通常4〜8塩基対の長さのヌクレオチドの配列を認識し、認識部位と呼ばれます。 配列内の特定のヌクレオチドでは、酵素はDNA骨格のホスホジエステル結合を切断します。 認識部位は通常、回文性であり、シーケンスは前方と後方で同じ読み取られます。回文がDNA分子の相補的な鎖に見られる場合、それは逆反復回文と呼ばれます。
制限酵素は、DNAが切断されると、粘着性末端と平滑末端というさまざまなタイプの末端を残すことができます。スティッキーエンドは3を残しますか?そして5?鈍い端がオーバーハングを残さない間、オーバーハング。末端のタイプによって、制限酵素消化物によって単離されたDNA断片が、ライゲーションと呼ばれるプロセスで他のDNA断片とどのように再結合されるかが決まります。
制限酵素消化物は慎重に計画する必要があります。消化反応は通常、脱イオン水、切断されるDNA、使用する酵素に特異的なバッファー、場合によってはウシ血清アルブミンまたはBSAと呼ばれるタンパク質で構成されます。 BSAは、消化物を収納する容器の側面に酵素が付着するのを防ぐことで、反応を安定させます。 各制限酵素は、異なるバッファー条件、インキュベーション温度、およびBSAの要件を持つ可能性があります。 制限酵素の供給者は、必要な情報をすべて取得するために確認できるリソースを持っています。
消化物の設定を開始するには、冷凍庫または冷蔵庫から制限酵素を取り出します。 制限酵素を氷上または耐熱性容器に保管して、将来の反応に最適な活性があることを確認してください。マイクロチューブには、反応成分を次の順序で追加する必要があります。まず、無菌のヌクレアーゼフリー水の量で、最終反応量は20μLになります。次に、10倍制限酵素バッファー、必要に応じてBSA、最大1μgのDNA、および2〜10単位の酵素。単位は、37歳で60分で1μgのコントロールDNAの完全な消化物を生成するために必要な酵素の量として定義されますか?50のC?L反応量。その後、ボルテックスで混合し、マイクロ遠心分離機で12,000xgで短時間遠心分離して、チューブの底に内容物を収集します。次に、制限酵素に最適な温度(通常は37)でインキュベートしますか?Cを加熱ブロックに入れて1〜4時間。
消化が完了したら、反応混合物を65歳でインキュベートすることをお勧めしますか?Cを加熱すると、制限酵素が不活性化されます。 制限酵素はほとんどの場合、部位特異的に切断しますが、インキュベーション時間が長くなると、スターの活性が引き起こされ、典型的な消化部位とは類似しているが異なる部位が切断されます。
不活化後、DNAをアガロースゲル上で分析し、消化が成功したことを確認する必要があります。
ここでは、ダイジェストを実行し、成功を確実にするための役立つヒントをいくつか紹介します。
時には、特定のDNA断片を生成するために複数の酵素を使用する必要がある状況に陥ることがあります。 この場合、2つの酵素間で緩衝条件とインキュベーション温度が適合していることを確認する必要があります。適合している場合は、ダブルダイジェストを行い、両方の酵素を同じ反応で切断することができます。しかし、時には、2つの酵素間の反応条件に不適合を見つけることがあります、そしてこの場合の回避策は、酵素を順番に使用することです。 例えば、消化物を最初に1つの酵素で行い、次に緩衝液の組成を、第2の酵素に最適になるように変更することができる。バッファーの不適合を克服し、シーケンシャル消化を行う別の方法は、最初の消化後にDNAを精製し、次に2回目の消化を行うことです。
コントロールを使用すると、ダイジェストがうまくいかない理由を理解するのに適した方法です。 例えば、酵素を使用しない制御では、DNAサンプルの完全性をチェックし、エキソヌクレアーゼ活性が存在するかどうかを判断できます。既知の制限部位を持つコントロールDNAを使用することで、酵素の活性を試験することができます。
さて、消化がどのように行われるのかを見てきたところで、次は制限酵素のさまざまな使い方を見ていきましょう。
制限酵素は、特定のサンプルを同定するために診断的に使用することができます。消化物を特殊なチップにロードし、そのチップをバイオアナライザーと呼ばれる機械に入れることによって。研究者は、魚のサンプルの真正性を判断するために、消化物によって生成されたDNA断片のサイズを調べることができます。特定の種(この場合は異なる種)の同じ遺伝子の異なるバンディングパターンは、制限フラグメント長多型と呼ばれます。
制限酵素は、サブクローニングにも使用して、1つのプラスミドからDNAの断片を単離し、別のプラスミドに挿入できるため、細菌を使用して目的のフラグメントを複製できます。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して、非常に特定の位置で遺伝子に制限部位を導入することにより、制限酵素を使用して、同じ遺伝子の代替形態または対立遺伝子における一塩基の違いの存在を判定できます。 これらの一塩基多型(SNP)は、PCRやゲル電気泳動だけでは検出が困難です。SNP内に制限部位を導入することで、単純な消化物で対立遺伝子を区別することができます。
JoVEの制限酵素に関するビデオをご覧になりました。これらの酵素がどこから来るのかを学び、その働きについての基本を学び、消化物の設定方法を見てきましたし、分子生物学で制限酵素をどのように使用できるかを学びました。いつものように、ご覧いただきありがとうございます!
Related Videos
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology
224.8K 閲覧数
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology
193.1K 閲覧数
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology
727.5K 閲覧数
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology
609.7K 閲覧数
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology
481.6K 閲覧数
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology
740.6K 閲覧数
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology
115.8K 閲覧数
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology
253.7K 閲覧数
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology
308.7K 閲覧数
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology
110.8K 閲覧数
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology
506.1K 閲覧数
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology
170.9K 閲覧数
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology
190.1K 閲覧数
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology
287.7K 閲覧数
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology
378.6K 閲覧数