Name: 腸管上皮細胞の腸内細菌の侵入インビトロ劇的垂直拡散室モデルを用いた強化され (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 学ぶVDCモデルを用いた腸管上皮細胞と細菌の共培養法。Caco-2細胞とCampylobacter jejuniを微好気・好気条件下で培養し、細菌の接着と侵入を定量化する生理学的に関連性の高いin vitro系を構築します。

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ドミニクミルズはブルームズベリー大学博士学生の身分（2007-2010年）のによってサポートされていました。著者は、VDCのモデルを開発する上で彼らの支援のためにルブラGundogduとアブディエルミ両方に感謝したいと思います。

1。特別な0.4μmのフィルタでIECの単分子膜の成長<ol><li> 10％（v / v）のウシ胎児血清、100 U / mlのペニシリン、100μg/mlの/ mlのストレプトマイシンおよび1％（v / v）の内の非必須アミノ酸を補充したダルベッコ改変必須培地で培養のCaco-2細胞（DMEM） 37℃で標準組織培養インキュベーター℃、5％CO 2、95％空気中のC。種子は、0.4μmのあたり4×10 5のCaco-2 IECSは2〜3日ごとにメディアを変え、21日間にわたってフィルタと偏光に成長。 </li><li>ボルト - オーム抵抗計を用いて単層の偏光状態を確認するTEERを測定する。我々の研究では、21日のTEERはのCaco-2これらの0.4μmのフィルタで増殖した細胞は700-800Ωcmで2です。 </li></ol> 2。 C.の調製ジェジュニと共培養アッセイ用細菌培地<ol><li> VDCの共培養アッセイの所望の出発点の前に24時間は、Cの新鮮な血液寒天プレートの準備。 37℃ジェジュニとインキュベート℃の可変雰囲気インキュベーターで微好気条件（85％N 2、5％O 2、10％CO 2）下。 </li><li>同時に、可変雰囲気のインキュベーター中で微好気条件下で37℃でブルセラ菌培養液を30mlのpreinc​​ubate。 </li></ol> 3。アッセイに先立ちVDCハーフチェンバースの準備と滅菌<ol><li>完全に浸すVDC半分室と同様、Oリング、滅菌溶液中のプラグ。 </li><li>無菌の20ml注射器を使用して、半室の両方でガス注入口を通して殺菌液をフラッシュします。これを怠ると、共培養中に、サンプルの汚染が発生することがあります。 </li><li> &gt; 1時間消毒液に浸漬し、すべてのコンポーネントにしておきます。 </li><li>ガス注入口を洗浄するための別の滅菌20ミリリットル注射器を使用して、新鮮な滅菌水ですべてのコンポーネントをすすぐ。 </li></ol> 4。準備細菌接種の<ol><li> Cの半分のプレートを収穫血液寒天プレートからジェジュニの成長は前インキュベートブルセラブロス1mlのに前日用意しました。これは、〜10 10 CFU / mlに得られるはず。 </li><li>細菌のコロニー形成単位（CFUの）をsemiquantifyする600nmで細菌懸濁液の光学密度を測定します。 </li><li>プレインキュベートブルセラブロス4mlの中で希望の接種レベルに細菌懸濁液を調整します。 </li><li>その後接種に存在する細菌のCFUの数を定量化するために48時間変数雰囲気インキュベーター中37℃でインキュベート三重における血液寒天プレート上で適切な希釈のメッキに続いて、この最後の細菌懸濁液からの段階希釈を行います。 </li></ol> 5。 VDCを設定する<ol><li>ベンチの上にVDCフラットの下半分室を配置します。下半分室にOリングを取り付けます。 </li><li> TからIECSを運ぶつのフィルタを切り離す彼のキャリアとは、無菌のPBSを400μlで3回洗浄する。 Oリングが所定の位置に残っていることを確認し、下半分室の上にフィルターを置きます。 </li><li>優しく場所に上半分室を下げる。つの半室が組み立てられた後、リングクランプを使用して一緒にクランプします。上向きに直面している二つの開口部と、作業台の上に水平にVDCを置きます。 </li><li>尖半室に細菌接種4 mlを加え。 </li><li>基底外側半分室に細胞培養培地4 mlを加える。 </li><li>両方の半室の開口部に、エンドピースを置きます。 </li></ol> 6。可変雰囲気インキュベーター内ガスマニホールドにVDCを取り付ける<ol><li>ガスマニホールドに近接変数雰囲気インキュベーターにVDCを置きます。 </li><li>ガスマニホールドに接続されたガス供給レギュレータを開く。 VDCの基底外側半分室のガス入口にマニホールドからチューブを取り付けます。 GAを取り付けSアウトレットパイプは基底外側半室でエンドピースでアウトレットのいずれかに可変雰囲気インキュベータの導出。 </li><li>基底外側半室でエンドピース内の他の出口を閉鎖。これは、側底媒体の放出をもたらすことができるように、過剰な気体圧力を避けるために非常にゆっくりと開くように注意しながら、ガスマニホールドにガスの流れを開く。 </li><li>目的は、すべての2-5秒1バブルのガス流量である。定期的に、実験の過程でガスの流れを確認し、必要に応じて調整します。 </li></ol> 7。共培養後VDCの分解<ol><li>適切な共培養期間後に、ガスマニホールドに接続されたガス供給レギュレータを閉じる。マニホールドでVDC内にガスの流れを遮断する。ガス入口、ガス出口とVDCからストッパーを外します。 </li><li>変数大気インキュベーターからVDCを削除します。 subsequenため-80℃で頂端および基底外側清や店舗°Cを削除するT分析。 </li><li>リングクランプを外し、静かにVDCを離れて取る。半室と無菌6ウェル細胞培養皿への転送からフィルタを削除します。滅菌PBS400μlのでIECS 3回洗浄する。 </li><li>相互作用する細菌の総数の計数のため、IECを溶解し、室温で20分間インキュベートしIECSに0.1％を含有する滅菌PBS400μlの（v / v）のトリトンX-100を加える。その後、細菌CFUの相互作用の数を定量化するために48時間変数雰囲気インキュベーター中37℃でインキュベート三重における血液寒天プレート上で適切な希釈のメッキに続いて、この細胞溶解物から段階希釈​​を行います。 </li><li>侵入した細菌の総数を列挙するために、IECSに150μgの/ mlのゲンタマイシンを含むDMEM細胞培養培地を400μlを加え、37℃で標準的な組織培養インキュベータ中で2時間インキュベート℃のCO 2、5％C、95％細胞外の細菌を殺すために、空気、その後、上記のステップ7.4の場合とフォロー。 </li></ol> 8。共培養後VDCのクリーニング実験の次のラウンドのために滅菌水や店舗でVDCを洗ってください。

<ol><li>Mills, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+Campylobacter+jejuni+invasion+of+intestinal+epithelial+cells+under+low-oxygen+coculture+conditions+that+reflect+the+in+vivo+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Increase in Campylobacter jejuni invasion of intestinal epithelial cells under low-oxygen coculture conditions that reflect the in vivo environment.</a> Infect. Immun. 80, 1690-1698 (2012).</li>
<li>Marteyn, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Shigella+virulence+in+response+to+available+oxygen+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo.</a> Nature. 465, 355-358 (2010).</li>
<li>Dorrell, N., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second+century+of+Campylobacter+research%3A+recent+advances%2C+new+opportunities+and+old+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">The second century of Campylobacter research: recent advances, new opportunities and old problems.</a> Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 514-518 (2007).</li>
<li>Young, K. T., Davis, L. M., Dirita, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Campylobacter+jejuni%3A+molecular+biology+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 665-679 (2007).</li>
<li>Hu, L., Kopecko, D. J. Chapter 17. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHu%2C+L+%22Campylobacter%22">Campylobacter</a>. Nachamkin, I., Szymanski, C. M., Blaser, M. J. , ASM Press. 297-313 (2008).</li>
<li>Everest, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+Caco-2+cells+as+a+model+for+enteric+invasion+by+Campylobacter+jejuni+and+C.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differentiated Caco-2 cells as a model for enteric invasion by Campylobacter jejuni and C. coli.</a> J. Med. Microbiol. 37, 319-325 (1992).</li>
<li>Konkel, M. E., Hayes, S. F., Joens, L. A., Cieplak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+the+internalization+and+intracellular+survival+of+Campylobacter+jejuni+in+human+epithelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Characteristics of the internalization and intracellular survival of Campylobacter jejuni in human epithelial cell cultures.</a> Microb. Pathog. 13, 357-370 (1992).</li>
<li>Monteville, M. R., Konkel, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin-facilitated+invasion+of+T84+eukaryotic+cells+by+Campylobacter+jejuni+occurs+preferentially+at+the+basolateral+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Fibronectin-facilitated invasion of T84 eukaryotic cells by Campylobacter jejuni occurs preferentially at the basolateral cell surface.</a> Infect. Immun. 70, 6665-6671 (2002).</li>
<li>Friis, L. M., Pin, C., Pearson, B. M., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+culture+methods+for+investigating+Campylobacter+invasion+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro cell culture methods for investigating Campylobacter invasion mechanisms.</a> J. Microbiol. Methods. 61, 145-160 (2005).</li>
<li>Schuller, S., Phillips, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microaerobic+conditions+enhance+type+III+secretion+and+adherence+of+enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+to+polarized+human+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microaerobic conditions enhance type III secretion and adherence of enterohaemorrhagic Escherichia coli to polarized human intestinal epithelial cells.</a> Environ. Microbiol. 12, 2426-2435 (2010).</li>
<li>Cottet, S., Corthesy-Theulaz, I., Spertini, F., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microaerophilic+conditions+permit+to+mimic+in+vitro+events+occurring+during+in+vivo+Helicobacter+pylori+infection+and+to+identify+Rho%2FRas-associated+proteins+in+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Microaerophilic conditions permit to mimic in vitro events occurring during in vivo Helicobacter pylori infection and to identify Rho/Ras-associated proteins in cellular signaling.</a> J. Biol. Chem. 277, 33978-33986 (2002).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

宿主細胞と細菌性病原体の相互作用を研究するためのin vitro細胞培養法での使用が広く多くの研究室で用いられる技術である。例えば、細胞培養アッセイは好気的条件下で行われるしかし、これらは、in vitroモデルにおいて正確にホスト病原体の相互作用が行われたインビボ環境では表していない可能性がある。広く試験管内感染モデルで使用される微好気性Cを研究するために特に不適切であるジェジュニは通性嫌気性菌であり、他の腸内病原体に比べて。 C.によって人間IECSの侵入のメカニズムに関する文献で ​​かなりの混乱があるジェジュニ 4,5。我々は、これらの研究で用いインビトロのモデルが正確に生体状況で反映していないので、侵入のメカニズムはとてもよく理解されていない理由があることを示唆している。レベルは、標準的な細胞培養アッセイを用いてCの IECSのジェ...

宿主細胞と細菌性病原体の相互作用は、in vitro細胞培養法での使用広範囲に研究されてきた。例えば、細胞培養アッセイを用いて、宿主細胞、宿主細胞受容体の同定、宿主細胞シグナル伝達経路および宿主細胞の細菌侵入に対する細菌の付着は、すべての多くの重要な観察結果として、詳細に研究されている。しかしながら、細胞培養アッセイは、インビボ環境を代表しないかもしれない好気的条件下で行われる。胃腸感染を研究するために使用されるin vitroモデルの主な制限は、高い酸素レベルを含む培養条件は、一般に、真核細胞の生存を支持することである。しかし腸管腔の状況はほぼ嫌気性になります。非常に低酸素環境での腸内病原体はその発現が変化する好気的条件下で2病原性遺伝子を発現する。このように、データは、標準的な細胞培養モデルを用いて得メートルAYは、宿主細胞と細菌相互作用の不正確な表示を与える。 カンピロバクターは、軽度の下痢から重度の炎症性腸炎に及ぶという症状を、世界的な細菌性急性胃腸炎の主要な原因物質である。 C.の大半合併症のない胃腸炎でジェジュニ感染の結果、しかし、C.ジェジュニは、ギラ ​​ン·バレー症候群（GBS）を含む末梢神経障害でも最も一般的に同定され感染性病原体である。英国では、C.によって引き起こされる腸炎の50万人以上のケースがあると推定されているポンド5.8億の英国経済への予測コストジェジュニ感染毎年。発展途上国では、C.ジェジュニは、子どもの死亡の主要な原因である。紛れもカンピロバクター感染症の重要性と徹底したゲノムベースの分析、C.含む研究の数十年にもかかわらず、 ジェジュニ病因は依然として不十分understですOOD、そのようなサルモネラ 、 大腸菌 、 赤痢菌 、およびコレラ菌などの他の腸の病原体とは対照的である。便利な小さな動物モデルの欠如は、この3つの主な理由です。も広くビトロ感染モデルで使用気性Cを研究するためのより多くの不適切な通性嫌気性菌であり、他の腸内病原体のためのよりジェジュニ 。ながらC.ジェジュニは侵襲的な病原体、Cのメカニズムとして認識されている腸上皮細胞のジェジュニ侵攻（IECS）は依然として不明である4,5。C.ジェジュニ侵入はマイクロフィラメント、微小管、両方またはどちらも5の組み合わせのどちらかに依存することが示されている。このエリアの混乱はおそらくビトロアッセイ条件の通報を使用することによるものである。 異なる細胞培養アッセイの数は、C.の相互作用を調査するために使用されているジェジュニ宿主細胞である。のCaco-2 6、INT 407 7、およびT84 8細胞株は、すべての異なる℃の接着および浸潤能力を研究するために使用されているジェジュニ菌株。しかし、Cの細菌の付着と侵入のレベルIECSとジェジュニは他の腸病原体9に比べ劇的に低くなっています。 Cの共培養IECSとジェジュニは、通常IECSの生存に必要な、大気中の酸素濃度に近い条件下で、CO 2インキュベーター内で行われる。℃でジェジュニ遺伝子の発現は、大気中の酸素条件と比較して腸管腔の低酸素環境において非常に異なるであろう。 垂直方向の拡散室（VDC）システムの使用は、異なる媒体とガス条件1,10,11で細菌および宿主細胞の共培養を可能に開発されている。このシステムは、細菌が解除になり、人間の腸内の条件を模倣非常に低い酸素ながら組織のファンデ条件は、血流からの酸素が供給される。特別0.4μmのフィルターで増殖偏IEC単層をそれぞれ個別細菌ブロスおよび細胞培養培地が充填され（ 図1）とした頂端側底区画を作成VDCに入れた。 VDCは、変数雰囲気のインキュベーターは、37℃で85％のN 2、5％O 2、10％CO 2を含有する°C、Cの最適条件を表すに入れたジェジュニ 。頂端側画分が開いたままと可変雰囲気のインキュベーター内で微好気雰囲気にさらされた、密封された側底区画をしながら、5％CO 2 /圧力の蓄積を防止する出口管と、95％O 2ガス混合物の一定の投与により酸素を供給した。これらの条件下でのCaco-2細胞の生存および単層の完全性が経上皮エレメントを監視することによって確認されたのCaco-2細胞単層と頂端コンパートメント内低酸素条件下での頂端と基底外側区画の物理的な分離の生存を実証するため、24時間以上の単層にわたるctrical抵抗（TEER）。変数雰囲気インキュベーター（微好気条件）で、標準的な細胞培養CO 2インキュベーター（好気的条件）で維持のVDCで単層のTEERは異なる大気条件1の下で細胞単層の完全性を示す有意な差は認められなかった。微好気条件下では、タイトジャンクションが存在し、均等に好気性条件1の下で維持された細胞に類似オクルディン染色パターンでセルの枠線との間で分配さ残った。 Cの相互作用VDC内のCaco-2とT84細胞とジェジュニは、細菌の相互作用（接着と浸潤）と浸潤を評価することによって調べた。二つの異なるC.ジェジュニ野生型straiNSは、1を使用しました。Cでジェジュニ 11168Hは、元のシーケンス株NCTC11168のhypermotile誘導体である。 11168H株はひよこ植民モデルではるかに高い植民地化レベルを示し、したがって、宿主 - 病原体相互作用の研究のために使用するのに適した菌株と考えられている。 81から176を分離人間であり、ほとんどの侵襲広く研究されている実験室株の一つである。C.ジェジュニ株は微好気性の条件のどちらかまたは下VDCの頂端の区画に追加されました。我々は相互作用と侵略の両方に高いレートはCのために記録された観察微好気条件1の下ジェジュニ 。増加したC.ジェジュニ相互作用は微好気条件1の下での細菌数の増加によるものではなかった。このデータは、VDCの先端コンパートメントにおける低酸素環境が細菌-宿主相互作用を強化し、示していると我々の仮説をサポートするCの侵襲的な性質ジェジュニは INCRですこれらの条件下で緩和。これは、侵襲的な細菌性病原体を研究するVDCモデルの使用の最初の報告書だったとより密接に生体状況で模倣するという条件の下でのin vitro感染アッセイで行うの意義を強調しています。 VDCモデルは、多くの異なる細菌種のホスト病原体の相互作用を研究するために使用することができる。

<table><tbody><tr><td>スナップウェルインサートで使用するための特殊垂直拡散システム</td><td>ハーバード装置</td><td>66-0001</td><td>マニホールド&6つのスナップウェルチャンバー</td></tr><tr><td>キャップ</td><td>ハーバード装置</td><td>66-0020</td><td></td></tr><tr><td>Oリング</td><td>ハーバード装置</td><td>66-0007</td><td></td></tr><tr><td>クランプ</td><td>ハーバード装置</td><td>66-0012</td><td></td></tr><tr><td>スナップウェルフィルター(細孔径0.4 &mu;m)</td><td>Corning Costar</td><td>3407</td><td></td></tr><tr><td>Millicell ERS-2 ボルトオーム抵抗計</td><td>Millipore</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>WPA Lightwave II 分光光度計</td><td>Biochrom</td><td>80-3003-72</td><td></td></tr></tbody></table>

腸管上皮細胞の腸内細菌の侵入<em&gt;インビトロ</em&gt;劇的垂直拡散室モデルを用いた強化され

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

宿主細胞と細菌性病原体の相互作用は、in vitro細胞培養法での使用広範囲に研究されてきた。例えば、細胞培養アッセイは好気的条件下で行われるしかし、これらは、in vitroモデルにおいて正確にホスト病原体の相互作用が行われたインビボ環境では表していない可能性がある。我々は、異なる媒体とガス条件下で細菌および宿主細胞の共培養を可能にする感染のインビトロのモデルを開発した。垂直拡散室（VDC）のモデルは、細菌が非常に低酸素ながら組織の条件の下になり、人間の腸内での条件が血流からの酸素が供給される模倣。 VDCにSnapwellを挿入で栽培偏腸管上皮細胞（IEC）単層を配置すると、別個の頂端と基底外側の区画を作成します。基底外側区画は、細胞培養培地で充填密封し、酸素ワットで灌流されている微好気条件下でのオープンとインキュベート保ち、頂端区画はスープで満たされているhilst。両方のCaco-2およびT84 IECSは、細胞生存または単層の整合性に明らかな悪影響することなく、これらの条件下で、VDCに維持することができる。異なるCで行わ共培養実験頂端側画分における微好気条件でジェジュニ野生株とVDCモデルにおける異なるIEC線は再現性好気培養条件と比較して、相互作用の数（約10倍）の増加および細胞内（略100倍）細菌をもたらす1。 VDCモデルで作成した環境は、より密接にCで遭遇する環境を模倣人間の腸内ジェジュニとより密接に生体現実に模倣するという条件の下でのin vitro感染アッセイを行うことの重要性を強調しています。私たちは、VDCモデルの使用は、相互作用の新たな解釈は賭けることができますことを提案細菌性病原体と宿主細胞を予期する。

Cで行われる共培養実験ジェジュニ野生型株および頂端側画分における微好気条件でVDCモデルにおけるIECSは時間内に好気培養条件と比較して、相互作用の数の増加（約10倍）および細胞内（略100倍）細菌を実証している依存性の様式1。この観察は、2つの異なるC.を用いて再現可能であったジェジュニは、野生型株（11168H及び81-176）および2つの異なるIEC線（のCaco-2およびT84）、VDCモデル1の有効性を強調する。 ここで紹介する代表的な結果は、Cの数との比較ですジェジュニはとの対話やのCaco-2 3後の細胞、6、CO 2インキュベーター（ 図2AおよびB）で、または尖COMで微好気条件でVDCモデルで標準的な細胞培養アッセイ条件のいずれかの下で共培養の24時間を侵略コンパートメントか（ 図2Cおよ...

好気的条件下で細菌の付着および浸潤を調べるための細胞培養アッセイを行うと、通常の典型的である<em生体内で&gt;</em&gt;環境。垂直拡散室モデルは、ヒト病原体の相互作用の研究を可能にします<em&gt;カンピロバクター</emもっと下の腸上皮細胞と&gt;<em生体内で&gt;</em条件&gt;のような、強化された細菌の侵入になる。

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

本実験の全体的な目的は、垂直拡散チャンバー（VDC）モデルを用いて、腸上皮細胞への侵入を伴う細菌との相互作用を調査することです。まず、分極したCaco-2腸上皮細胞の単層を配した特殊なフィルターを使用し、VDC内に頂端側（apical）と基底側（basal-lateral）の独立したコンパートメントを作成します。次に、目的の細菌接種物を頂端側コンパートメントに添加します。微好気条件下での細胞培養において、好気条件下で基底側コンパートメントに培地を添加します。その後、共培養中の任意の時点でフィルターを取り除き、相互作用した細菌または細胞内細菌の数を計数します。最終的に、標準的な好気性培養条件と比較して、VDCモデルを用いることで相互作用および細胞内細菌数の増加が観察されます。標準的な組織培養接着・侵入アッセイなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、細菌と腸管上皮細胞の共培養を、ヒト腸管のin vivo条件をより密接に模倣したin vitro条件下で実施できる点にあります。本手順のデモンストレーションを行うのは、私の研究室の博士課程学生であるN Vida nasと、私の研究室での博士課程の一環として垂直拡散チャンバーモデルを開発したポストドクのDominic Millsです。まず、0.4 micronフィルターあたり4 × 10⁵個のCaco-2腸上皮細胞を培地中で播種し、21日間培養して細胞を極性化させます。その際、2〜3日ごとに培地を交換し、単層の極性化状態を確認してください。その後、電気抵抗計を用いて経上皮電気抵抗を測定します。VDC共培養アッセイを開始する24時間前に、変気相インキュベーターを用い、微好気条件下で新鮮な血液寒天培地上のjejuniを培養します。同時に、30 mLのBruce brothを同条件下で前培養しておきます。実験当日に、VDCハーフチャンバーおよびOリングとプラグを滅菌溶液に浸します。次に、滅菌済みの20 mLシリンジを用いて、両方のハーフチャンバーのガス入口から溶液をフラッシュします。1時間後、別の滅菌済み20 mLシリンジを使用して、新鮮な滅菌水でVDCコンポーネントを洗浄し、ガス入口をすすぎます。次に、CJ jui血液寒天プレート培養物の半分を、あらかじめインキュベートしたBarellaブロス1mLに回収し、1mLあたり約10¹⁰ CFUを得ます。600nmで細菌懸濁液の吸光度を測定して細菌のコロニー形成単位（CFU）を半定量し、その後、あらかじめインキュベートしたBruceブロス計4mLを用いて、細菌懸濁液を目的の接種量まで調整します。この最終的な細菌懸濁液から段階希釈を行い、適切な希釈液を血液寒天プレートに3連で播種し、変動雰囲気インキュベーターで48時間インキュベートします。次に、VDCの下部チャンバーをベンチ上に

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本研究は、組織幹細胞由来の腸オルガノイドを用いた細菌感染の in vitro 調査方法を提示します。このプロトコルは、2次元でオルガノイドを培養・分化する方法、浸潤性大...

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大 腸菌 細胞侵入の定量および可視化のためのアミカシン保護アッセイ

学ぶVDCモデルを用いた腸管上皮細胞と細菌の共培養法。Caco-2細胞とCampylobacter jejuniを微好気・好気条件下で培養し、細菌の接着と侵入を定量化する生理学的に関連性の高いin vitro系を構築します。

腸管上皮細胞の腸内細菌の侵入

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