ポリマー微小球および光ファイババンドルを使用したヒト唾液タンパク質分析のための多重化された蛍光マイクロアレイ

この手順の全体的な目標は、マイクロスフェアベースの蛍光アレイを使用して、ヒトの唾液サンプル中の複数のタンパク質を分析することです。まず、ミクロスフェアを異なる量の2つの蛍光色素でコードします。異なるタンパク質の捕捉抗体をコード化されたマイクロスフェアに結合します。

次に、試験唾液サンプル中の複数のタンパク質について、組み立てられたマイクロアレイアッセイ上のサンドイッチイムノアッセイを使用して、マルチプレックス化されたタンパク質マイクロアレイを光ファイバーバンドル上に組み立てます。最終的には、蛍光顕微鏡による分析により、唾液サンプル中のさまざまなタンパク質のシグナル応答を測定できます。この手法がElizaのような既存の方法よりも優れている点は、複雑な生体液中の複数のタンパク質を同時に分析できることです。

この方法は、ヒトの唾液分析に関する洞察を得ることができますが、血清尿や喀痰などの他のバイオインフルエンザにも適用できます。琥珀色のガラスバイアルでアヘンTTAを秤量し、テトラヒドロフリンに200ミリモルのストック溶液を調製します。ピペッティングで穏やかに混合し、色素が完全に溶解していることを目視で確認します。

同様に、ピペッティングで穏やかに混合したCoumarin 30の12ミリモル原液を調製します。視覚。Dが渦流をマイクロスフェア懸濁液に完全に溶解したことを確認し、60マイクロリットルを1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。マイクロスフェアを洗浄するには、20回ピペッティングして混合したPBS600マイクロリットルを加え、10, 000RPMで3分間遠心分離します。

テトラハイドロフューリン溶液で3回洗浄した後、上清を取り除き、口蓋を600マイクロリットルの作業溶液に再懸濁し、混合物を新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。マイクロ遠心チューブをパラフィルムで密封し、シェーカーの上に置きます。アルミホイルで覆って光から保護します。

200マイクロリットルのエンコードされたマイクロスフィアサスペンションをセーフロック、1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに追加します。滴下する方法で、150マイクロリットル、新しく調製されたEDC溶液を追加しますすぐに150マイクロリットルのサルファNHS溶液を追加します。ピペッティングでよく混合し、懸濁液が均一であることを確認します。

チューブにキャップをし、パラフォームで密封し、シェーカーの上に置きます。アルミホイルで覆って光から保護します。P-B-S-S-D-Sバッファーreusを3回洗浄した後、ペレットを200マイクロリットルのP-B-S-S-D-Sバッファー混合物に懸濁します。

次に、溶液を60マイクログラムの捕捉抗体を含む300マイクロリットルのP-B-S-S-D-Sバッファーに移します。各タイプのタンパク質捕捉ミクロスフェアを50マイクロリットルを新しいオートクレーブマイクロ遠心チューブに混合します。ストックマイクロスフェアプールを7, 000 RPMで3分間遠心分離し、100マイクロリットルを除くすべての上清を除去します。

次に、光ファイバーの束を約5cmの長さに手作業でカットし、ダイヤモンドラッピングフィルムを使用して両端を順番に研磨します。次に、研磨した束を脱イオン水で2分間超音波処理します。粒子を除去するには、0.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に小さな磁気攪拌バーを入れます。

400マイクロリットルのプロテインフリーPBSバッファーを加え、磁気攪拌プレート上で30分間撹拌します。気泡を除去するには、研磨した繊維束の一端を0.025の通常の塩化水素溶液に150秒間エッチングします。直ちにエッチングされたNを脱イオン水に1分間沈め、超音波処理します。

次に、圧縮空気で繊維束を乾燥させ、繊維束を繊維ホルダーに取り付け、エッチングされた端を気泡のないタンパク質を含まないPBSバッファーで1時間ブロックし、光ファイバーバンドルのエッチングされた端に保存されたマイクロスフェアサスペンションの1マイクロリットルALIクワッドを堆積させます。アルミホイルで包まれたボックスでセットアップを光から保護します。15分後、懸濁液の体積は蒸発によって減少し、マイクロスフェアをエッチングされたマイクロウェルに押し込みます。

サンプル溶液で飽和させた綿棒を使用して、マイクロウェルに閉じ込められていないミクロスフェアを除去します。タンパク質マイクロアレイをすぐに使用できるようにするには、0.5ミリリットルのオートクレーブマイクロ遠心チューブに200マイクロリットルのサンプル溶液を追加します。ファイバーにロードしたタンパク質マイクロアレイを溶液に浸し、シェーカーに置きます。

アルミホイルで覆って光から保護します。次に、タンパク質マイクロアレイを200マイクロリットルの洗浄バッファーを含む新しいオートクレーブマイクロ遠心チューブに浸し、600RPMで2分間振とうします。次に、ビオチン化検出抗体とA PBSブロッキングバッファーを含む検出抗体カクテルの100マイクロリットル溶液でマイクロアレイをインキュベー

室温の暗所で、無水エタノールで飽和させた綿棒で繊維束の遠位端を清掃します。次に、ファイバーの両端を圧縮空気で乾燥させ、ファイバーをエピ蛍光顕微鏡に取り付け、ファイバーの遠位端を介して画像を取得し、アヘンTTAC 30およびSAP蛍光発光強度に対応するマイクロスフィア画像を取得します。ここでは、7種類のマイクロスフェアのエンコード画像を示します。

UTTA符号化画像では、異なる量のUTTAダイで符号化されたマイクロスフェアを表す2つの強度レベルが観察されます。これは、C 30符号化画像でも同様の結果が観察されます。MATLAB 画像解析では、信号画像内のさまざまな微小球の蛍光強度を計算できます。デコード結果を図 2D 7 に示します。

異なるミクロスフェアが正常にデコードされます。マイクロスフェアは、アッセイバッファーとインキュベートしても反応を示しません。ヒトの唾液サンプルとインキュベートすると、有意な蛍光応答が観察されます。

より比較しやすいように、これら2つの図のコントラストは同じレベルに調整されています。この方法を習得すると、ヒト唾液サンプル中のさまざまなタンパク質の再現性のある分析が可能になります。同じサンプルに対する3つの独立した検出の結果が示されています。

このビデオを見れば、マイクロスフェアベースのマルチプレックスタンパク質マイクロレイを調製し、複雑な生体液分析に使用する方法について十分に理解できるはずです。この手順に従います。さまざまな複雑な生体液中の他のタンパク質バイオマーカーも分析できます。