ポリマー微小球および光ファイババンドルを使用したヒト唾液タンパク質分析のための多重化された蛍光マイクロアレイ
October 10th, 2013
私たちは、多重化されたマイクロスフェアベースの抗体アレイを用いて唾液タンパク質をプロファイリングするための手順を説明します。モノクローナル抗体は、共有結合、カルボジイミド化学反応を用いて、蛍光色素でエンコードされた4.5ミクロンのポリマー微小球にリンクされていた。修飾された微小球は、蛍光サンドイッチイムノアッセイを使用して、唾液中のタンパク質レベルを測定するために、光ファイバのマイクロウェル内に堆積した。
この手順の全体的な目標は、マイクロスフェアベースの蛍光アレイを使用して、ヒトの唾液サンプル中の複数のタンパク質を分析することです。まず、ミクロスフェアを異なる量の2つの蛍光色素でコードします。異なるタンパク質の捕捉抗体をコード化されたマイクロスフェアに結合します。
次に、試験唾液サンプル中の複数のタンパク質について、組み立てられたマイクロアレイアッセイ上のサンドイッチイムノアッセイを使用して、マルチプレックス化されたタンパク質マイクロアレイを光ファイバーバンドル上に組み立てます。最終的には、蛍光顕微鏡による分析により、唾液サンプル中のさまざまなタンパク質のシグナル応答を測定できます。この手法がElizaのような既存の方法よりも優れている点は、複雑な生体液中の複数のタンパク質を同時に分析できることです。
この方法は、ヒトの唾液分析に関する洞察を得ることができますが、血清尿や喀痰などの他のバイオインフルエンザにも適用できます。琥珀色のガラスバイアルでアヘンTTAを秤量し、テトラヒドロフリンに200ミリモルのストック溶液を調製します。ピペッティングで穏やかに混合し、色素が完全に溶解していることを目視で確認します。
同様に、ピペッティングで穏やかに混合したCoumarin 30の12ミリモル原液を調製します。視覚。Dが渦流をマイクロスフェア懸濁液に完全に溶解したことを確認し、60マイクロリットルを1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。マイクロスフェアを洗浄するには、20回ピペッティングして混合したPBS600マイクロリットルを加え、10, 000RPMで3分間遠心分離します。
テトラハイドロフューリン溶液で3回洗浄した後、上清を取り除き、口蓋を600マイクロリットルの作業溶液に再懸濁し、混合物を新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。マイクロ遠心チューブをパラフィルムで密封し、シェーカーの上に置きます。アルミホイルで覆って光から保護します。
200マイクロリットルのエンコードされたマイクロスフィアサスペンションをセーフロック、1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに追加します。滴下する方法で、150マイクロリットル、新しく調製されたEDC溶液を追加しますすぐに150マイクロリットルのサルファNHS溶液を追加します。ピペッティングでよく混合し、懸濁液が均一であることを確認します。
チューブにキャップをし、パラフォームで密封し、シェーカーの上に置きます。アルミホイルで覆って光から保護します。P-B-S-S-D-Sバッファーreusを3回洗浄した後、ペレットを200マイクロリットルのP-B-S-S-D-Sバッファー混合物に懸濁します。
次に、溶液を60マイクログラムの捕捉抗体を含む300マイクロリットルのP-B-S-S-D-Sバッファーに移します。各タイプのタンパク質捕捉ミクロスフェアを50マイクロリットルを新しいオートクレーブマイクロ遠心チューブに混合します。ストックマイクロスフェアプールを7, 000 RPMで3分間遠心分離し、100マイクロリットルを除くすべての上清を除去します。
次に、光ファイバーの束を約5cmの長さに手作業でカットし、ダイヤモンドラッピングフィルムを使用して両端を順番に研磨します。次に、研磨した束を脱イオン水で2分間超音波処理します。粒子を除去するには、0.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に小さな磁気攪拌バーを入れます。
400マイクロリットルのプロテインフリーPBSバッファーを加え、磁気攪拌プレート上で30分間撹拌します。気泡を除去するには、研磨した繊維束の一端を0.025の通常の塩化水素溶液に150秒間エッチングします。直ちにエッチングされたNを脱イオン水に1分間沈め、超音波処理します。
次に、圧縮空気で繊維束を乾燥させ、繊維束を繊維ホルダーに取り付け、エッチングされた端を気泡のないタンパク質を含まないPBSバッファーで1時間ブロックし、光ファイバーバンドルのエッチングされた端に保存されたマイクロスフェアサスペンションの1マイクロリットルALIクワッドを堆積させます。アルミホイルで包まれたボックスでセットアップを光から保護します。15分後、懸濁液の体積は蒸発によって減少し、マイクロスフェアをエッチングされたマイクロウェルに押し込みます。
サンプル溶液で飽和させた綿棒を使用して、マイクロウェルに閉じ込められていないミクロスフェアを除去します。タンパク質マイクロアレイをすぐに使用できるようにするには、0.5ミリリットルのオートクレーブマイクロ遠心チューブに200マイクロリットルのサンプル溶液を追加します。ファイバーにロードしたタンパク質マイクロアレイを溶液に浸し、シェーカーに置きます。
アルミホイルで覆って光から保護します。次に、タンパク質マイクロアレイを200マイクロリットルの洗浄バッファーを含む新しいオートクレーブマイクロ遠心チューブに浸し、600RPMで2分間振とうします。次に、ビオチン化検出抗体とA PBSブロッキングバッファーを含む検出抗体カクテルの100マイクロリットル溶液でマイクロアレイをインキュベー
トします。室温の暗所で、無水エタノールで飽和させた綿棒で繊維束の遠位端を清掃します。次に、ファイバーの両端を圧縮空気で乾燥させ、ファイバーをエピ蛍光顕微鏡に取り付け、ファイバーの遠位端を介して画像を取得し、アヘンTTAC 30およびSAP蛍光発光強度に対応するマイクロスフィア画像を取得します。ここでは、7種類のマイクロスフェアのエンコード画像を示します。
UTTA符号化画像では、異なる量のUTTAダイで符号化されたマイクロスフェアを表す2つの強度レベルが観察されます。これは、C 30符号化画像でも同様の結果が観察されます。MATLAB 画像解析では、信号画像内のさまざまな微小球の蛍光強度を計算できます。デコード結果を図 2D 7 に示します。
異なるミクロスフェアが正常にデコードされます。マイクロスフェアは、アッセイバッファーとインキュベートしても反応を示しません。ヒトの唾液サンプルとインキュベートすると、有意な蛍光応答が観察されます。
より比較しやすいように、これら2つの図のコントラストは同じレベルに調整されています。この方法を習得すると、ヒト唾液サンプル中のさまざまなタンパク質の再現性のある分析が可能になります。同じサンプルに対する3つの独立した検出の結果が示されています。
このビデオを見れば、マイクロスフェアベースのマルチプレックスタンパク質マイクロレイを調製し、複雑な生体液分析に使用する方法について十分に理解できるはずです。この手順に従います。さまざまな複雑な生体液中の他のタンパク質バイオマーカーも分析できます。
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概要
この記事では、マイクロビーズベースの抗体アレイを使用して唾液タンパク質をプロファイリングする手順について説明します。この方法により、人間の唾液サンプル中の複数のタンパク質を同時に分析でき、従来のアッセイの能力を向上させます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- バイオテクノロジー
- プロテオミクス
背景
- 唾液には健康と疾患に関する洞察を提供する様々なタンパク質が含まれています。
- ELISAのような従来の方法は、一度に一つのタンパク質を分析することに限られています。
- 複数化アッセイは効率とデータの豊富さを改善できます。
- 蛍光マイクロビーズ技術はタンパク質検出の新しいアプローチを提供します。
研究の目的
- 唾液中の複数のタンパク質を同時に分析する手法を開発すること。
- 複雑な生体液中のタンパク質検出の感度と特異性を向上させること。
- 既存の単一分析物アッセイよりも効率的な代替手法を提供すること。
使用された方法
- 蛍光染料でマイクロビーズをエンコードすること。
- マイクロビーズに捕捉抗体を共有結合させること。
- ファイバーオプティックバンドル上に複数化タンパク質マイクロアレイを組み立てること。
- 蛍光サンドイッチイムノアッセイを使用して唾液サンプル中のタンパク質を検出すること。
主な結果
- この方法は唾液サンプル中の複数のタンパク質を成功裏に検出しました。
- 蛍光顕微鏡は異なるタンパク質に対して明確なシグナル応答を提供しました。
- この技術は従来のELISA方法に比べて利点を示しました。
- 結果は臨床診断への応用可能性を示しています。
結論
- この複数化アプローチにより唾液タンパク質の効率的な分析が可能になりました。
- この方法は様々な健康状態の理解を促進する可能性があります。
- 将来の研究では、この技術の他の生体液への応用を拡大する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Multiplexed protein analysis in complex biofluids like saliva addresses a critical bottleneck in biomarker discovery, where traditional single-plex assays limit throughput and increase sample consumption. This microsphere-based fiber-optic array enables simultaneous quantification of multiple salivary proteins, improving assay efficiency and supporting early-stage target validation in neurodegenerative and inflammatory disease research. By providing quantitative, reproducible readouts from limited clinical samples, the method enhances predictive confidence in lead identification and preclinical de-risking workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring multiple salivary protein biomarkers simultaneously in disease-relevant samples.
- Operational Value: Reduces sample volume requirements and assay timelines through parallel protein detection in a single workflow.
- Predictive Value: Supports biomarker panel development and functional target validation by correlating multi-analyte responses with phenotypic outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative fluorescence readouts for six proteins using encoded microspheres, enabling reproducible assay performance across runs.
- Operational Value: Facilitates assay standardization via fiber-optic bundle immobilization and automated decoding algorithms, reducing user-dependent variability.
- Scalability: Supports platform reuse for other biofluids (serum, urine, sputum) as noted in the transcript, extending utility beyond saliva.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by providing clinically relevant salivary protein data that can inform mechanistic models.
- Mechanistic De-risking: Enables pathway-level analysis through multiplexed detection, reducing ambiguity in target engagement and biological response assessments.
- Predictive Confidence: Delivers quantitative, fluorescence-based signal responses that support go/no-go decisions in early preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through assay development to preclinical mechanistic studies, particularly for biomarker-driven programs in neurology and inflammation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling simultaneous measurement of multiple salivary proteins linked to disease states.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized microsphere encoding, fiber-optic array assembly, and fluorescence-based quantification compatible with high-content imaging.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (fluorescence intensity per microsphere type) that allow comparison across experimental conditions and sample groups.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via disease-relevant salivary biomarkers that reflect systemic or local pathophysiological processes.
- Enterprise Reuse: Encodes a adaptable microsphere-based platform applicable to multiple complex biofluids, supporting cross-project standardization and reagent sharing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through multiplexed, quantitative protein detection in native biofluids.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via fiber-optic immobilization and algorithmic decoding, reducing technical noise.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by maximizing data yield per sample and enabling reuse across biomarker programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering multi-analyte profiles that inform mechanistic and safety-related decision-making.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsphere encoding, antibody conjugation, and fluorescence microscopy for successful assay setup and optimization.
- Dependent on fluorescence microscopy and MATLAB-based image analysis infrastructure for signal acquisition and decoding.
- Necessitates cross-team standardization of microsphere preparation, fiber-optic handling, and assay protocols to ensure reproducibility across sites.
- Adaptation to other model systems (e.g., serum, urine) requires re-validation of encoding stability and antibody performance in differing matrices.
- Practical limitations include potential microsphere leakage from microwells and signal variability due to incomplete washing or evaporation during array assembly.
