変換にマトリックス支援レーザー脱離/イオンイメージングのためのマトリックスとしてジスラノールはイオンサイクロトロン共鳴質量分析計をフーリエ
2013年11月26日
ジスラノール（DT、1,8 - ジヒドロキシ-9,10 - ジヒドロアントラセン-9 - オン）は、以前に小分子の組織イメージングのためのMALDIマトリックスとして報告されている上に、内因性脂質のMALDIイメージングのためのDTの使用のためのプロトコル超高分解能四重極-FTICR機器上の正イオンMALDI-MSによる組織切片の表面は、ここで提供される。
この手順では、ウシの水晶体内の複数の内因性脂質を空間的に局在化します。マトリックス支援レーザー脱着イオン化の技術を使用して、質量分析イメージング。まず、薄いウシ水晶体組織切片を作製し、multi matrixxを適用してから、maldi質量スペクトルデータセットを取得します。
データセットを処理して、水晶体組織切片で検出された脂質を視覚的に表現します。これらの結果を組み合わせることで、ウシのレンズ内の脂質の位置と相対的な存在量を決定し、この分布を視覚的に表現することができます脂質抽出とLCMS分析などの他の方法と比較して、マルディ質量分析イメージングは、空間的な局在を失うことなく複数の脂質を同時に視覚化することができます。フラッシュ凍結した組織標本をマイナス80°Cの保管から取り出します。
レンズの表面からカプセルを取り外して、ウシのふくらはぎのレンズ部分全体を固定します。クライオスタットの組織切断ステージに1滴または2滴の水を置きます。クライオスタットが最適な温度に平衡化したら、レンズが固まる前にレンズを水中にすばやく置きます。
組織を赤道方向に20ミクロンの厚さのセクションに切断します。最初の組織切片を破棄し、眼球体組織のイメージングには赤道面に近いスライスまたは赤道面を追加するスライスのみを使用します。1.5マイクロリットルのギ酸を加えて、ITOコーティングされたスライドガラスの表面を事前に濡らします。
次に、組織切片をクライオスタット内のスライドに慎重に移します。次に、マルディマトリックスを適用する前に、スライドを15分間凍結乾燥します。修正液ペンを使用して、ITOコーティングされたスライドガラスの非導電性表面に3つのティーチングマークを追加します。
次に、フラットベッドスキャナーを使用して組織スライドの光学画像を撮影し、TIFFやjpegなどの適切な形式で保存します。まず、ITOコーティングされたスライドガラスの前面の端をテープで覆い、マトリックスがスライドの端をコーティングしないようにします。適切な溶媒で使用するマトリックスを調製します。
次に、組織切片の表面にマトリックス溶液を塗布します。スライドガラスを20サイクルのマトリックスコーティングを使用してコーティングします。あるいは、溶媒が電子マトリックス噴霧器と互換性がない場合、空気圧アシストエアブラシ噴霧器を使用してマトリックスを塗布することもできます。
質量校正溶液については、ESチューニングミックス標準溶液を60%で1〜200倍に希釈しますイソプロパノールは、希釈されたESチューニングミックス溶液の1分あたり2マイクロリットルをデュアルモードエレクトロスプレーイオン化イオン源に導入し、4つの変換イオンサイクロトロン共鳴ms.広帯域検出と1024キロバイトのデータ収集サイズを備えたポジティブイオンESIモードでF-T-I-C-R装置を操作します秒速。通常、ESIパラメータは3、900ボルトのキャピラリーエレクトロスプレー電圧に設定します。
3, 600ボルトの噴霧シールド電圧ネブライザー窒素ガスは、毎分2リットルで流れます。乾燥窒素ガスは毎分4リットル、温度は摂氏200度で流れます。また、スキマーの電圧を15ボルトに設定します。
飛行時間は0.01秒、衝突アルゴンガスの流れは毎秒0.4リットル、ソースイオン蓄積時間は0.1秒、衝突セルイオン蓄積時間は0.2秒です。次に、F-T-I-C-R操作パラメータを調整して、質量電荷比200から1400までの質量範囲で分析感度を最大化し、良好な時間領域フリー誘導減衰信号を維持します。次に、ESI質量スペクトルを取得し、E esチューニングミックス溶液中の標準化合物の参照質量を使用して装置をキャリブレーションします。
MALDI操作用に装置を調整するには、混合トゥリンとINE標準溶液の1マイクロリットルアリコートをそれぞれ1マイクロモルの濃度でマトリックス溶液に溶解し、これらの溶液をサンプル組織切片の1つに直接スポットします。スライドをティッシュスライドアダプターに入れ、MALDI側からデュアルESIマルディイオン源にアダプターをロードします。次に、各マススキャンのレーザー出力とMALDI信号蓄積のレーザーショット数に適切なMALDI動作パラメータを最適化します。
maldi MSI実験用に装置をチューニング、キャリブレーション、最適化した後、イメージングソフトウェア内で記録された光学画像とイメージングする組織切片の物理的な位置を位置合わせします。3 点三角測量法を使用して、3 つの補正液マーキングを位置合わせします。次に、ESI MALDIの同時操作を開始し、各マススペクトルにE ESチューニングミックス溶液のリファレンスマスピークが含まれるようにして、取得後の内部質量キャリブレーションを行います。
まず、MALDI信号がスペクトルを支配するまでキャピラリー電圧を下げてESI信号を減衰させますが、ESIキャリバー信号は内部質量キャリブレーションに十分な高さです。次に、放射線のレーザーの自動レイシング方法を設定します。ランダム スポット分析を使用します。
イメージングする組織領域を定義し、適切なレーザーRAステップサイズを設定します。初期比較のために内部キャリブレーションを使用してMALDIマススペクトルをキャリブレーションし、MSMSデ同位体のピークを選択し、カスタマイズされたVBAスクリプトを使用してモノ同位体ピークを選択し、結果のモノアイソトピックピークリストをエクスポートします。測定した質量と電荷比の値をMelin nineおよびHMDBメタボロームデータベースに入力し、ライブラリエントリと質量をマッチングします。
次に、ピーク頂点で質量フィルター幅が100万分の1のイメージングソフトウェアを使用して、組織切片全体で検出されたすべての脂質エンティティのマルディ画像を生成します。データベースエントリに一致するすべての質量電荷比の値について画像が生成されると、他のすべてのピークについても画像が生成され、ウシのレンズなどの特定の組織について後で調査できる独自の分布パターンを探します。組織の広範な裂傷は、直接融解マウントを使用するとよく観察されます。
エタノールまたはギ酸を使用したIT OASスライドのプレコは、組織マウント中に組織切片の完全性を維持するのに役立ちます。マトリックスの選択と溶媒の選択は、MALDIスペクトルの品質に影響を与える重要な要素です。これらの例では、効率的なマトリックス溶媒で生成されたスペクトルと、ジオールのマトリックス溶媒の選択が不十分な場合を比較しています。
Maldi MSI実験からマススペクトルのセットが取得されると、検出された各イオンの画像を生成できます。各ピクセルは、組織切片の表面からのレーザー照射スポットを表しています。分析種の相対濃度は、組織切片のさまざまな部分で詳細に説明できます。
ほとんどの実験では、データは各スペクトル内の総イオン電流で正規化されます。この正規化領域とより優れた分析種マトリックスがないと、COCの結晶化により分析物のシグナルが強くなり、データが歪む可能性があります。また、組織の準備は、生成される画像を劇的に変えることもあります。
サンプルが湿りすぎると、分析物が組織上で非局在化し、空間情報の多くが失われます。この眼レンズでの組織イメージング実験のデモンストレーションでは、ジオールをマルチMatrixxとして使用して、F-T-I-C-R-M-Sによる脂質の空間分布を決定しました。異なる種類の組織における脂質のイメージングは、同様の方法でジオールまたは別のマトリックスを使用して達成できます。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
この研究は、ウシのレンズ組織における内因性脂質のイメージングのためのMALDIマトリックスとして、ジトラノール（DT）を使用するプロトコルを提示します。この方法により、空間的文脈を失うことなく、複数の脂質の空間的局在化が可能になります。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生化学
- 質量分析
背景
- ジトラノールは以前からMALDIマトリックスとして使用されてきました。
- MALDIイメージングは組織内の小分子分析を可能にします。
- 内因性脂質は生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たします。
- 従来の脂質分析方法では空間情報を失う可能性があります。
研究の目的
- MALDIイメージングにおけるDTの使用のための詳細なプロトコルを提供すること。
- ウシのレンズ組織における脂質の分布を視覚化すること。
- MALDIイメージングを従来の脂質抽出法と比較すること。
使用した方法
- 薄いウシのレンズ組織切片の準備。
- MALDIイメージングのためのマルチマトリックスの適用。
- MALDI質量スペクトルデータセットの取得。
- 脂質分布の視覚的表現へのデータセットの処理。
主な結果
- 複数の内因性脂質の成功的な局在化。
- 脂質の存在量と分布の視覚的表現。
- LCMSに対する空間的局在化の利点の証明。
- ウシのレンズ内の脂質の役割に関する洞察。
結論
- DTを使用したMALDIイメージングは脂質分析に効果的です。
- この方法は脂質の空間情報を保持します。
- 様々な生物学的研究分野での応用可能性。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Matrix-assisted laser desorption/ionization imaging (MALDI-IMS) enables spatial mapping of endogenous lipids in tissue sections, supporting target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. The use of dithranol as a matrix on ultrahigh-resolution FTICR-MS improves detection of low-molecular-weight compounds while reducing chemical noise, enhancing predictive confidence in lipid biomarker identification. This approach supports assay development and screening readiness by providing reproducible, label-free molecular distributions directly from tissue, informing go/no-go decisions in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of lipid-mediated therapeutic hypotheses by mapping endogenous lipid distributions in disease-relevant tissue models.
- Operational Value: Provides label-free, spatially resolved lipid profiles that support functional target validation and pathway de-risking.
- Predictive Value: Increases confidence in lipid target selection by reducing false positives from matrix interference through high-resolution FTICR-MS detection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, multiplexed lipid readouts from single tissue sections, enabling parallel compound screening without spatial information loss.
- Operational Value: Delivers reproducible MALDI-IMS data through standardized matrix application (e.g., dithranol in solvent) and instrument calibration protocols.
- Assay Readiness: Supports scalable lipid screening workflows by producing stable, high-fidelity mass spectra suitable for database matching and image generation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery-phase lipid localization to preclinical validation by preserving spatial context lost in extraction-based methods like LCMS.
- Mechanistic De-risking: Clarifies lipid roles in tissue physiology (e.g., bovine lens) to inform biomarker relevance and pathway modulation strategies.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on spatially resolved lipid modulation patterns, reducing late-stage attrition due to unanticipated tissue-specific effects.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical evaluation by providing spatially resolved lipid data that informs mechanistic understanding and assay design.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing endogenous lipid dynamics in tissue sections.
- Screening: Enables assay-ready, reproducible lipid profiling via standardized matrix application and FTICR-MS data acquisition.
- Analytics: Delivers high-resolution mass measurements (1 ppm mass filter width) and isotopic peak selection for confident lipid identification via HMDB or METLIN database matching.
- Translational Research: Maintains spatial continuity from discovery to preclinical work by avoiding analyte delocalization during tissue processing.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable MALDI-IMS platform for lipid screening across tissue types, reducing reliance on destructive extraction methods.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence by reducing matrix background and resolving analyte signals via FTICR-MS.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized tissue preparation, matrix coating (20 cycles), and internal calibration using ES tuning mix.
- Strategic Value: Increases capital efficiency by enabling parallel lipid detection in single experiments, reducing need for sequential LCMS runs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by revealing tissue-specific lipid distributions that inform target safety and efficacy profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue cryosectioning, matrix application, and FTICR-MS operation in dual ESI/MALDI mode.
- Depends on access to ultrahigh-resolution FTICR-MS instrumentation and optimized laser parameters for MALDI signal accumulation.
- Necessitates cross-team standardization of tissue mounting (e.g., ITO slide pre-wetting with formic acid) to prevent delocalization.
- Involves adaptation considerations for solvent-matrix compatibility (e.g., avoiding solvents that cause tissue tearing during thaw mounting).
- Limited by tissue integrity challenges during preparation, which can be mitigated by pre-coating slides with ethanol or formic acid.
