ヒト呼吸器合胞体ウイルス感染に対するヒト末梢血単核細胞の免疫応答を研究するためのインビトロモデル

この手順の全般的な目的は、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）感染に対するヒト免疫細胞の反応を研究することです。まず、HeLa細胞を用いて感染性RSVストックを培養し、次に、超遠心分離法によって培養したRSVストックを精製することでこれを達成します。

次に、密度勾配遠心分離法により、ヒト末梢血から主要な免疫細胞を単離します。最終ステップとして、単離した免疫細胞をウイルスで刺激します。最終的に、RSV感染に対する細胞性免疫応答を、ELISA、qPCR、またはフローサイトメトリーによって評価できます。

この技術は、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）感染症の研究において価値のある手法です。RSVはヒトに対して高い適応能を有しています。したがって、ウイルスの病原性に関与する炎症経路を研究するには、ヒト免疫細胞を使用することが重要です。

このビデオで使用しているウイルスはRSVですが、この手法はインフルエンザウイルスやライノウイルスなどの他のウイルスの研究にも容易に適応させることができます。まず、ヒトRSVストック vial を 37 °C の恒温水槽で温めて解凍します。ウイルスが解凍されたら、フラスコ1本あたり 4 mL の感染培地を用いてストックを希釈します。

MOIを0.1以下に維持し、細胞が乾燥しない範囲で可能な限り少ない全量でウイルスをHEK293細胞に添加します。その後、37 °C、5% CO2の条件下で2〜4時間培養し、培地を均一に分散させるため15分ごとにフラスコを旋回させます。次に、接種液を除去し、PBSで細胞を1回洗浄します。

次に、フラスコに15 millilitersの培地を加え、同様の培養条件下で3〜5日間インキュベートします。通常明視野顕微鏡を用いて、ウイルス誘発性の細胞病変の変化がないか毎日1回観察します。これらの変化が観察されたら、細胞をスクレイピングしてRSVを回収し、懸濁液を滅菌済みの50 milliliterチューブに集めてボルテックスし、室温で1800 Gsで10分間遠心分離して細胞残渣をペレット化します。

RSVはこの速度では沈殿しないため、上清を1 mLずつの分注で播種ストックとして-80 °Cで保存できます。今後の使用に備えた分注液は、感染性ウイルス粒子の消失を防ぐため、常に液体窒素で急速凍結させてください。RSVを精製するには、まず超遠心機の手に滅菌済み遠心チューブを1本ずつ配置することから始めます。

次に、調製直後のフィルター滅菌済みスクロース溶液を各チューブの底部に5 mLずつ加えます。続いて、スクロース溶液を乱さないよう、また層が分離した状態を維持するように注意しながら、RSV溶液30 mLをスクロース溶液の上に非常にゆっくりと加えます。次に、無菌状態を維持するためフローキャビネット内で、キャップを含めた6つの超遠心機用バケットの重量を、滅菌PBSを用いて相互に0.1 g以内に精密にバランス調整します。ウイルスを20,000 RCF、4 °Cで1.5時間遠心分離します。

遠心分離が完了したら、滅菌済みピンセットを使用して、バケットから遠心チューブを慎重に取り出します。ウイルス粒子はショ糖層を通過し、ペレットを形成しています。遠心チューブをウイルス廃棄用フラスコに傾け、滅菌された表面でチューブを逆さまにして液を切り、排出させます。

ペレットを完全に乾燥させないでください。次に、1 mLのHPSSを注意深くペレットにかけ、遠心チューブを再び傾けてHPSSを排出させます。その後、ペレットが乾燥しないように注意しながら、チューブを再び逆さまにします。

次に、ペレットを別の1 mLのHBSSで40回トリチュレーションします。気泡が形成されるとウイルスが破壊される可能性があるため、注意してください。その後、ウイルスの分注液を液体窒素で急冷凍結します。定量および今後の使用まで、ウイルスを-80 °Cで保存します。健康なボランティアから10 mLのEDTAチューブに採血した後、室温のPBSを用いて血液を最大2倍まで希釈し、50 mLチューブ内で希釈血液を最大35 mLにします。

次に、滅菌済みのルアーロック針を滅菌済みの50 milliliterシリンジに取り付け、密度勾配媒体をシリンジに吸引します。希釈血液の入ったチューブの底に針を配置し、密度勾配媒体と血液の間に明確な境界線を維持しながら、血液の下に15 millilitersの密度勾配媒体を注意深くピペッティングします。次に、室温にて、最大加速およびブレーキオフの設定で、800 GSで20分間細胞を分離します。分離後、チューブの底に赤血球がペレットとして形成され、その上に好中球の銀色の層が認められます。

ペレット上の透明な層は密度勾配媒体であり、密度勾配媒体と最上層の血漿層との間の薄い層にPBMCが含まれています。パステールピペットを用いて慎重にPBMCを回収し、細胞を氷上の新しい50 milliliterチューブに移します。氷冷したPBSを加えて全量を50 millilitersとし、遠心分離完了後に細胞をペレット化します。

上清を吸引し、氷冷したPBS 50 millilitersでペレットを2回洗浄します。2回目の洗浄後、ペレットに氷冷した培地1 milliliterを加え、細胞数をカウントして、細胞濃度を5×10⁶ pbmc/milliliterに調整します。生RSVでpbmcを刺激するには、まず96ウェル丸底プレートの各ウェルにpbmc 100 microlitersを分注します。次に、調製したばかりの2種類の刺激剤をそれぞれ50 microlitersずつ加えます。

プレートを37°C、5% CO2条件下で24時間インキュベートし、その後プレートを遠心分離して、後でELISAで分析するために上清を回収します。ペレット内の刺激したPBMCは、qPCRで分析するか、フローサイトメトリー用に染色して分析することが可能です。PBMC刺激実験を行う際は、本手法では刺激分画法の併用が推奨されます。

条件は、RPMIやヒトRSVなどの標準刺激条件と、mial、ジペプチド、またはLPSなどの試験分画条件に分けられます。重要な点として、RPMI単独のような陰性対照と、LPSのような陽性対照が常に各実験に含まれています。RSVで24時間刺激した後、異なるPBMC集団は用量依存的な感染率を示し、RSV感染効率に差が見られます。ウイルスで24時間刺激した後、PBMCにおけるTNF alphaまたはインターフェロンgammaの発現をqPCRで解析すると、RSVがこれら2つの炎症性サイトカインの転写を強力にアップレギュレートすることが示されます。逆に、miamジペプチドまたはLPSによる刺激では、mRNA発現はわずかにとどまります。

P BMCsをRSVとMIALジペプチドで同時に刺激すると、強力な相乗的なアップレギュレーションが観察されます。刺激したpbmcについて、ELISAを用いてTNF AlphaまたはInterferon gammaの産生能を解析しました。転写レベルでの観察結果とは対照的に、RSVはP BMCsによるTNF alphaおよびinterferon gammaタンパク質分泌の誘導能が低く、miamジペプチドによる刺激では、少量のTNF alphaが産生され、interferon gammaは産生されませんでした。

転写解析と同様に、サイトカイン誘導がRSVの複製に依存しているかを確認するためのコントロールとして、RSVとMIAMジペプチドで共刺激した際、TNF alphaおよびインターフェロンガンマの両方が相乗的なアップレギュレーションを示しました。P BMCsを生存RSVまたはbeta propal lactoneで不活化したRSVで刺激したところ、グラフに示すように、生存RSVと不活化RSVの両方が炎症性サイトカインの産生を誘導しました。RSVを用いた実験は、バイオセーフティレベル2（BSL-2）のラボにある生物学的安全キャビネット内で実施する必要があることに留意してください。

さらに、この手法を試みる際は、手順全体を通してエンドトキシンフリーの試薬および材料を使用することが極めて重要であることを忘れないでください。このビデオを視聴することで、RSVを用いてヒトPBMCを刺激する方法と、免疫応答を分析するために使用できるいくつかのアッセイについて十分に理解できたはずです。