Name: ヒト呼吸器合胞体ウイルス感染に対するヒト末梢血単核細胞の免疫応答を研究するためのインビトロモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 学ぶヒト末梢血単核細胞を用いた呼吸器合胞体ウイルス感染に対する免疫応答のインビトロ解析手法。密度遠心法による細胞分離とウイルス刺激により、炎症性サイトカイン産生を評価する再現性の高いモデルを確立します。

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RSV A2 は、Dr. R. de Swart 氏 (Erasmus MC, Rotterdam, The Netherlands) のご厚意により提供されました。MVとGFは、オランダ政府のプロジェクト番号FES0908とオランダゲノミクスイニシアチブ(NGI)プロジェクト番号050-060-452によって資金提供されているVirgoコンソーシアムによってサポートされています。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に関与していませんでした。

注：
HRSVを用いた実験は、バイオセーフティーレベル2の研究室にある生物学的安全キャビネット内で実施しなければなりません。生物学的危険があるため、すべてのウイルス廃棄物およびウイルスに接触した材料を回収し、適切に廃棄してください。
感染の可能性があるヒト血液を使用する場合は、特別な注意を払う必要があります。
すべてのプロトコルにおいて、エンドトキシンフリーの試薬を使用することが不可欠です。
1. HRSV A2の培養
<ol>
	<li>HeLa細胞またはHEp-2細胞を、10%ウシ胎児血清（FCS）および1%ペニシリン/ストレプトマイシン（P/S）を添加したDMEM培地を用い、175 cm²の培養容器で培養する。2 コンフルエンスが約50%になるまで、培養フラスコで培養します。</li>
	<li>室温のリン酸緩衝生理食塩水で細胞を3回洗浄する。 (PBS).</li>
	<li>HRSVシードストックウイルスを含むバイアルを、以下の条件で解凍します。 37 °C ウォーターバス内で加温する。MOIを0.1以下に維持するようにウイルスストックを希釈する。これにより、欠損干渉粒子（DIPs）の生成を防ぐことができる。ウイルスストックを、1フラスコあたり4 mlの感染培地（DMEM + 1% P/S）で希釈し、HeLa細胞またはHEp-2細胞に添加する。細胞が乾燥しない範囲で、この液量を可能な限り低く保つ。液量が少ないほど、感染率は高くなる。</li>
	<li>2～4時間、～でインキュベートする。 37 °C, 5% CO₂215分ごとにフラスコを回転させ、培地を再分布させる。</li>
	<li>接種物を除去し、PBSで1回洗浄する。</li>
	<li>15 mlの培地（DMEM + 10% FCS + 1% P/S）を加え、以下で3〜5日間培養する。 37 °C, 5% CO22通常の明視野顕微鏡を用いて細胞を観察し、ウイルス誘発性の細胞病変を確認する。 例： シンシチウム（合胞体）の形成、細胞死、および浮遊細胞。</li>
	<li>細胞病変が認められたら、細胞を掻き出（スクレイピング）してHRSVを回収し、ウイルス懸濁液を滅菌済みの50 mlチューブに採取する。細胞懸濁液をボルテックスで攪拌する。細胞のスクレイピングとボルテックス処理により、より多くのウイルス粒子が放出される。</li>
	<li>細胞残渣を沈殿させるため、ウイルス懸濁液を室温で1,800 x gで10分間遠心分離する。上清中のHRSVはこの速度では沈殿しないため、上清をそのまま複数の175 cmの[容器/フラスコ]への感染に使用できる。2 フラスコ、または-まで保存可能80 °C 将来的に使用するため、1 mlずつの分注として播種ストックにしてください。感染性ウイルス粒子の喪失を防ぐため、HRSVは必ず液体窒素で急凍結させてください。</li>
	<li>上述のプロトコルで調製したシードストックを用いて、複数の175 cm²ディッシュに感染させます。2 培養フラスコ。同一のプロトコルを繰り返し、精製用のウイルスをさらに調製する。1回の超遠心分離サイクルで、最大180 mlのウイルス懸濁液を精製する。</li>
	<li>細胞病理学的変化が現れたら、細胞を掻き出してHRSVを回収し、上清を採取する。ウイルス懸濁液をボルテックスミキサーで撹拌する。室温で1,800 x gにて10分間遠心分離し、細胞残渣をペレット化する。この回転数では上清中のHRSVは沈殿しないため、上清を50 mlチューブ1本あたり15 mlずつ分注する。急速冷凍し、-80℃で保存する。80 °C 精製まで。</li>
</ol>
2. HRSVの精製
注意：超遠心機は潜在的に危険な装置であるため、使用前に十分注意してください。マニュアルを熟読し、最初の超遠心分離操作は、経験者の指導のもとで行ってください。
<ol>
	<li>超遠心機用バケットを70%エタノールで洗浄し、生物安全キャビネット内で乾燥させる。</li>
	<li>各バケットに滅菌済みの遠心チューブを配置します。</li>
	<li>30% (w/v) ショ糖含有PBS溶液を調製し、フィルター滅菌を行う（0.2 μm （フィルターでろ過し）、各遠心チューブの底部に5 mlずつ加えます。より迅速なプロトコルを行う場合は、ショ糖溶液を入れたチューブを凍結させることができます。必ず無菌状態を維持してください。</li>
	<li>ショ糖溶液が凍結していない場合は、このショ糖溶液の上に30 mlのHRSV溶液を非常に慎重に加えます。ショ糖溶液を乱さないよう、ゆっくりとピペッティングしてください。明確な境界線を維持します。チューブが凍結していた場合は、凍結したショ糖溶液の上にウイルス懸濁液を注ぎ、その後、融解させます。</li>
	<li>滅菌済みのPBSを用いて、6つの超遠心機用バケットを非常に注意深くバランス調整してください。すべてを滅菌状態に保つため、秤をフローキャビネット内に入れて使用します。チューブの縁から3〜5 mm下まで液体を満たしてください。そうしないと、遠心チューブが潰れる可能性があります。ネジ式キャップを含めた状態で、バケット間の重量差が0.1 g以内に収まるように調整してください。これは、キャップの重量が完全に一致していない場合に備えるためです。</li>
	<li>超遠心機を用いて1.5時間遠心分離し、 4 °C 20,000 rcfで。</li>
	<li>滅菌済みピンセットを用いて、バケットから遠心チューブを慎重に取り出します。ウイルス粒子はショ糖層を通過し、ペレットを形成しています。一方、細胞から分泌された可溶性因子（例： （サイトカイン）は溶液中に留まります。遠心チューブを傾けて、すべての液体を排出します。そのまま滅菌した表面の上で逆さまにして置いてください。 例： 培養プレートを用い、乾燥させるが、ペレットを完全に乾燥させないようにする。</li>
	<li>ペレットに1 mlのハンクス平衡塩溶液（HBSS）を慎重に加え、遠心チューブを傾けてHBSSを排出する。再び、チューブを滅菌した表面で逆さまにして乾燥させる。ただし、ペレットを完全に乾燥させないように注意する。</li>
	<li>ペレットを1 mlのHBSSに懸濁し、ピペッティングで40回混ぜ合わせます。気泡が形成されるとウイルスが破壊される可能性があるため、気泡が入らないように注意してください。</li>
	<li>ウイルスを分注し、液体窒素で急冷した後、-80℃で保存する。 °次回の使用まで保存します。凍結融解を繰り返すと感染価が低下するため、実験ごとに新しい分注ウイルスを使用してください。解凍する際は、常に以下の条件でウイルスを解凍してください。 37 °C HRSVは-20℃から...の間で安定性が低いため、 15 °C.</li>
</ol>
3. HRSVの定量
注：データの再現性を確保するため、定量操作を少なくとも3回、n=2（デュプリケート）で繰り返し行ってください。
3.1. A549細胞への感染
<ol>
	<li>A549細胞を24ウェルプレートでコンフルエントになるまで培養する。</li>
	<li>室温で1 mlのPBSを用いて、A549細胞を2回洗浄する。</li>
	<li>低血清培地を用いてHRSVの5倍段階希釈系列を調製する。希釈したウイルス液を各ウェルに100 μlずつ加える。最低4段階の希釈（例：4倍、20倍、100倍、500倍）を作成する。最高用量のウイルスを感染させたウェルをさらに2つ（アイソタイプコントロール用）および、モック感染させたウェルを2つ含める。</li>
	<li>5% CO2、37 °Cで2時間、細胞をインキュベートする。乾燥を防ぐため、15分ごとに24ウェルプレートを揺らす。</li>
	<li>ウイルス懸濁液を除去し、室温で1 mlのPBSを用いて細胞を1回洗浄する。</li>
	<li>低血清培地を用いて4% (w/v) 牛血清アルブミン (BSA) を調製する。フィルター滅菌（0.2 μmフィルター）し、各ウェルに500 μlずつ加える。</li>
	<li>5% CO2、37 °Cで22時間インキュベートする。</li>
</ol>
3.2. FACSの準備
<ol>
	<li>培地を除去し、室温のPBS 1 mlで細胞を1回洗浄する。</li>
	<li>各ウェルに予め温めておいた（37 °C）トリプシン 200 μlを加え、37 °C、5% CO2で10分間インキュベートする。</li>
	<li>顕微鏡下で細胞が剥離しているか確認する。細胞が剥離していれば、トリプシンを中和するためにDMEM + 10% FCS + 1% P/S 800 μlを加える。細胞を再懸濁する。</li>
	<li>細胞を組織培養処理されていない円錐形の96ウェルプレートに移す。室温で400 x gで5分間遠心分離する。ペレットを冷PBS 200 μlで再懸濁する。</li>
	<li>4 °Cで400 x gで5分間遠心分離する。上清を捨て、冷PBS 200 μlで再懸濁する。</li>
	<li>4 °Cで400 x gで5分間遠心分離する。上清を捨て、氷冷80%アセトン 150 μlで再懸濁する。</li>
	<li>室温で15分間、細胞を固定する。</li>
	<li>4 °Cで400 x gで5分間遠心分離する。上清を捨て、冷PBS + 0.1 % BSA 200 μlで再懸濁する。</li>
	<li>4 °Cで400 x gで5分間遠心分離する。上清を捨て、anti-NP-RSV-FITC（PBS + 1% BSAで1:50に希釈）50 μl、またはIgG2 anti mouse-FITC 50 μl（これはアイソタイプコントロールであるため、同じ抗体濃度を使用すること）で再懸濁する。</li>
	<li>以降のプロトコルでは、チューブを遮光して保管する。4 °Cで少なくとも1時間インキュベートするが、必要に応じて一晩まで延長可能である。</li>
	<li>冷PBS + 0.1% BSA 150 μlを加える。</li>
	<li>4 °Cで400 x gで5分間遠心分離する。上清を捨て、冷PBS + 0.1% BSA 200 μlで再懸濁する。</li>
	<li>4 °Cで400 x gで5分間遠心分離する。上清を捨て、冷PBS + 0.1% BSA 200 μlで再懸濁する。FACS測定までプレートを氷上で遮光して保持する。</li>
	<li>フローサイトメーターで感染細胞を測定する。</li>
</ol>
3.3. FITC-50の算出
<ol>
	<li>フローサイトメトリー解析プログラムを使用し、陰性対照（アイソタイプコントロール）を用いてカットオフ値を設定する。グラフ形式はPseudocolorを使用する。陽性細胞がQ3領域に入るようにクアドラントゲートを引く。両方のアイソタイプコントロールにおいて、偽陽性率は0.2%以下である必要がある。</li>
	<li>データをスプレッドシートプログラムにエクスポートし、各希釈度におけるFITC+細胞の割合を示す表を作成する。各実験の各値から、アイソタイプコントロールで決定した偽陽性の平均値を差し引く。</li>
	<li>統計プログラムで新しいファイル（XY散布図、単一X軸および複数Y列）を開く。データをこのプログラムにコピーする：X = 希釈度、Y = 感染細胞%、n = 3とし、各希釈度について2回の測定値の平均を使用する。非線形回帰分析（一相性指数関数減衰）を行う。曲線がデータポイントに適合しているかを確認し、適合していない場合は別の統計解析を選択する。</li>
	<li>曲線の方程式と方程式の値をスプレッドシートプログラムにコピーする。Y = 50%となるX値を算出する。これに基づき、50%の感染が認められる希釈度におけるFITC検出感染粒子/ml (FIP/ml) を以下の式を用いて計算し、FITC-50値を決定する： 
	<img alt="FITC50計算式。蛍光強度測定方程式を示す図。" fo:src="/files/ftp_upload/50766/50766eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50766/50766eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程式 1"> 
	A = A549細胞の1ウェルあたりの平均数 
	B = 感染に使用した1ウェルあたりのウイルスのμl 
	C = 50%の感染が認められる希釈度</li>
</ol>
4. 健康ボランティアの血液からの末梢血単核細胞 (PBMC) の分離
<ol>
	<li>インフォームドコンセントを得た健康なボランティアから、10 mlのEDTA採血管を用いて静脈血を採取します。10 mlの血液量から、約107 末梢血単核細胞 (PBMCs)</li>
	<li>これ以降の操作は、フローキャビネット内（クリーンベンチ内）で無菌的に行ってください。</li>
	<li>50 mlチューブ内で、室温のPBSを用いて血液を2倍に希釈します。50 mlチューブ1本あたり、希釈血液の最大合計容量は35 mlまでとしてください。</li>
	<li>50 mlの滅菌シリンジに、滅菌済みのルアーロック針を取り付けます。シリンジに密度勾配培地を吸い込みます。希釈血液が入ったチューブの底に針を配置し、希釈血液の下に15 mlの密度勾配培地を慎重にピペッティングします。密度勾配培地と血液の間に明確な境界線を維持してください。</li>
	<li>室温で800 x g、20分間遠心分離する。この際、加速度は9（最大）に設定し、ブレーキはオフにする。遠心分離機の温度を以下に設定する。 4 °C 使用後。</li>
	<li>密度勾配遠心分離により、複数の層が形成されます。最下層には赤血球を含むペレットが存在し、その上に好中球を含む銀色の層が形成されます。このペレットの上の透明な層には、密度勾配媒体が含まれています。密度勾配媒体と最上層の血漿層の間にある薄い層に、PBMCが含まれています。</li>
	<li>パステールピペットを用いてPBMCを慎重に回収し、新しい50 mlチューブに移します。これ以降、PBMCは氷上に保持し、氷冷PBSを使用してください。氷冷PBSを加えて全量を50 mlとし、400 x gで10分間遠心分離します。 4 °C （ブレーキを9に設定した状態で）。</li>
	<li>吸引により上清を除去し、ペレットを50 mlの氷冷PBSで再懸濁して、400 x gで10分間遠心分離する。 4 °C、2回繰り返す。</li>
	<li>上清を廃棄した後、氷冷した培地（RPMI + 1% P/S）を1 ml加え、計数盤を用いて細胞数をカウントする。</li>
	<li>細胞濃度を5 x 10に調整します。6 PBMC/ml</li>
</ol>
5. 生HRSVによるPBMCの刺激
<ol>
	<li>実験のセットアップを行い、各条件について実験的なデュプリケート（2連）を含めてください。</li>
	<li>必要なすべての刺激剤を培地（RPMI + 1% P/S）で希釈します。1ウェルあたりの最終容量が200 μlになることに留意してください。刺激剤の添加量は50 μlとなるため、4倍濃度の刺激ストック液を調製します。</li>
	<li>ラウンドボトム96ウェルプレートの各ウェルに、前述の細胞懸濁液を100 μlずつ加えます（5 x 105 PBMC/well）。</li>
	<li>希釈した刺激剤を各ウェルに50 μlずつ加えます。2種類の異なる刺激剤を添加することが可能で、その場合の合計容量は200 μlとなります。刺激剤が1種類のみ必要な場合は、培地を用いて容量を200 μlに調整してください。</li>
	<li>96ウェルプレートを、5% CO2インキュベーター内、37 °Cで規定の期間インキュベートします。ほとんどのサイトカインでは、24時間のインキュベーションで十分です。</li>
</ol>
6. 刺激の読み取り
<ol>
	<li>インキュベーション期間後、96ウェルプレートを室温で450 x gで5分間遠心分離し、細胞を底面に回収する。</li>
	<li>上清を回収し（最大180 μlまで）、後のサイトカイン分析（-20 °C）またはウイルス産生（-80 °C）のために保存する。</li>
	<li>ペレットに含まれる刺激後のPBMCは、溶解バッファーを加えてqPCRまたはウェスタンブロットで分析するか、あるいはフローサイトメトリー分析のために染色することができる。</li>
</ol>

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</ol>

開示するものは何もありません。

この研究では、HRSV による PBMC の感染が、炎症経路を研究できる高速で信頼性の高いモデル システムであることを実証します。PBMCを刺激するには、HRSVストックを調製して定量化する必要があります。
複数の細胞株がHRSV感染にかかりやすいです。HRSV培養に最もよく使用される細胞株は、HEp-2、HeLa、およびVero細胞です。ただし、Vero細胞でのHRSVの培養により、HRSV10のGタンパク質が切断されることが示されているため、HRSVの培養にVero細胞を使用することはお勧めしません。また、欠陥のある干渉粒子を生成するリスクがあるため、培養用の細胞に感染するために常に少量のウイルスを使用してください11。欠陥干渉粒子(DIP)は、ゲノムの一部または全部を見逃すウイルス粒子です。したがって、DIPはそれ自体で感染を維持することができず、感染性ウイルスに依存することができます。ゲノムが小さいため、完全に機能するウイルスよりも効率的に複製され、多数の非感染性粒子が発生する可能性があります。これらのDIPは、複製に依存する定量...

ヒト呼吸器合胞体ウイルス(HRSV)は、子供の下気道感染症の最も一般的な原因です。毎年、3,300万人以上の5歳未満の子どもがHRSVに感染し、300万人以上の入院と約20万人の死亡につながっています1。HRSVは、基礎疾患を持つ高齢者や成人にも重大な脅威をもたらすことを示唆する証拠が増えています2。
幼児のHRSV感染症の大部分は、風邪に匹敵する軽度の症状を呈し、臨床的な介入を必要としません。しかし、重症細気管支炎のために入院や人工呼吸器を必要とする患者はごくわずかです。
HRSV疾患の病因の一部は、感染に対する宿主の過剰で不十分な免疫反応です3,4。これは、いくつかの観察結果によって説明されています。最大の病気の期間は、多くの場合、ウイルス感染のピークに先行し、感染組織の細胞浸潤と炎症性サイトカインの放出とよりよく一致します3。別の証拠は、1960年代のホルマリン不活化HRSV(FI-RSV)試験から得られています。このワクチンは、幼児に防御を誘導する代わりに、免疫反応を誇張し、呼吸器疾患の進行と罹患率と死亡率の上昇をもたらしました。
HRSV感染の病因を研究するために、いくつかのモデルが開発されています。HEp-2やA549などの連続細胞株は、in vitroでのHRSV感染の研究に広く使用されています。上皮細胞はHRSV感染5の主要な標的であるため、これらの細胞タイプに多くの焦点が当てられてきました。しかし、in vivoの状況ははるかに複雑で、1つの細胞タイプに限定されません。これらの複雑な相互作用を調べるために、HRSVの病因を研究するためにいくつかの動物感染モデルが開発されました。これまで、異種(非ヒト)モデルと同族の宿主肺炎ウイルスモデルのいずれかに焦点を当てた2つの異なる戦略が採用されてきました。HRSV の異種モデルの例としては、チンパンジー、ヒツジ、ワタ ラット、マウスなどがあります。その自然宿主におけるRSV感染は、ウシRSVとニューモウイルスをそれぞれ使用して、ウシとマウスで研究されています。
これらのモデルはそれぞれ病気の病因に関する重要な洞察を提供してきましたが、HRSVは人間に非常に適応しています。したがって、現在使用されている細胞株と動物モデルに加えて、HRSVによる刺激のモデルとしてヒト初代PBMCを使用することを提案します。ヒトPBMCは、幼児6、免疫不全の個人、健康な成人7、高齢者8など、特定の研究課題に対処するためにさまざまな個人から入手できます。PBMCは、感染の先天的な側面やウイルスへの適応反応を研究するために使用できます。HRSV疾患の病因に重要な活性化炎症経路は、mRNAおよびタンパク質レベルで研究できます。さらに、免疫細胞(のサブセット)のウイルス感染は、フローサイトメトリーによって決定できます。私たちは以前にこのモデルを使用して、HRSV感染と細菌のリガンドムラミルジペプチド(MDP)の相乗効果を特定しました 炎症誘発性サイトカイン7の誘導。私たちは、HRSV疾患の病因に関与する炎症経路を研究するための堅牢で簡単かつ迅速なin vitroモデルとして、ヒト一次PBMCのHRSV刺激を使用することを提案します。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>PBS Ca2+ Mg2+またはフェノールレッド</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14025-100</td><td>HBSS、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッド</td></tr><tr><td>なし</td><td>DMEM Invitrogen</td><td>31966-047</td><td>DMEM、高グルコース、GlutaMAX、ピルビン酸</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>72400054 RPMI 1640 Medium, GlutaMAX, HEPES</td></tr><tr><td>Reduced Serum Medium (Opti-MEM)</td><td>Invitrogen</td><td>51985-026</td><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Greiner Bio-one</td><td></td><td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td>Albumin from bovine serum</td></tr><tr><td>P/S</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>ペニシリン-ストレプトマイシン、液体</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td>0.05% トリプシン-EDTA (1x)、フェノールレッド</td></tr><tr><td>HeLa細胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>A549細胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>S7903</td><td>ショ糖BioXtra、&ge;99.5%</td></tr><tr><td>IgG2 抗マウスFITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>555057</td><td>Ms IgG2b K FITC アイソタイプコントロール</td></tr><tr><td>抗NP-RSV-FITC</td><td>Abcam</td><td>ab25849</td><td>抗呼吸器合胞体ウイルス抗体 [671] (FITC)</td></tr><tr><td>密度勾配培地 (Lymphoprep)</td><td>Axis-Shield</td><td>1114545</td><td></td></tr><tr><td>EDTA tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>367525</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Merckミリポア</td><td>1000141000</td><td>分析</td></tr><tr>用アセトン<td colspan="4">Material</td></tr> <tr><td>Centrifuge Tubes</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td>326823 薄肉、ポリアロマー、38.5 ml、25 mm x 89 mm</td></tr><tr><td>SureSpin 630ローター、36 mlバケット付き</td><td>Sorvall</td><td>79368</td><td>スイングバケット チタンローター</td></tr><tr><td>Sorvall WX80 超遠心分離機</td><td>Sorvall</td><td>46900</td><td></td></tr><tr><td>CB 150l CO2インキュベータ</td>ー<td>バインダー</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト呼吸器合胞体ウイルス感染に対するヒト末梢血単核細胞の免疫応答を研究するためのインビトロモデル

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

ヒト呼吸器合胞体ウイルス(HRSV)感染症は、軽度の感染症から生命を脅かす細気管支炎まで、幅広い疾患の重症度を示します。重症化の病因の重要な部分は、免疫病理学につながる免疫応答の増強です。	ここでは、HRSV感染に対するヒト免疫細胞の免疫応答を調査するために使用されるプロトコルについて説明します。まず、HRSVの培養、精製、定量に使用される方法について説明します。続いて、末梢血単核細胞(PBMC)に生HRSVを刺激するヒトinvitroモデルについて説明します。このモデルシステムは、自然免疫応答や適応免疫応答など、疾患の重症化に寄与する可能性のある複数のパラメータを研究するために使用できます。これらの応答は、転写レベルと翻訳レベルで測定できます。さらに、細胞のウイルス感染は、フローサイトメトリーを使用して簡単に測定できます。まとめると、PBMCと生HRSVによる刺激は、HRSV誘発性疾患に関与するメカニズムを調べるための迅速で再現性の高いモデルシステムを提供します。

ここで述べるHRSV A2の培養および精製方法では、1 mlあたり2 x 107から2 x 108のFITC-50定量感染性ウイルス粒子が得られます。FITC染色された感染細胞をカウントした顕微鏡分析の結果（結果は示さず）を、FACSによる定量結果（図1）と比較しました。両方の方法で同様のタイターが得られましたが、FACS法は実験間の標準偏差が大幅に低く、手間も少なくて済みました。
PBMC刺激実験を行う際は、刺激・分画法（stimuli-fraction method）の使用を推奨します。この方法では、条件を刺激条件と分画条件に分けます（図 2）。刺激条件は標準的な条件（例：RPMIおよびHRSV）です。分画条件はテスト条件（例：RPMI、MDP、およびLPS）です。各実験には必ず陰性対照と陽性対照を含めてください。本実験では、LPSが陽性対照であり、RPMIが陰性対照です。TNFαやIL-1βなどの炎症性サイトカインを測定する場合、...

ヒト呼吸器合胞体ウイルス(HRSV)は、幼児に重度の細気管支炎を引き起こす可能性があります。重度のHRSV疾患の病因の一部は、宿主の免疫応答によって引き起こされます。HRSVによるヒト初代免疫細胞の刺激は、炎症経路と感染の活性化を研究するための迅速で再現性の高いモデルシステムを提供します。

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

この手順の全般的な目的は、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）感染に対するヒト免疫細胞の反応を研究することです。まず、HeLa細胞を用いて感染性RSVストックを培養し、次に、超遠心分離法によって培養したRSVストックを精製することでこれを達成します。次に、密度勾配遠心分離法により、ヒト末梢血から主要な免疫細胞を単離します。最終ステップとして、単離した免疫細胞をウイルスで刺激します。最終的に、RSV感染に対する細胞性免疫応答を、ELISA、qPCR、またはフローサイトメトリーによって評価できます。この技術は、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）感染症の研究において価値のある手法です。RSVはヒトに対して高い適応能を有しています。したがって、ウイルスの病原性に関与する炎症経路を研究するには、ヒト免疫細胞を使用することが重要です。このビデオで使用しているウイルスはRSVですが、この手法はインフルエンザウイルスやライノウイルスなどの他のウイルスの研究にも容易に適応させることができます。まず、ヒトRSVストック vial を 37 °C の恒温水槽で温めて解凍します。ウイルスが解凍されたら、フラスコ1本あたり 4 mL の感染培地を用いてストックを希釈します。MOIを0.1以下に維持し、細胞が乾燥しない範囲で可能な限り少ない全量でウイルスをHEK293細胞に添加します。その後、37 °C、5% CO2の条件下で2〜4時間培養し、培地を均一に分散させるため15分ごとにフラスコを旋回させます。次に、接種液を除去し、PBSで細胞を1回洗浄します。次に、フラスコに15 millilitersの培地を加え、同様の培養条件下で3〜5日間インキュベートします。通常明視野顕微鏡を用いて、ウイルス誘発性の細胞病変の変化がないか毎日1回観察します。これらの変化が観察されたら、細胞をスクレイピングしてRSVを回収し、懸濁液を滅菌済みの50 milliliterチューブに集めてボルテックスし、室温で1800 Gsで10分間遠心分離して細胞残渣をペレット化します。RSVはこの速度では沈殿しないため、上清を1 mLずつの分注で播種ストックとして-80 °Cで保存できます。今後の使用に備えた分注液は、感染性ウイルス粒子の消失を防ぐため、常に液体窒素で急速凍結させてください。RSVを精製するには、まず超遠心機の手に滅菌済み遠心チューブを1本ずつ配置することから始めます。次に、調製直後のフィルター滅菌済みスクロース溶液を各チューブの底部に5 mLずつ加えます。続いて、スクロース溶液を乱さないよう、また層が分離した状態を維持するように注意しながら、RSV溶液30 mLをスクロース溶液の上に非常にゆっくりと加えます。次に、無菌状態を維持するためフローキャビネット内で、キャップを含めた6つの超遠心機用バケットの重量を、滅菌PBSを用いて相互に0.1 g以内に精密にバランス調整します。ウイルスを20,000 RCF、4 °Cで1.5時間遠心分離します。遠心分離が完了したら、滅菌済みピンセットを使用して、バケットから遠心チューブを慎重に取り出します。ウイルス粒子はショ糖層を通過し、ペレットを形成しています。遠心チューブをウイルス廃棄用フラスコに傾け、滅菌された表面でチューブを逆さまにして液を切り、排出させます。ペレットを完全に乾燥させないでください。次に、1 mLのHPSSを注意深くペレットにかけ、遠心チューブを再び傾けてHPSSを排出させます。その後、ペレットが乾燥しないように注意しながら、チューブを再び逆さまにします。次に、ペレットを別の1 mLのHBSSで40回トリチュレーションします。気泡が形成されるとウイルスが破壊される可能性があるため、注意してください。その後、ウイルスの分注液を液体窒素で急冷凍結します。定量および今後の使用まで、ウイルスを-80 °Cで保存します。健康なボランティアから10 mLのEDTAチューブに採血した後、室温のPBSを用いて血液を最大2倍まで希釈し、50 mLチューブ内で希釈血液を最大35 mLにします。次に、滅菌済みのルアーロック針を滅菌済みの50 milliliterシリンジに取り付け、密度勾配媒体をシリンジに吸引します。希釈血液の入ったチューブの底に針を配置し、密度勾配媒体と血液の間に明確な境界線を維持しながら、血液の下に15 millilitersの密度勾配媒体を注意深くピペッティングします。次に、室温にて、最大加速およびブレーキオフの設定で、800 GSで20分間細胞を分離します。分離後、チューブの底に赤血球がペレットとして形成され、その上に好中球の銀色の層が認められます。ペレット上の透明な層は密度勾配媒体であり、密度勾配媒体と最上層の血漿層との間の薄い層にPBMCが含まれています。パステールピペットを用いて慎重にPBMCを回収し、細胞を氷上の新しい50 milliliterチューブに移します。氷冷したPBSを加えて全量を50 millilitersとし、遠心分離完了後に細胞をペレット化します。上清を吸引し、氷冷したPBS 50 millilitersでペレットを2回洗浄します。2回目の洗浄後、ペレットに氷冷した培地1 milliliterを加え、細胞数をカウントして、細胞濃度を5×10⁶ pbmc/milliliterに調整します。生RSVでpbmcを刺激するには、まず96ウェル丸底プレートの各ウェルにpbmc 100 microlitersを分注します。次に、調製したばかりの2種類の刺激剤をそれぞれ50 microlitersずつ加えます。プレートを37°C、5% CO2条件下で24時間インキュベートし、その後プレートを遠心分離して、後でELISAで分析するために上清を回収します。ペレット内の刺激したPBMCは、qPCRで分析するか、フローサイトメトリー用に染色して分析することが可能です。PBMC刺激実験を行う際は、本手法では刺激分画法の併用が推奨されます。条件は、RPMIやヒトRSVなどの標準刺激条件と、mial、ジペプチド、またはLPSなどの試験分画条件に分けられます。重要な点として、RPMI単独のような陰性対照と、LPSのような陽性対照が常に各実験に含まれています。RSVで24時間刺激した後、異なるPBMC集団は用量依存的な感染率を示し、RSV感染効率に差が見られます。ウイルスで24時間刺激した後、PBMCにおけるTNF alphaまたはインターフェロンgammaの発現をqPCRで解析すると、RSVがこれら2つの炎症性サイトカインの転写を強力にアップレギュレートすることが示されます。逆に、miamジペプチドまたはLPSによる刺激では、mRNA発現はわずかにとどまります。P BMCsをRSVとMIALジペプチドで同時に刺激すると、強力な相乗的なアップレギュレーションが観察されます。刺激したpbmcについて、ELISAを用いてTNF AlphaまたはInterferon gammaの産生能を解析しました。転写レベルでの観察結果とは対照的に、RSVはP BMCsによるTNF alphaおよびinterferon gammaタンパク質分泌の誘導能が低く、miamジペプチドによる刺激では、少量のTNF alphaが産生され、interferon gammaは産生されませんでした。転写解析と同様に、サイトカイン誘導がRSVの複製に依存しているかを確認するためのコントロールとして、RSVとMIAMジペプチドで共刺激した際、TNF alphaおよびインターフェロンガンマの両方が相乗的なアップレギュレーションを示しました。P BMCsを生存RSVまたはbeta propal lactoneで不活化したRSVで刺激したところ、グラフに示すように、生存RSVと不活化RSVの両方が炎症性サイトカインの産生を誘導しました。RSVを用いた実験は、バイオセーフティレベル2（BSL-2）のラボにある生物学的安全キャビネット内で実施する必要があることに留意してください。さらに、この手法を試みる際は、手順全体を通してエンドトキシンフリーの試薬および材料を使用することが極めて重要であることを忘れないでください。このビデオを視聴することで、RSVを用いてヒトPBMCを刺激する方法と、免疫応答を分析するために使用できるいくつかのアッセイについて十分に理解できたはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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