Name: ポリマー微小球および光ファイババンドルを使用したヒト唾液タンパク質分析のための多重化された蛍光マイクロアレイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 学ぶ 蛍光微小球アレイを用いたヒト唾液中の複数タンパク質同時分析法。光ファイババンドル上にマイクロアレイを構築し、サンドイッチ免疫測定で蛍光顕微鏡による検出を行う。ELISAに比べ高効率で、臨床診断への応用が期待される。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、国立衛生研究所（助成08UDE017788-05）によってサポートされていました。 EBPはまた、科学技術のためのスペイン財団（FECYT）からの支援を認めるものです。著者は、原稿の重要な読書のためにShonda T.ゲイロードとPratyusha Mogalisettiに感謝します。

<img alt="図1" width="600px" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50726/50726fig1.jpg" /> 図1。唾液プロファイリングに光ファイバー微小球抗体アレイを適用するためのワークフロー （1）マイクロスフェアが内部二つの蛍光色素を用いて符号化され、（2）符号化されたマイクロスフェアは、外部タンパク質特異的モノクローナル抗体で修飾され、（3）多重化されたマイクロスフェアが混合され、 （5）唾液タンパク質は、サンドイッチイムノアッセイを介してマイクロスフェアに捕捉される、および（6）蛍光顕微鏡を用いて定量し、（4）ランダムに光ファイバ束の近位端にエッチングしたマイクロウェル内に堆積。 1。マイクロスフェアエンコーディング<ol><li>琥珀色のガラスバイアル中でナトリウムユウロピウム（III）thenoyltrifluoroacetonate三水和物（EU-TTA、MW = 869.54グラム/モル）を計量し、テトラヒドロフラン（THF）に200 mMストック溶液を調製。ピペッティングにより穏やかに混合し、視覚的に確認してください染料が完全に溶解する。 </li><li>琥珀色のガラスバイアル中のクマリン30（C30、MW = 347.41グラム/モル）を計量し、THF中の12 mMストック溶液を調製。ピペッティングにより穏やかに混合し、視覚的に色素が完全に溶解していることを確認します。 </li><li> 表1に記載されている最終濃度に達するためにストック溶液及びTHFを使用して、各微小球タイプのワーキング溶液700μLを準備します。 </li><li>マイクロスフェア（10％W / V）がよくボルテックスで懸濁した後、1.5 mlのマイクロ遠心チューブに60μlの懸濁物を転送していることを確認してください。 </li><li>微小球懸濁液を600μlのPBSを加え、20Xピペッティングして混ぜる。 3分間10,000 rpmでチューブを遠心分離し、上清を注意深く除去します。微小球を洗浄するためにこのプロセスを別の2倍を繰り返します。 </li><li>ステップ1.5と同様の手順を使用して、THFでミクロスフェアペレット3回洗浄します。 </li><li> 3分間、10,000 rpmで、微小球/ THF懸濁液遠心し、上清を除去し、600μlのペレットを再懸濁作業溶液は、 表1に記載されている。新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに混合物を転送します。 </li><li>パラフィルムでマイクロチューブを密封し、振とう機の上に置きます。 3,000 rpmで振ると24時間インキュベート、アルミ箔で覆われた箱を使用してセットアップを覆うことにより、光から保護します。 </li><li>ペレットを形成するために3分間、10,000 rpmでマイクロスフェア懸濁液を遠心分離する。 </li><li> 、上澄み色素溶液を除去600μlのメタノールでマイクロスフェア6Xを洗った後、0.01％のTween-20、別の6X、ステップ1.5で説明したようにを含む600μlのPBSで。 </li><li>使用するまで4℃で0.01％のTween-20を含む600μlのPBS中で符号化された微小球を保存する、光から保護します。 </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> マイクロスフェア型名： </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </強い&gt; </td><td> 7 </td></tr><tr><td> EU-TTA（MM） </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 10 </td><td> 100 </td><td> 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> C30（MM） </td><td></td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 6 </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table> 表1。のEu-TTAやC30ワーキング溶液の濃度。 2。タンパク質捕捉ミクロスフィアの調製<ol><li> MES緩衝液調製[2 - （N-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）、0.1MのNaCl 0.9％SDS、0.01％、pHが5.7]、およびPBS / SDS緩衝液（リン酸ナトリウム、0.01MのNaCl 0.154Mの、SDS、0.01％、pHが7.4）を室温で事前に。 </li><li>セーフロック1.5mlのマイクロチューブに（〜2mgのマイクロスフェアを含む）200μlの符号化された微小球懸濁液を追加します。なお、ステップ2.6でのインキュベーションの間にこぼれを回避するために、マイクロチューブのこのタイプを使用することが重要である。 </li> &lt;李&gt;ステップ1.5で説明したように3倍のバッファ600μlのMESで微小球を洗浄します。ミクロスフェアペレットに700μlのMESを加え、ピペッティングによりよく混ぜます。 </li><li>調製0.105グラム/ mlの1 - エチル-3 - [3 - ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩（EDC、MW = 191.7グラム/モル）および0.163グラム/ mlのスルホ-N-ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ-NHS、MW = 217.13グラム/モル）別々のチューブ内のMES緩衝液中の溶液。 </li><li>たて微小球懸濁液にドロップによる EDC溶液降下を用意し150を添加する。 EDCは、従って、それが固定化効率を確保するために新たに調製した溶液を用いることが必須であり、非常に迅速に加水分解する。すぐにEDCを加えた後、マイクロスフェアに150μlのスルホ-NHS溶液を加え、ピペットでよく混和し、懸濁液が均質であることを確認します。 </li><li>チューブに蓋をパラフィルムでそれを封印し、シェーカー上に置きます。 4時間1,500 rpmで振る、アルミ箔で覆われた箱を使用して光から保護します。 </li><li>微小球suspensを遠心分離ペレットを形成し、上清を除去し、3分間、10,000 rpmでイオン。ステップ1.5で説明したように500μlのPBS / SDS緩衝3Xで微小球を洗浄します。 </li><li> 、ペレットに200μlのPBS / SDS緩衝液を追加するだけでなく、微小球を混ぜて60μgの捕獲抗体を含有する300μlのPBS / SDS緩衝液にソリューションを移す。これは、最初のマイクロスフェアペレットを一時停止した後、抗体溶液に微小球懸濁液を添加することが重要である。 </li><li>アルミ箔で覆われた箱を使用して光から保護し、シェーカー上、4時間1,500 rpmで振とうすることにより、抗体 - マイクロスフェア混合物をインキュベートする。 </li><li>ペレットを形成し、上清を除去し、3分間、10,000 rpmでマイクロスフェア懸濁液を遠心分離する。 500μlのStartingBlock（TBS）ステップ1.5で説明したように、バッファ3回ブロッキング微小球を洗浄します。 </li><li>ブロッキングバッファーのTBS 1mlの微小球を混合し、シェーカー上で1時間、1,500 rpmで微小球をインキュベートし、箱の入り江を利用し、光から保護するアルミホイルで赤い。 </li><li>ペレットを形成し、上清を除去するために3分間7,000 rpmで微小球懸濁液を遠心分離する。ステップ1.5で説明したように、ブロッキングバッファー500μlのTBSでペレット3回洗浄します。 </li><li>ペレットを形成し、上清を除去し、3分間7,000 rpmでマイクロスフェア溶液を遠心分離する。ブロッキングバッファー500μlのTBS系を加え、ピペッティングにより混和する。 </li><li>光から保護し、使用するまで4℃で修正された微小球懸濁液を格納します。 </li><li>対応する抗体を使用したマイクロスフェアの他のタイプを作るために、この手順を繰り返します。 </li></ol> 3。光ファイバーマイクロアレイアセンブリ<ol><li>新しいオートクレーブ処理マイクロ遠心チューブにタンパク質捕捉マイクロスフェアの各タイプの50μLを混合します。遠心分離機株式マイクロスフェアは、3分間7,000 rpmでプール、残りの容量は、約100μLになるように上清を除去します。 </li><li>長さは約5cmにハンドカット光ファイババンドルと順次フィルムラッピング30、15、9、6、3、1、0.5、および0.05ミクロンサイズのダイヤモンドを使用した研磨機で両端を磨く。任意の粒子を除去するために2分間の脱イオン水に磨かバンドルを超音波処理。 </li><li> 0.5mlのマイクロ遠心チューブに小さな磁気撹拌バーを入れ、タンパク質を含まないPBS緩衝液400μlを添加し、気泡を除去するために30分間、磁気撹拌プレート上で撹拌する。 </li><li> 150秒10,16のための0.025 N HCl溶液中で洗練された繊維束の一端をエッチングする。すぐに1分間の脱イオン水にエッチングされた端を水没し、超音波処理。圧縮空気で繊維束を乾燥させます。 </li><li>ファイバホルダに繊維束をマウントし、1時間気泡のない、タンパク質を含まないPBSバッファにエッチングされたエンドをブロックします。 </li><li>光ファイバ束のエッチングされた端に格納されたミクロスフェア懸濁液の預金1μlの分量。アルミホイルの箱の光からセットアップを保護し、15分間待ちます。懸濁液の体積ます蒸発によって減少し、エッチングされたマイクロウェルにマイクロスフェアを強制。この装填工程をもう一度繰り返します。 </li><li>マイクロウェルにトラップされていない微小球を除去するために試料溶液を飽和させた綿棒を使用してください。タンパク質マイクロアレイが使用できるようになりました。唾液分析用に4.1をすぐにステップ移動します。 </li></ol> 4。微小球マイクロアレイを用いた唾液サンプルの分析<ol><li> 200μlの試料溶液（ブロッキング緩衝液。唾液上清の収集プロトコルは以前に10公開されているStartingBlock T20（PBS）等容量の希釈した100μlの唾液上清）を追加する。 0.5ミリリットルオートクレーブ処理マイクロ遠心チューブに。溶液中に繊維上にロードされたタンパク質マイクロアレイを浸し、2時間600rpmで振とう機上でインキュベート、アルミ箔で覆われた箱を使用して光から保護します。 </li><li> PBS、マイル19.6ミリリットル中に200μlの10％BSA溶液及び200μlの10％のTween-20を添加して20ミリリットルの洗浄緩衝液を調製静かに振とうすることにより十分にX。 </li><li> 200μlの洗浄緩衝液を含む新しいオートクレーブ処理マイクロ遠心チューブにタンパク質マイクロアレイを浸し、2分間600rpmで振とうする。この洗浄3回繰り返します。 </li><li>抗VEGF、IP-10、IL-8、EGF、MMP-9を5μg/ mlを含む検出抗体カクテル100μlの溶液中にマイクロアレイをインキュベートし、StartingBlock T20におけるIL-1βのビオチン化検出抗体（PBS）をブロッキング緩衝液600rpmでシェーカー上で室温で30分間、アルミホイルで覆われたボックスを使用して、光から保護する。 </li><li>ステップ4.3で説明したように洗浄バッファーでマイクロアレイ3回洗浄します。 </li><li>アルミ箔で覆われた箱を使用して光から保護し、10分間シェーカー上600rpmで、PBS中20μg/ mlのストレプトアビジンR-フィコエリスリン複合体（SAPE）溶液200μlに、マイクロアレイをインキュベートする。 </li><li>ステップ4.3で説明したように洗浄バッファーでマイクロアレイ5Xを洗浄します。 </li><li>ファイバー離れて（ すなわち 、最後の先端部を清掃してくださいマイクロスフェアからの）無水エタノールで飽和綿棒でバンドル。 </li><li>圧縮空気が繊維の両端を乾燥させる。光ファイバの遠位端を通って落射蛍光顕微鏡画像上に繊維をマウントします。 </li><li>のEu-TTA、C30、およびSAPE蛍光発光強度に対応したマイクロスフェアの画像を取得。のEu-TTA、C30、およびSAPEの蛍光撮像用の光学フィルタのセットアップおよび曝露時間は、 表2に示されている。 </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> チャンネル </td><td> EU-TTA </td><td> C30 </td><td> SAPE </td></tr><tr><td>励磁機</td><td> 365/10x </td><td> 350/50x </td><td> 546/10x </td></tr><tr><td>ビームスプリッタ</td><td> 525DCLP </td><td> 400DCLP </td><td> 560LP </td></tr><tr><td>エミッター</td><td> 620/60m </td><td> 460/50m </td><td> 580/30m </td></tr><tr><td>露光時間</td><td> 1秒</td><td> 0.3秒</td><td> 1秒</td></tr></tbody></table> 表2。マイクロアレイの3蛍光画像用のパラメータ。

<ol><li>Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+monitoring+of+gene-expression+patterns+with+a+complementary-DNA+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray.</a> Science. 270, 467-470 (1995).</li>
<li>Schena, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchena%2C+M+%22Protein+Microarray%22">Protein Microarray</a>. , Jones and Bartlett Publishers. (2004).</li>
<li>Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+analysis+of+eight+human+Th1%2FTh2+cytokines+using+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous analysis of eight human Th1/Th2 cytokines using microarrays.</a> J. Immunol. Methods. 261 (01), 157-165 (2002).</li>
<li>Wang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array-based+multiplexed+screening+and+quantitation+of+human+cytokines+and+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Array-based multiplexed screening and quantitation of human cytokines and chemokines.</a> J. Proteome Res. 1, 337-343 (2002).</li>
<li>de Jager, W., Velthuis, te, Prakken, H., Kuis, B. J., W,, Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+15+human+cytokines+in+a+single+sample+of+stimulated+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).</li>
<li>Lee, H. J., Nedelkov, D., Corn, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+plasmon+resonance+imaging+measurements+of+antibody+arrays+for+the+multiplexed+detection+of+low+molecular+weight+protein+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Surface plasmon resonance imaging measurements of antibody arrays for the multiplexed detection of low molecular weight protein biomarkers.</a> Anal. Chem. 78, 6504-6510 (2006).</li>
<li>Vignali, D. A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+particle-based+flow+cytometric+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed particle-based flow cytometric assays.</a> J. Immunol. Methods. 243 (00), 243-255 (2000).</li>
<li>Rissin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assay+detects+serum+proteins+at+subfemtomolar+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations.</a> Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).</li>
<li>Zhang, H., Nie, S., Etson, C. M., Wang, R. M., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oil-sealed+femtoliter+fiber-optic+arrays+for+single+molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Oil-sealed femtoliter fiber-optic arrays for single molecule analysis.</a> Lab Chip. 12, 2229-2239 (2012).</li>
<li>Blicharz, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber-Optic+Microsphere-Based+Antibody+Array+for+the+Analysis+of+Inflammatory+Cytokines+in+Saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fiber-Optic Microsphere-Based Antibody Array for the Analysis of Inflammatory Cytokines in Saliva.</a> Anal. Chem. 81, 2106-2114 (2009).</li>
<li>Mukhopadhyay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Devices+to+drool+for%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Devices to drool for.</a> Anal. Chem. 78, 4255-4259 (2006).</li>
<li>Wong, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+diagnostics+powered+by+nanotechnologies%2C+proteomics+and+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Dent.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics.</a> J. Am. Dent. Assoc. 137, 313-321 (2006).</li>
<li>Segal, A., Wong, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+diagnostics%3A+enhancing+disease+detection+and+making+medicine+better%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Dent.+Educ%22%5BJournal%5D)">Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better.</a> Eur. J. Dent. Educ. 12, 22-29 (2008).</li>
<li>St John, M. A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+6+and+interleukin+8+as+potential+biomarkers+for+oral+cavity+and+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Otolaryngol.+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Interleukin 6 and interleukin 8 as potential biomarkers for oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma.</a> Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130, 929-935 (2004).</li>
<li>Herr, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+immunoassays+as+rapid+saliva-based+clinical+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5268-5273 (2007).</li>
<li>Pantano, P., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+nanowell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Mater%22%5BJournal%5D)">Ordered nanowell arrays.</a> Chem. Mater. 8, 2832-2835 (1996).</li>
<li>Schena, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchena%2C+M+%22Protein+Microarrays%22">Protein Microarrays</a>. , Jones and Bartlett Publishers. (2005).</li>
<li>Mouse IgG1 Isotype Control [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.rndsystems.com/Products/MAB002">http://www.rndsystems.com/Products/MAB002</a> (2013).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

研究者は、次の手順に特別な注意を払う必要があります：より良いデコード精度のためには、マイクロスフェアが均一にすべてのインキュベーションに懸濁し、検証し、マイクロスフェアの符号化手順の間にステップを洗浄する必要がある。また、符号化されたマイクロスフェアは、実験全体を通して、光から保護される必要がある。適切な符号化及び記憶手順に従って、我々は、全体の復号精度は99％以上であったことを見出した。エンコードされたマイクロスフェアは、4℃で保存する必要があり、凍結を避け、光から保護しています。適切な保管条件の下では、符号化された微小球は半年以上安定である。細心の注意は、微小球の損失を低減するために、符号化および変更の手順の際に必要となります。上澄み液を除去する際に、たとえば、マイクロスフェアペレットを乱すことがありません。また、緩衝液中のTween-20およびSDSを含めて良好なマイクロスフェア、ペレット化のために必須である。 いくつかのO一般的なトラブルシューティング手順fは、（1）のみを新たに調製したEDC溶液およびEDC溶液を使用して滴下して加えるべき...

1990年代半ばにマークSchenaとその共同研究者によって報告される最初のマイクロアレイので、この強力なツールは、生物学的研究1の多くの分野で利用されている。同時に、血液などの体液の診断、内の複数のタンパク質を検出する抗体マイクロアレイは、臨床診断やバイオマーカーのスクリーニング2月10日の重要な用途がある。唾液は、血液と同じ分析物の多くを含む、唾液の収集は、安全で非侵襲的であるため、血液の好ましい代替手段として考えられており、最小限の訓練を受けた医療従事者11-13によって行うことができる。現在、唾液サンプルを用いて多重化されたタンパク質の分析は、標的分析物14の濃度が低いと、異なるバイオマーカー15の広い濃度範囲を含むいくつかの重要な要因によって制限される。 。 ここで、我々は、6つのタンパク質の解析を実証する：ヒト血管内皮増殖因子（VEGF）、インターフェロンガンマ誘導性タンパク質10（IP-10）、インターロイキン-8（IL-8）、上皮成長因子（EGF）、マトリックスメタロペプチダーゼ9（MMP-9）、インターロイキン-1β（IL-1β） 。方法の性能は、最初に標準溶液組換え被分析タンパク質を構成し、ブロッキング緩衝液を使用して確認した。別の慢性呼吸器疾患の患者さんだけでなく、健常対照から収集された実際の唾液サンプルにも十分な性能を試験した。プロトコルは、他のタンパク質分析物と他のマイクロスフェアベースのアッセイに適用可能であるべきである。それは、ANと比較して、高速、正確、かつ広いダイナミックレンジを有するいくつかのタンパク質の低濃度の再現性の同時分析、最小限の非特異的相互作用、還元試料消費、および低コストを可能にするように、このプラットフォームは、分析化学の分野にかなりの利点を提供する類似酵素免疫測定法（ELISA法）。

<table><tbody><tr><td>Eu-TTA染料</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>AC42319-0010</td><td></td></tr><tr><td>THF</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>34865-100ML</td><td></td></tr><tr><td>琥珀色のガラスバイアル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>03-339-23B</td><td></td></tr><tr><td>クマリン30染料</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>546127-100MG</td><td></td></tr><tr><td>マイクロスフィア</td><td>バンスラブ</td><td>PC05N / 6698</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml微量遠心チューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10倍濃縮物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493-1L</td><td></td></tr><tr><td>水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502-1L</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tw-20 Sigma-Aldrich</td><td></td><td>P7949-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>BupH MES 緩衝生理食塩水</td><td>Thermo Scientific</td><td>28390</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05030-500ML-F</td><td></td></tr><tr><td>NaOH溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS256-500</td><td></td></tr><tr><td>セーフロック微量遠心チューブ</td><td>VWR labshop</td><td>53511-997</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS</td><td>Thermo Scientific</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>ヒトVEGF捕捉抗体</td><td>R&D Systems</td><td>MAB293</td><td></td></tr><tr><td>ヒト IP-10 捕捉抗体</td><td>R&D Systems</td><td>MAB266</td><td></td></tr><tr><td>ヒト IL-8 捕捉抗体</td><td>R&D Systems</td><td>MAB208</td><td></td></tr><tr><td>ヒト EGF 捕捉抗体</td><td>R&D Systems</td><td>MAB636</td><td></td></tr><tr><td>ヒト MMP-9 捕捉抗体</td><td>R&Dシステム</td><td>ズMAB936</td><td></td></tr><tr><td>ヒトIL-1&β;捕捉抗体</td><td>R&D Systems</td><td>MAB601</td><td></td></tr><tr><td>マウス IgG1 アイソタイプコントロール抗体</td><td>R&D Systems</td><td>MAB002</td><td></td></tr><tr><td>StartingBlock(TBS)バッファー</td><td>Thermo Scientific</td><td>37542</td><td></td></tr><tr><td>HCl標準液 1.0 N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>318949-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml 微量遠心チューブ</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>プロテインフリー(PBS)バッファー</td><td>Thermo Scientific</td><td>37572</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト VEGF 165</td><td>R&D Systems</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト IP-10</td><td>R&D Systems</td><td>266-IP</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト IL-8</td><td>R&D Systems</td><td>208-IL</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト EGF</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ236-EG</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトMMP-9</td><td>R&D Systems</td><td>911-MP</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト IL-1&β;</td><td>R&D Systems</td><td>201-LB</td><td></td></tr><tr><td>StartingBlock T20 (PBS) バッファー</td><td>Thermo Scientific</td><td>37539</td><td></td></tr><tr><td>PBS 中のブロッカー BSA</td><td>Thermo Scientific</td><td>37525</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化 VEGF 検出抗体</td><td>R&D Systems</td><td>BAF293</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化 IP-10 検出抗体</td><td>R&D Systems</td><td>BAF266</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化 IL-8 検出抗体</td><td>R&D Systems</td><td>BAF208</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化 EGF 検出抗体</td><td>R&D Systems</td><td>BAF236</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化 MMP-9 検出抗体</td><td>R&Dシステム</td><td>ズBAF911</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化IL-1&β;検出抗体</td><td>R&Dシステム</td>ズ<td>BAF201</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン、R-フィコエリトリン</td><td>Invitrogen</td><td>S-21388エ</td><td></td></tr><tr><td>タノール(200プルーフ)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr></tbody></table>

ポリマー微小球および光ファイババンドルを使用したヒト唾液タンパク質分析のための多重化された蛍光マイクロアレイ

Multiplexed Fluorescent Microarray for Human Salivary Protein Analysis Using Polymer Microspheres and Fiber-optic Bundles

ここで、我々は、同時に光ファイバー微小球ベースの抗体アレイを用いて唾液中に6つのタンパク質を測定するためのプロトコルを記載している。採用免疫アレイ技術は、蛍光顕微鏡を用いたマイクロスフェアベースのサスペンションアレイ製造の利点を兼ね備えています。ビデオプロトコルに記載のように、市販さ4.5μmのポリマーミクロスフェアは、物理的に微小球の内部に閉じ込められた二つの蛍光色素の濃度によって区別7種類、に符号化された。表面にカルボキシル基を含有する符号化されたマイクロスフェアは、EDC / NHSカップリング化学を介してモノクローナル捕捉抗体で修飾した。タンパク質マイクロアレイを組み立てるために、符号化及び官能化ミクロスフェアの異なる種類を混合し、無作為に化学的に光ファイバ束の近位端にエッチングされた4.5μmのマイクロウェル内に堆積される。光ファイバ束は、キャリアの両方としておよびmを画像化​​するために使用したicrospheres。一旦組み立てられると、マイクロアレイは診療所から収集された唾液上清中のタンパク質を捕捉するために使用した。検出は、ストレプトアビジン結合蛍光プローブ、R-フィコエリスリンと異なる分析物について、ビオチン化検出抗体の混合物を用いたサンドイッチ免疫測定法に基づいた。マイクロアレイは、微小球の登録およびアッセイシグナルのための1のための3つの異なるチャネル、2に蛍光顕微鏡で画像化した。蛍光顕微鏡写真は、次いで、デコードされMATLABに自家製のアルゴリズムを用いて分析した。

光ファイバ束の小断面を示すつのチャネルからの蛍光画像は、 図2A-Cに示されている。 （ディスカッションセクションにおいてより詳細に記載されるように）これらの画像は、MATLABで記述されたアルゴリズムを用いて分析した。分析は、マイクロスフェアを復号するためのEu-TTA符号化画像（ 図2A）からの情報及びC30符号化画像（ 図2B）の両方を採用し、信号画像（ 図2C）の異なる微小球の蛍光強度を算出した。相関タンパク質標準から得られた検量線で、唾液試料中のタンパク質の濃度を計算した。 <img alt="図2" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50726/50726fig2.jpg" /> 図2。 （A）のEu-TTA符号化画像（B）C30符号化画像、（C）SAPE信号画像、（D）...

私たちは、多重化されたマイクロスフェアベースの抗体アレイを用いて唾液タンパク質をプロファイリングするための手順を説明します。モノクローナル抗体は、共有結合、カルボジイミド化学反応を用いて、蛍光色素でエンコードされた4.5ミクロンのポリマー微小球にリンクされていた。修飾された微小球は、蛍光サンドイッチイムノアッセイを使用して、唾液中のタンパク質レベルを測定するために、光ファイバのマイクロウェル内に堆積した。

Herein, we describe a protocol for simultaneously measuring six proteins in saliva using a fiber-optic microsphere-based antibody array. The immuno-array ...

この手順の全体的な目的は、マイクロスフィアベースの蛍光アレイを用いて、ヒト唾液試料中の複数のタンパク質を分析することです。まず、2種類の蛍光色素を異なる量でマイクロスフィアにコード化します。次に、異なるタンパク質に対する捕捉抗体を、コード化されたマイクロスフィアに結合させます。次に、ファイバー optic バンドル上にマルチプレックスタンパク質マイクロアレイを構築し、構築されたマイクロアレイ上のサンドイッチ免疫測定法を用いて、テスト唾液サンプル中の複数のタンパク質を測定します。最終的に、蛍光顕微鏡による解析を行うことで、唾液サンプル中の異なるタンパク質のシグナル応答を測定できます。ELISAなどの既存の手法に対する本技術の主な利点は、複雑な生体試料中の複数のタンパク質を同時に解析できることです。この手法はヒト唾液の分析に有用ですが、血清、尿、喀痰などの他の体液にも適用可能です。琥珀色ガラスバイアルに opium TTA を量り取り、テトラヒドロフランを用いて 200 millimolar のストックソリューションを調製します。ピペッティングにより緩やかに混合し、染料が完全に溶解していることを目視で確認してください。同様に、ピペッティングで穏やかに混合し、12 millimolarのCoumarin 30ストック溶液を調製します。視覚的に、Dが完全に溶解していることを確認し、ボルテックスでマイクロスフィア懸濁液を混合した後、60 µLを1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。マイクロスフィアを洗浄するために、600 µLのPBSを加え、20回ピペッティングして混合し、10,000 RPMで3分間遠心分離します。テトラヒドロフラン溶液で3回洗浄した後、上清を除去し、ペレットを600 µLのワーキングソリューションに再懸濁させ、混合液を新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。マイクロ遠心チューブをパラフィルムで密封し、シェーカーに設置します。アルミホイルで覆い、遮光してください。コード化マイクロスフィア懸濁液 200 µLを、セーフロック付き1.5 mLマイクロ遠心チューブに加えます。 freshly prepared EDC溶液 150 µLを、滴下するように加えます。直ちにsulfa NHS溶液 150 µLを加えます。ピペッティングにより十分に混ぜ、懸濁液が均一であることを確認します。チューブにキャップをし、パラフィルムで密封してシェーカーに設置します。アルミホイルで覆い、遮光します。PBSSDSバッファーで3回洗浄後、ペレットを200 µLのPBSSDSバッファーミックスに懸濁させます。次に、60 µgの捕捉抗体を含む300 µLのPBSSDS緩衝液に溶液を移します。各種類のタンパク質捕捉マイクロスフィアを50 µLずつ、新しいオートクレーブ対応マイクロ遠心チューブに混合します。ストックマイクロスフィアプールを7,000 RPMで3分間遠心分離し、上清を100 µL残してすべて除きます。次に、光ファイバー束を約5 cmの長さに手でカットし、ダイヤモンドラッピングフィルムを使用して両端を順次研磨します。その後、研磨したファイバー束を脱イオン水中で2分間超音波洗浄します。粒子を取り除くため、0.5 mLのマイクロ遠心チューブに小型のマグネチックスターラーバーを入れます。タンパク質を含まない PBS バッファーを 400 µL 加え、マグネチックスターラーで 30 分間撹拌します。気泡を除去するため、研磨済みファイバーバンドルの片端を 0.025 N 塩化水素溶液で 150 秒間エッチングします。エッチングした N を直ちに脱イオン水に浸し、1 分間超音波処理します。次に、圧縮空気でファイバー束を乾燥させ、ファイバーホルダーに固定します。エッチングされた末端を、気泡やタンパク質を含まないPBSバッファーに1時間浸します。保存していたマイクロスフィア懸濁液を1 µL、ファイバーオプティック束のエッチングされた末端に滴下します。アルミホイルを巻いた箱でセットアップを遮光します。15分後、懸濁液の体積が蒸発によって減少し、マイクロスフィアがエッチングされたマイクロウェルへと押し込まれます。サンプル溶液を浸らせた綿棒を使用して、マイクロウェルに捕捉されていないマイクロスフェアを除去します。タンパク質マイクロアレイを使用可能な状態にするため、0.5 mLのオートクレーブ対応マイクロ遠心チューブに200 µLのサンプル溶液を加えます。ファイバーにロードされたタンパク質マイクロアレイを溶液に浸し、シェーカーの上に設置します。アルミホイルで覆い、遮光します。次に、プロテインマイクロアレイを200 µLの洗浄バッファーが入った新しいオートクレーブ対応マイクロ遠心チューブに浸し、600 RPMで2分間振盪させます。その後、ビオチン標識検出抗体とPBSブロッキングバッファーを含む100 µLの検出抗体カクテル溶液中で、マイクロアレイを30分間インキュベートします。室温・暗所にて、絶対エタノールを浸した綿棒でファイバー束の遠位端を洗浄します。次に、圧縮空気でファイバーの両端を乾燥させ、エピ蛍光顕微鏡にファイバーを装着し、ファイバーの遠位端を通して撮像し、opium TTAC 30およびSAPの蛍光発光強度に対応するマイクロスフィアの画像を収集します。ここでは、7種類のマイクロスフィアのエンコード画像を示します。UTTAエンコーディング画像では2つの強度レベルが観察され、これは異なる量のUTTA色素でエンコードされたマイクロスフェアに対応しています。C 30エンコーディング画像においても同様の結果が観察されます。MATLABによる画像解析により、シグナル画像における各マイクロスフェアの蛍光強度を算出することが可能です。デコードの結果を図2D sevenに示します。異なるマイクロ spheres が正常にデコードされました。アッセイバッファーでインキュベートした際、マイクロ spheres は反応を示しません。ヒト唾液サンプルでインキュベートすると、有意な蛍光反応が観察されます。より適切な比較を行うため、これら2つの図のコントラストは同じレベルに調整されています。この方法を習得すれば、ヒト唾液サンプル中の異なるタンパク質の再現性のある分析が可能になります。同一サンプルを用いた3回の独立した検出結果を示しています。このビデオを視聴することで、マイクロスフェアベースのマルチプレックスタンパク質マイクロアレイの調製方法と、それを用いた複雑な生物学的流体の分析方法について十分に理解できるはずです。この手順に従うことで、異なる複雑な生物学的流体に含まれる他のタンパク質バイオマーカーの分析も可能です。

multiplexed-fluorescent-microarray-for-human-salivary-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

我々は、オリゴヌクレオチド結合蛍光ビーズを用いて試料内の微生物の検出のための多重方法を説明します。サンプル内のすべての生物からのアンプリコンは、プローブ結合ビーズのパネルにハイブリダイズさせる。ルミネックスまたはバイオプレックス機器は、ビーズタイプとハイブリダイゼーションシグナルのための各ビーズを照会するために使用されます。...

オリゴヌクレオチド結合蛍光マイクロスフェアを使用して複雑な臨床及び環境試料中の細菌の多重検出

オンチップ光重合技術を用いた高分子マイクロアレイの形成の説明。原子間力顕微鏡、水接触角の測定値を使用して高スループット表面特性、飛行二次イオン質量分析法と細胞接着アッセイのX線光電子分光法と時間も記載されている。...

バイオマテリアルのハイスループット検出用高分子マイクロアレイ

ルミネックス社のXMAPのミクロスフィア技術を使用して、我々は様々な実験動物種のserosurveillanceの多重蛍光イムノアッセイ（MFIA）を開発しました。 MFIAは、抗原、組織制御や免疫グロブリンが共有結合し、色分けされたポリスチレン微小球にリンクされているサスペンションマイクロアレイである。...

多重化された蛍光イムノアッセイテスト方法とトラブルシューティング

このビデオは、ヒトの唾液中の複数の環境病原体に対する抗体を同時に検出するビーズベースのマルチプレックスイムノアッセイ技術を示しています。蛍光ビーズは、ヒト唾液サンプル中の抗体を用いて捕捉された異なる病原体由来の抗原に結合しました。蛍光レポーターを使用して抗体を標識した後、ビーズをフローサイトメトリーを使用して分析し、唾液中のさまざまな病原体特異的抗体の存在を評価しました。...

唾液中の病原体特異的抗体を同定するためのビーズベースのマルチプレックス免疫測定法

このプロトコルは、細胞シグナル伝達研究やバイオマーカー検出の潜在的なアプリケーションと大​​規模の製造、多重化された二次元のDNAまたは抗体配列​​を、概要を説明します。...

高密度バーコード抗体マイクロアレイのフローパターンガイド作製

液滴マイクロ流体における多色蛍光検出には、通常、かさばる複雑な落射蛍光顕微鏡ベースの検出システムが含まれます。ここでは、単一の光検出器によって収集されたマルチカラーデータを時間的にエンコードするために、光ファイバーのアレイを利用するコンパクトでモジュール化されたマルチカラー検出スキームについて説明します。...

光ファイバを用いて、液滴マイクロフルイディクスのための多色蛍光検出

現在の資源不足の状況では、研究者がより安価に、より速く、より正確に研究を行うことを可能にする新しい技術が出現しています。ここでは、複数の環境病原体へのヒトの曝露を同時に測定するためのビーズベースの唾液抗体マルチプレックス免疫測定法の開発について説明します。...

環境病原体に対するヒトの暴露を測定するために唾液抗体マルチプレックスイムノアッセイの開発

単に 2 つのスライドをスナップすることによって十字反応性無料多重サンドイッチ免疫測定を実行するためのスナップ チップ技術を紹介します。スナップの装置は、マイクロ アレイ-マイクロ アレイから試薬を確実に転送するために使用されます。スナップ...

架橋反応性無料、スポッター無料多重サンドイッチ免疫測定用チップをスナップします。

高スループットで新規受容体-リガンド相互作用の同定のため画面細胞外蛋白質のマイクロ アレイのプロトコルを紹介します。タンパク質マイクロ...

低親和性受容体-リガンド相互作用のハイスループット検出の細胞外タンパク質マイクロ アレイ技術

凍結組織に対してマルチスペクトルイメージングを行う迅速な染色法について述べます。...

凍結組織切片の多スペクトル蛍光イメージングの迅速な方法

このレポートでは、自動スライドステーナーでのマルチプレックス免疫蛍光(mIF)アッセイの自動化プロトコルについて説明します。これは、標準的なハイスループット組織オートステイナーおよびホールスライド蛍光イメージャーでの空間プロテオミクスの高い再現性を実証しており、トランスレーショナルリサーチにおける多数の組織スライドにわたるカスタムmIFアッセイに最適です。...

トランスレーショナルリサーチのためのハイスループット自動マルチプレックス免疫蛍光アッセイ(英語)

学ぶ 蛍光微小球アレイを用いたヒト唾液中の複数タンパク質同時分析法。光ファイババンドル上にマイクロアレイを構築し、サンドイッチ免疫測定で蛍光顕微鏡による検出を行う。ELISAに比べ高効率で、臨床診断への応用が期待される。

ポリマー微小球および光ファイババンドルを使用したヒト唾液タンパク質分析のための多重化された蛍光マイクロアレイ

さらに動画を探す