ヒト呼吸器合胞体ウイルス感染に対するヒト末梢血単核球の免疫応答を研究するためのin vitroモデル

この手順の全体的な目的は、ヒトの免疫細胞の呼吸器合胞体ウイルスまたはRSV感染への反応を研究することです。これは、まずhelocytes上で感染性RSVストックを培養することによって達成されます。2番目のステップでは、培養されたRSVストックを超遠心分離によって精製します。

次に、主要なヒト血液免疫細胞を密度遠心分離によって分離します。最後のステップでは、分離された免疫細胞をウイルスで刺激します。最終的に、RSV感染に対する細胞性免疫反応をEiza QPCRまたはフローサイトメトリーで評価できます。

この技術は、呼吸器合胞体ウイルス感染を研究するための貴重な追加手法です。RSVは人間に高度に適応しています。したがって、ウイルスの病因に関与する炎症経路を研究するために人間の免疫細胞を使用することが重要です。

このビデオで使用されているウイルスはRSVですが、この方法はインフルエンザウイルスやライノウイルスなどの他のウイルスを研究するためにも容易に適応できます。まず、人間のRSVシートストックと37度セルシウスの水浴を温めます。ウイルスが溶けた後、感染培地の4ミリリットルアライコットあたりのフラスコでストックを希釈します。

MOIを0.1以下に保ち、ウイルスをheli細胞に加え、細胞が乾燥しないようにできるだけ低い総量で加えます。そして、37度セルシウスと5％CO2で2〜4時間、15分ごとにフラスコを振って培地を再分配しながら培養します。次に、接種物を除去し、PBSで細胞を1回洗います。

その後、フラスコに15ミリリットルの培養液を加え、同じ培養条件下で3〜5日間インキュベートします。ウイルス誘発性細胞病理学的変化について、通常の明視野顕微鏡で毎日細胞を観察します。これらの変化が観察されたら、細胞をこすり取ってRSVを収穫し、無菌の50ミリリットルチューブで懸濁液を収集し、細胞をこそぎ取り、室温で1800Gsで10分間遠心分離して細胞粗片をペレットにします。

RSVはこの速度ではペレット化されないため、上清をマイナス80度セルシウスで1ミリリットル単位のシーディングストックとして保存できます。将来の使用のためにRSVをスナップフリーズし、液体窒素で凍結保存して感染性ウイルス粒子の損失を防ぎます。RSVを精製するには、超遠心分離機の各バケットに無菌遠心チューブを置きます。

次に、各チューブの底に新鮮に調製されたフィルター滅菌されたサクローズ溶液5ミリリットルを加えます。次に、サクローズ溶液を乱さず、層を明確に保ちながら、RSV溶液30ミリリットルをサクローズ溶液の上に非常にゆっくりと加え、滅菌を維持するためにフローキャビネットで無菌PBSで6つの超遠心分離バケットを0.1グラム以内に慎重にバランスを取ります。キャップを含みます。4度セルシウスで20,000RCFで1.5時間、ウイルスをスピンダウンします。

そして、スピンが完了したら、無菌のフォーセットを使用して、バケットから遠心チューブを慎重に取り出します。ウイルス粒子はサクローズ層を通過してペレットを形成します。遠心チューブをウイルス廃棄フラスコに傾け、チューブを滅菌表面で逆さまに排水させます。

ペレットを完全に乾燥させないでください。次に、HPSSを1ミリリットル流し、遠心チューブをもう一度傾けてHPSSを排出します。次に、ペレットが乾燥しないように注意しながら、チューブを再度逆さまにします。

次に、HBSSの別の1ミリリットルでペレットを40回三重にし、気泡の形成を避けるように注意します。これはウイルスを破壊する可能性があるためです。次に、液体窒素でウイルスのアライコットをスナップフリーズします。ウイルスをマイナス80度セルシウスで保管し、定量化およびさらなる使用の前に使用します。健康なボランティアから10ミリリットルのEDTAチューブで採血し、室温のPBSで最大2倍、最大35ミリリットルの希釈血液を50ミリリットルのチューブに希釈します。

次に、無菌ルールロック針を無菌50ミリリットルスプリンガーに取り付け、次に密度勾配培地をスプリンガーに吸引します。希釈血液のチューブの底に針を置き、密度勾配と血液の間のクリーンな境界線を保ちながら、15ミリリットルの密度勾配培地を血液の下に慎重にピペットします。今、最大加速度で20分間、800GSで室温で、ブレイクオフで細胞を分離します。分離後、赤血球はチューブ底部のペレットで、上部に白血球の銀色の層があります。

ペレットの上にある透明な層には、密度勾配培地が含まれ、密度勾配培地と血漿層の間の薄い層には、pbmcが含まれています。パステルピペットを使用して、pbmcを慎重に収集し、次に氷の上に新しい50ミリリットルのチューブに細胞を移します。50ミリリットの容量で氷の冷たいPBSを加え、スピンが完了したら細胞をペレット化します。

上清を吸引し、ペレットを氷の冷たいPBSで2回洗い、2回目の洗浄後、ペレットに氷の冷たい培地1ミリリットルを加え、細胞を数え、細胞濃度を5倍の10の6 pbmc /ミリリットルに調整します。生きているRSVでpbmcを刺激するには、まず96ウェル丸底プレートの各ウェルにpbmc 100マイクロリットルを加えます。次に、各ウェルに新鮮に希釈した刺激物50マイクロリットルを加えます。

プレートを37度セルシウスと5％CO2で24時間インキュベートし、プレートを遠心分離し、後でElizaによる分析のために上清を収集します。ペレットの刺激されたpbmcは、QPCRで分析したり、フローサイトメトリーに染色したりできます。A-P-B-M-C刺激実験を実施する際は、この方法で刺激分画法が提案されます。

条件は、RPMIや人間のRSVなどの標準的な刺激条件と、mial、ジペプチド、またはLPSなどのテスト分画条件に分けられます。重要なことに、RPMIだけなどのネガティブコントロールと、LPSなどのポジティブコントロールが、RSVで24時間刺激した後、異なるPBMC集団が感染率に依存した用量依存性とRSV感染効率の違いを示すため、常に各実験に含まれます。ウイルスによる24時間の刺激後、PBMCのTNFアルファまたはインターフェロンガンマの発現に対するqPCRのR分析は、RSVがこれらの2つの炎症性サイトカインの転写の強力な上方制御を誘導することを示しています。逆に、miamジペプチドまたはLPSによる刺激は、弱いmRNA発現のみをもたらします。

PBMCがRSVとMIALジペプチドの両方で刺激されると、強い相乗的上方制御が観察されます。刺激されたpbmcは、ElizaによってTNFアルファまたはインターフェロンガンマの産生も分析されました。転写レベルでの観察とは対照的に