腸管上皮細胞の腸内細菌の侵入

本実験の全体的な目的は、垂直拡散チャンバー（VDC）モデルを用いて、腸上皮細胞への侵入を伴う細菌との相互作用を調査することです。まず、分極したCaco-2腸上皮細胞の単層を配した特殊なフィルターを使用し、VDC内に頂端側（apical）と基底側（basal-lateral）の独立したコンパートメントを作成します。次に、目的の細菌接種物を頂端側コンパートメントに添加します。

微好気条件下での細胞培養において、好気条件下で基底側コンパートメントに培地を添加します。その後、共培養中の任意の時点でフィルターを取り除き、相互作用した細菌または細胞内細菌の数を計数します。最終的に、標準的な好気性培養条件と比較して、VDCモデルを用いることで相互作用および細胞内細菌数の増加が観察されます。標準的な組織培養接着・侵入アッセイなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、細菌と腸管上皮細胞の共培養を、ヒト腸管のin vivo条件をより密接に模倣したin vitro条件下で実施できる点にあります。

本手順のデモンストレーションを行うのは、私の研究室の博士課程学生であるN Vida nasと、私の研究室での博士課程の一環として垂直拡散チャンバーモデルを開発したポストドクのDominic Millsです。まず、0.4 micronフィルターあたり4 × 10⁵個のCaco-2腸上皮細胞を培地中で播種し、21日間培養して細胞を極性化させます。その際、2〜3日ごとに培地を交換し、単層の極性化状態を確認してください。その後、電気抵抗計を用いて経上皮電気抵抗を測定します。

VDC共培養アッセイを開始する24時間前に、変気相インキュベーターを用い、微好気条件下で新鮮な血液寒天培地上のjejuniを培養します。同時に、30 mLのBruce brothを同条件下で前培養しておきます。実験当日に、VDCハーフチャンバーおよびOリングとプラグを滅菌溶液に浸します。次に、滅菌済みの20 mLシリンジを用いて、両方のハーフチャンバーのガス入口から溶液をフラッシュします。1時間後、別の滅菌済み20 mLシリンジを使用して、新鮮な滅菌水でVDCコンポーネントを洗浄し、ガス入口をすすぎます。

次に、CJ jui血液寒天プレート培養物の半分を、あらかじめインキュベートしたBarellaブロス1mLに回収し、1mLあたり約10¹⁰ CFUを得ます。600nmで細菌懸濁液の吸光度を測定して細菌のコロニー形成単位（CFU）を半定量し、その後、あらかじめインキュベートしたBruceブロス計4mLを用いて、細菌懸濁液を目的の接種量まで調整します。この最終的な細菌懸濁液から段階希釈を行い、適切な希釈液を血液寒天プレートに3連で播種し、変動雰囲気インキュベーターで48時間インキュベートします。

次に、VDCの下部チャンバーをベンチ上に平らに置き、Oリングを装着します。続いて、腸上皮細胞を保持したフィルターを1つキャリアから取り外し、400 µLの滅菌PBSで3回洗浄します。Oリングがずれないように注意しながらフィルターを下部チャンバーに設置し、上部チャンバーをゆっくりと被せて固定します。

2つのハーフチャンバーを組み立てたら、リングクランプで固定し、2つの開口部が上を向くようにVDCをベンチトップに水平に置きます。細菌接種物を頂端側のハーフチャンバーに加え、次に4 mLの細胞培養培地を底側外周のハーフチャンバーに加えます。両方のハーフチャンバーの開口部にエンドピースを装着し、VDCを可変雰囲気インキュベーターに入れます。

ガスマニホールドのすぐ近くで、ガスマニホールドに接続されたガス供給レギュレーターを開きます。マニホールドからのチューブをVDCの底部側面ハーフチャンバーのガス入口に取り付け、次に、可変雰囲気インキュベーターから出ているガス出口パイプを、底部側面ハーフチャンバーのエンドピースにある出口のいずれかに取り付けます。底部側面ハーフチャンバーのエンドピースにあるもう一方の出口を閉じます。

次に、過剰なガス圧を避け、適切な共培養期間後に2〜5秒に1回の気泡というガス流量にするため、ガスマニホールドのガス流量を非常にゆっくりと開きます。ガスマニホールドに接続されているガス供給レギュレーターを閉じます。その後、マニホールドでVDC内のガス流量を吹き飛ばし、VDCからガス入口、ガス出口、およびストッパーを取り外します。

次に、可変雰囲気インキュベーターからVDCを取り出します。その後、頂端側および基底側の側方上清を除去し、後の解析のために-80°Cで保存します。リングクランプを取り外し、VDCを慎重に分解します。

ハーフチャンバーからフィルターを取り出し、滅菌済みの6ウェル細胞培養ディッシュに移します。次に、VDCを滅菌水で洗浄し、相互作用した細菌の総数を算出するための次回の実験まで保存します。腸上皮細胞を400 µLの滅菌PBSで3回洗浄し、その後、Triton X 100を含む400 µLの滅菌PBS中で室温にて20分間溶解させます。細胞溶解液を段階希釈し、適切な希釈液を血液寒天培地プレートに3連で塗布します。

次に、侵入した細菌の総数を計測するため、プレートを変動気相インキュベーターを用いて37°Cで48時間培養します。細胞外の細菌を死滅させるため、腸上皮細胞を150 µg/mLのGentamycinを含む細胞培養液400 µLとともに、標準的な組織培養インキュベーター内で2時間インキュベートします。その後、先ほど示した手順と同様に、細胞溶解、段階希釈、および培養を行い、コロニー形成単位を定量します。

以下のデータは、標準的な細胞培養アッセイ条件下での共培養から3時間、6時間、または24時間後に、Caco-2細胞と相互作用または侵入したCJ juiの数と、VDCモデルを用いた場合との比較を示しています。例えば、共培養24時間後において、標準的な細胞培養条件下では、Caco-2細胞と相互作用しているCJ juiは10⁷ CFU未満しか観察されません。しかし、VDCモデルで24時間共培養した後では、約10⁸ CFUのCJ juiがCaco-2細胞と相互作用していることが観察され、CJ juiと腸上皮細胞（IEC）との相互作用がほぼ10倍に増加しています。

標準的な培養条件とVDC培養条件下での侵入したCJの数を比較すると、標準的な細胞培養条件下で24時間後には、CACO 2細胞から約10⁵のCGE細胞内CFUを単離することができます。一方、VDCモデルで24時間共培養した後は、CACO 2細胞から約10⁷の細胞内CFUを単離でき、細胞内CGEはほぼ100倍に増加します。この手順を行う際は、基底側チャンバーのガスフローを、構築後にモニタリングすることが重要です。

この手法により、abucの病原性研究における研究者は、腸上皮細胞との細菌相互作用の遺伝的根拠と、細菌感染に対する宿主の自然免疫応答の両方を調査することが可能になりました。このビデオを視聴することで、垂直拡散チャンバーモデルを用いて他の腸内細菌と腸上皮細胞の相互作用を研究する方法と、ヒトの腸内環境をより忠実に再現する条件について、深く理解することができます。