MTTアッセイにより合成と細胞毒性の評価：抗がん金属錯体

この手順の全体的な目標は、抗がん剤を調製し、MTTアッセイによってその細胞毒性を評価することです。これは、まず金属系抗がん剤を合成することで実現します。2番目のステップは、がん細胞の96ウェルプレートを調製することです。

次に、金属系抗がん剤をがん細胞に挿入します。最後のステップは、ミトコンドリアおよび細胞質酵素によるMTTの還元が禅を形成することであり、最終的に抗癌活性と半値最大阻害濃度を測定するMTTアッセイによる細胞生存率の測定です。または、化合物の50の値が決定されていることがわかります。

一般的に、この方法に不慣れな人は、検査室の労働者の十分な注意が必要であり、厳格なスケジュールに配置される多段階の手順であるため、苦労する可能性があります。細胞プレートの調製は簡単ではないため、生存細胞を扱うには特定のガイドラインに従う必要があるため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。グローブボックス内で作業し、リガンド前駆体の0.42ミリモルを乾燥THFに溶解することにより、バナジウム5錯体を調製します。

次に、THF中の同量のバナジウムotトリスイソップオキシドの攪拌溶液にそれを加えます。反応混合物を室温で15分間撹拌してから、真空下で揮発性物質を除去します。次に、冷たいヘキサンを加えて真空下で取り除きます。

濃い紫色の粉末は、定量的な収率で得られるべきです。得られた化合物の8ミリグラムをエピオーフバイアルに秤量します。チタン4錯体を調製するには、リガンド前駆体の0.35ミリモルを乾燥THFに溶解し、THF中のテトライソップオキシドチタンと同等の量の攪拌溶液に加えます。

反応混合物を室温で2時間撹拌します。次に、真空下で揮発性物質を除去して、定量的な収率で黄色の製品を生成します。得られた化合物の8ミリグラムをephバイアルで秤量し、96ウェルプレートの初回培養でHT 29細胞を調製します。

テキストプロトコルに記載されているように、75平方センチメートルのフラスコ内の細胞は、HT 29細胞が最大限に流暢になったときに培地を取り出します。細胞を1ミリリットルのトリプシンEDTA溶液で洗浄した後、同じ溶液1ミリリットルを加えて5分間インキュベートします。HT 29細胞をフラスコから分離し、10ミリリットルの培地を追加してトリプシン活性を無効にします。

細胞混合物の5ミリリットルをチューブに移します。ピペットを使用して、細胞混合物を数滴カウンターチャンバーに移します。カウンターチャンバーには、5×5の正方形の2つの部分があります。

顕微鏡を使用して、各部分の5つの代表的な正方形の細胞を数えます。角に4つの正方形、中央に1つの正方形。存在するセルの推定量を計算します。

各パーツの 5 つの代表的な正方形のセルを合計します。2 つのパーツの平均合計を計算し、20 で割ります。次に、0.6を商で割ります。

受け取った数は、プレートごとに必要な細胞混合物の量です。この計算は、ウェルあたり9, 000個の細胞を含むプレートを指します。ピペットを使用して、プレートあたりに必要な細胞混合物の量を13.2ミリリットルの培地と組み合わせます。

混合物を96ウェルプレートに加えます。ウェルあたり200マイクロリットルの11チャンネルピペットを使用し、合計66ウェルを含む6ラインで。各行の 1 つのウェルは、ブランク コントロールに対して空のままにする必要があります。

プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素と24時間インキュベートして、細胞がプレートに付着して最初に化合物を挿入できるようにし、200マイクロリットルの乾燥THFを8ミリグラムの重量化合物に加えます。最初に60マイクロリットルのTHFを9つの異なるeinorファイルに加えて、化合物溶液をさらに希釈します。各溶液について、ピペットを使用して、化合物溶液から最初のeinorファイルに60マイクロリットルを移します。

その後、60マイクロリットルを懸濁して次のバイアルに移し、10種類の濃度が得られるまで続けます。THFの各濃度の20マイクロリットルを180マイクロリットルの培地で希釈します。また、180マイクロリットルの培地に20マイクロリットルのTHFを添加して、溶媒のみのコントロール溶液を調製します。

次に、得られた各溶液から各ウェルに10マイクロリットルを加えます。それはすでに200マイクロリットルの前述の細胞溶液を培地中に含んでおり、化合物の最終濃度を1リットルあたり最大200ミリグラムにしています。各系統には、化合物で処理された細胞が10種類の濃度で含まれています。

1つは、溶媒のみで処理した細胞を含むコントロールウェル、もう1つは細胞を含まないウェル ブランクコントロールの場合、化合物の各測定を3回繰り返すようにラインを設定します。ロードしたプレートを摂氏37度で5%二酸化炭素雰囲気中で3日間インキュベートします。テキストプロトコルで説明されているように、11チャンネルピペットを使用してMTT溶液を調製します。

ブランクコントロールウェルを除く各ウェルに20マイクロリットルのMTT溶液を追加します。インキュベーション後、プレートをさらに3時間インキュベートします。各ウェルから培地溶液を取り出し、各ウェルに200マイクロリットルのイソプロパノールを加えます。

ホルミンを溶解するには、プレートを均一になるまで30分間攪拌します。マイクロプレートリーダー、分光光度計で均質な溶液の200マイクロリットルに対して550ナノメートルの吸光度を測定し、3つの異なる日に各測定を繰り返します。次に、測定値からブランクコントロール吸光度値を差し引いて細胞生存率を算出し、その結果をTHF溶媒コントロール値の吸光度で割って100%を掛けた半値最大阻害濃度値をグラフ化ソフトを用いて算出する。

報告されたIC50は、少なくとも3つの異なる日に収集されたすべてのIC50値の平均であり、エラー値は標準偏差です。MTTアッセイから受け取ったデータを分析して、化合物の細胞毒性を評価します。測定は、偶数点分布、各プラトー上の少なくとも 3 つの点、および傾きを定義する 3 つの点を表示するグラフを生成する濃度の範囲で実行する必要があります。

高濃度または低濃度での測定値が不十分な場合、IC 50 値の決定に必要な曲線の非線形回帰適合が損なわれ、その結果、精度が低下します。非線形回帰適合によって決定される相対IC 50値は、試験された化合物によって可能な細胞増殖阻害の50%につながる濃度に対応します。これは、測定された最大細胞生存率と最小細胞生存率の中間点として計算され、必ずしもそれぞれ100%と0%である必要はありません。

プロトコルに記載されている実験の結果を調べるとき。シスプラチンだけでなく、チタンやバナジウムの錯体も高活性であることは明らかです。また、所与の化合物の最大阻害値が100%に近いほど、異なる化合物間でIC50の値を比較するときに、相対的なIC50値が絶対値に近いことも注目に値する。

チタン4錯体は最も高い細胞毒性を持ち、そのIC 50値はシスプラチンおよびバナジウム5錯体よりも低くなっています。しかし、遊離配位子は、異なる濃度で配位子を添加した後、著しく低下した活性を示します。細胞の生存率は、その複合体ほど大きく低下しません。

これにより、複合体の高い抗がん活性が金属中心に依存することが保証されます この手順を試みている間。常に無菌状態を保つことが重要です。このビデオを見た後、M-T-T-S-Aによる抗がん化合物の細胞毒性を評価する方法についてよく理解しているはずです。