変換にマトリックス支援レーザー脱離/イオンイメージングのためのマトリックスとしてジスラノールはイオンサイクロトロン共鳴質量分析計をフーリエ

この手順では、マトリックス支援レーザー脱離電離（MALDI）質量分析イメージング技術を用いて、ウシの水晶体内の複数の内在性脂質を空間的に局在化させます。まず、ウシの水晶体組織の薄切片を作製してマルチマトリックスを塗布し、その後、MALDI質量スペクトルデータセットを取得します。

データセットを処理し、水晶体組織切片で検出された脂質の視覚的表現を作成します。これらの結果を合わせることで、ウシの水晶体における脂質の部位と相対的な存在量を決定し、その分布を視覚的に表現できます。脂質抽出後のLCMS分析などの他の手法と比較して、MALDI質量分析イメージングでは、空間的な局在性を失うことなく、複数の脂質を同時に可視化することが可能です。急速凍結した組織検体を-80°Cの保存状態から取り出します。

ウシの生後間もない子牛の水晶体全層切片を固定するため、レンズ表面から水晶体包を removes します。クライオスタットの組織切断ステージ上に、水を1、2滴滴下します。クライオスタットが最適温度に到達し、水が凝固する前に、速やかに水晶体を水の中に配置してください。

組織を赤道方向に20 micronの厚さで切片化します。最初の数枚の切片は廃棄し、眼水晶体組織のイメージングには、赤道面に近いか、または赤道面を含む切片のみを使用してください。ITOコートガラススライドの表面を事前に濡らすため、ギ酸を1.5 µL加えます。

次に、組織切片をクライオスタット内のスライドに慎重に転移させます。続いて、MALDIマトリックスを塗布する前に、スライドを15分間凍結乾燥させます。修正液ペンを用いて、ITOコーティングガラススライドの非導電面に向きを特定するための印を3か所付けます。

次に、フラットベッドスキャナーを使用して組織スライドの光学画像を取得し、TIFFやjpegなどの適切な形式で保存します。まず、マトリックスがスライドの端にコーティングされないよう、ITOコートガラススライド前面の端をテープで覆います。使用するマトリックスを適切な溶媒で調製します。

次に、組織切片の表面にマトリックス溶液を適用します。マトリックスコーティングを20サイクル行い、ガラススライドを被覆します。溶媒が電子マトリックススプレーヤーと不適合な場合は、代わりに空気圧駆動式エアブラシスプレーヤーを使用してマトリックスを適用することができます。

質量校正溶液として、ESチューニングミックス標準溶液を60% Isopropanolで1:200に希釈し、希釈したESチューニングミックス溶液を2 µL/minでfour a transform ion cyclotron resonance msのデュアルモードエレクトロスプレーイオン化イオン源に導入します。FT-ICR装置を、広帯域検出およびデータ収集サイズ1024 kB/sの正イオンESIモードで動作させます。通常、ESIパラメータはキャピラリーエレクトロスプレー電圧を3,900 Vに設定します。

スプレーシールド電圧を3,600 Vに、ネブライザー窒素ガス流量を2 L/minに設定します。乾燥窒素ガス流量を4 L/minに、温度を200 °Cに設定します。また、スキマー1電圧を15 Vに設定します。

飛行時間を0.01秒に、衝突アルゴンガス流量を0.4 L/sに、ソースイオン蓄積時間を0.1秒に、および衝突セルイオン蓄積時間を0.2秒に設定します。次に、良好な時間領域自由誘導減衰信号を維持しつつ、質量電荷比200から1400の質量範囲で分析感度を最大化するように、FT-ICRの動作パラメータを調整します。その後、ESIマススペクトルを取得し、Eesチューニングミックス溶液中の標準化合物の参照質量を用いて装置を校正します。

MALDI動作に向けて装置を調整するため、1 µM ずつに調整したturineとINE標準物質の混合標準溶液の1 µL 分注液を数サンプル分、マトリックス溶液に溶解し、これらの溶液をサンプル組織切片の1か所に直接スポットします。スライドを組織スライドアダプターにセットし、アダプターのMALDI側からデュアルESI/MALDIイオン源にロードします。次に、各マススキャンにおけるMALDI信号蓄積のためのレーザー出力およびレーザーショット数の適切なMALDI動作パラメータを最適化します。

MALDI MSI実験に向けて装置のチューニング、校正、および最適化を行った後、イメージングソフトウェア内で、イメージング対象の組織切片の物理的な位置を、記録された光学画像と合わせます。3点三角測量法を用いて、3つの修正液によるマーキングの位置を合わせます。その後、同時ESI MALDI操作を開始し、各マススペクトルにE ESチューニングミックス溶液のリファレンス質量ピークが含まれるようにして、データ取得後の内部質量校正を行います。

まず、ESIの信号を減衰させるため、キャピラリー電圧を下げて、内部質量校正に十分なESIキャリバー信号を維持しつつ、MALDI信号がスペクトルで支配的になるように調整します。次に、レーザー照射の自動走査法を設定します。ランダムスポット分析を用います。

イメージングを行う組織領域を定義し、適切なレーザーRAステップサイズを設定します。最初の比較には内部校正を用いてMALDIマススペクトルを校正し、MS/MSデアイソトープ用のピークを選択します。また、カスタマイズしたVBAスクリプトを使用してモノアイソトピックピークを選択し、得られたモノアイソトピックピークリストをエクスポートします。測定された質量電荷比（m/z）の値をMetlinまたはHMDBメタボロームデータベースに入力し、ライブラリエントリーとのマスマッチングを行います。

次に、イメージングソフトウェアを用い、ピーク頂点における質量フィルター幅を1 ppmに設定して、組織切片全体で検出されたすべての脂質エンティティのMALDIイメージを生成します。データベースのエントリと一致するすべての質量電荷比（m/z）値のイメージを生成した後、その他のすべてのピークについてもイメージを生成し、牛の水晶体などの特定の組織において、後で調査可能な固有の分布パターンがないかを確認します。なお、直接解凍してマウントする方法を用いると、組織に激しい裂傷が観察されることがよくあります。

エタノールまたはギ酸を用いてIT OASスライドを前処理することは、組織標本のマウント中の完全性を維持するのに役立ちます。マトリックスの選択と溶媒の選択は、どちらもMALDIスペクトルの品質に影響を与える重要な要因です。これらの例では、ジオールに対して効率的なマトリックス溶媒を用いたスペクトルと、不適切なマトリックス溶媒を用いたスペクトルの比較を示しています。

Maldi MSI実験による一連のマススペクトルが取得されると、検出された各イオンの画像を作成できます。各ピクセルは組織切片表面のレーザー照射スポットを表しており、組織切片の異なる部位における分析物の相対的な濃度を詳細に把握することが可能です。

ほとんどの実験において、データは各スペクトルの全イオン電流で正規化されます。この正規化を行わないと、分析物のマトリックスが良好な領域やCOC結晶化により分析物のシグナルが強くなる可能性があり、データに偏りが生じます。また、組織標本の作製方法によっても、得られる画像が劇的に変化することがあります。

サンプルが濡れすぎていると、分析物が組織上で拡散し、空間情報の多くが失われてしまいます。眼水晶体を用いた組織イメージング実験のこのデモンストレーションでは、F-T-I-C-R-M-Sによって脂質の空間分布を決定するために、マルチマトリックスとしてジオールを使用しました。さまざまな種類の組織における脂質のイメージングは、ジオールまたは他のマトリックスを用いて同様の方法で実施可能です。