マウス抵抗動脈から毛細血管内皮の管の隔離

本手順の全体的な目的は、マウスの上腹壁動脈（SEA）から血管内皮細胞管を単離し、天然の完全な微小血管内皮における細胞内および細胞間のシグナル伝達ダイナミクスを研究することです。これは、まずマウスの腹部骨格筋壁からSEAを単離することで達成されます。次に、血管を穏やかに体細胞消化し、その後慎重にTAT処理を行うことで、平滑筋細胞と外膜を内皮細胞管から解離させます。

最終ステップとして、チューブをフローチャンバーに固定し、生理食塩水で灌流します。最終的に、共焦点イメージングを用いて、天然の状態を維持した微小血管内皮チューブにおけるカルシウムシグナリングを可視化できます。内皮細胞を培養するなどの既存の方法と比較して本手法の主な利点は、チューブを構成する内皮細胞が、天然の形態、タンパク質発現、および応答性を維持していることです。内皮は、全身の血流制御に不可欠な役割を担っています。

この手法を用いることで、血流制御を媒介する細胞間シグナリングイベントと、血管機能不全においてそれらがどのように異常をきたすかを調査することができます。まずSEAを単離するために、麻酔下にあるマウスの恥骨領域のすぐ上の皮膚に小さな切開を加え、切開線を各後肢に向かって側方に広げ、さらに腹側正中線に沿って肋骨上端まで切開し、さらに各4肢に向かって側方に切開を広げます。次に、皮膚をそっと持ち上げて皮膚を下の筋肉に固定している結合組織を切断し、腹筋群の表面全体を露出させます。

露出した筋肉を室温の生理食塩水で洗浄します。次に、実体顕微鏡下で胸骨底部にある脂肪パッドを持ち上げます。脂肪パッドを切り裂き、肋骨の下端に沿って切開します。

SEAが視認できるようになったはずです。動脈を損傷させないように注意しながら、露出した組織を室温の生理食塩水でさらに洗浄します。骨格筋の最上層を牽引した後、SEAの長さを確認し、動脈の下にある薄い筋肉層を慎重に切除します。次に、角度付き鉗子を用いて、6-0シルク縫合糸をSCAの下に通します。

次に、加圧状態を維持し、血管腔内に血液を留めておくために、動脈および隣接する静脈を結紮します。対側の中標的動脈（SCA）を結紮した後、腹筋の中線に沿って切開して左右を分離し、皮膚と同様に切開線を左右両方向に広げます。さらに、外縁に沿って垂直に切開し、腹筋を体から完全に分離します。

次に、密封状態を維持するために結紮部位より上のSEAを切断し、単離した筋肉と動脈を、4 °Cの解剖バッファー10 mLが入った50 mLビーカーに入れます。腹部の反対側から筋肉を単離した後、組織を解剖バッファー中で10分間インキュベートします。続いて、SEAを含む腹筋を、Cyl Guardでコーティングされ解剖バッファーが入った4 °Cのシャーレに移します。0.15 mmの昆虫ピンを用いて、SEAと筋肉を、あらかじめ記録しておいた生体内での概算長まで伸展させます。

SEAをシリンダーガードに固定し、腹膜に面した薄い層が上になるように筋肉を向けます。次に、結紮の上流側から下流端に向かって、最初の主要な分枝部位まで、SEAを対になる静脈および周囲組織から約1〜2 cm分、剥離して露出させます。分枝部位の直上および結紮の直下でSEAを切断します。

次に、弾性チューブを使用して、ピペットの後端を氷冷した解剖用バッファーが入った5 mLシリンジに接続します。カニュレーションピペットのチップを解剖チャンバー内に固定し、SEAをカニュレーションします。その後、すべての赤血球が洗い流されたら、SEAをカニュレーションピペットから外し、ピペットを解剖皿から取り出して内皮管を単離します。

まず、12 × 75 mmのガラス製培養チューブに、氷冷した解剖バッファーを半分まで満たします。次に、SEAを1〜3 mmの大きさに切断し、角度付きピンセットを用いて動脈片を培養チューブに移し、チューブを氷上に置きます。続いて、別の12 × 75 mm培養チューブ内で、消化酵素と解離バッファーを合わせて最終容量1 mLとし、ヒーティングブロックを用いて酵素溶液を37 °Cに予熱します。

動脈片が入った培養チューブを4°Cから取り出し、酵素溶液を37°Cまで温めている間に、室温に戻します。培養チューブから室温になった解剖バッファーを、血管セグメントを含む少量の液を残して注意深く吸引します。次に、動脈片が培養チューブの底に留まるようにして、酵素を含まない室温の解離バッファーをゆっくりと血管セグメントに加え、残っている解剖バッファーを洗い流します。

酵素溶液が37 °Cに達したら、血管セグメントが入った培養チューブから、セグメントが浸っている少量の液を残して、解離緩衝液を再び吸引します。次に、37 °Cの酵素溶液を培養チューブに移し、ヒーティングブロックを用いて37 °Cで30分間インキュベートします。インキュベーションの間、ミネラルオイルを充填したリターレーションピペットを準備し、ピペットに筋を入れ、きれいに切断し、ピンセットを用いてピペットを折り、先端を研磨して、マイクロマニピュレーターに取り付けたマイクロシリンジに固定します。

次に、マイクロシリンジのプランジャーを戻して、2 nLの解離バッファーをピペットに充填し、インキュベーション終了時にピペットチップをフローチャンバーの上に配置します。先ほど示したように注意深くバッファーを吸引した後、動脈セグメントを室温の解離バッファー 4 mLで洗浄します。続いて、1 mLマイクロピペットを用いて血管セグメントを1本静かに吸引し、1 mLの解離バッファーが入ったフローチャンバーに血管を移します。

tationピペットの先端を血管セグメントの一端に近づけ、内皮細胞に機械的な負荷をかけないよう、約225 nanoliters per secondの速度で血管セグメントをtatingピペット内に吸引し、その後血管をチャンバー内に排出します。消化が成功していれば、平滑筋細胞と外膜が内皮管から解離しています。外膜が管に絡まるのを防ぐため、速やかに内皮管から外膜を遠ざけ、すべての平滑筋細胞が解離するまで、先ほど示したtationの手順を繰り返します。

最終反復後、単離した内皮管をフローチャンバーの中央に、流れの方向に沿って配置し、トリガリングピペットを取り除きます。フローチャンバーの両端に取り付けられたマイクロマニピュレーターに固定用ピペットをしっかりと固定し、それぞれのチップを内皮管の両端に配置します。固定用ピペットを管の両端に一つずつ下ろし、管の両端から約50 µmの位置で、管をチャンバーの底に押し付けます。

ピンニング用ピペットがチューブに触れた直後、チューブの軸に沿ってゆっくりと後退させ、ほぼin vivoでの長さにまで伸ばします。ピペットをチャンバー底に押し当ててチューブを固定し、ペリスタポンプを用いて灌流液の流れを開始させ、内皮管を横切る灌流液の一定の流れを維持します。この微分干渉コントラスト（DIC）像は、室温で3 mL/minの速度で1時間の灌流バッファーによる灌流を行った後、SEAから単離された内皮細胞管を示しています。

この動画では、1 µMのアセチルコリン刺激に対する、Fluo-4をロードした血管内皮細胞チューブのカルシウム応答を示しています。これらの代表的な蛍光画像は、アセチルコリンによる内皮チューブ刺激後のさまざまな時点で収集されました。細胞内カルシウムが時間とともにどのように振動するかを確認してください。

この手順を行う際は、内皮細胞は非常に繊細で損傷しやすいため、チューブの配置とピン留めの際に内皮管を機械的に損傷させないように注意することが重要です。このビデオを視聴することで、マウスの上腹壁動脈から内皮管を単離し、本来の無傷な微小血管内皮を研究する方法を十分に理解できるはずです。