細胞追跡のためのin vivoでの19 F MRI における
2013年11月25日
私たちは、ex vivoで標識された細胞とマウスモデルで、MRIを用いたin vivo細胞追跡のための一般的なプロトコルを記述します。細胞標識、画像取得処理および定量のための標準的なプロトコルが含まれる。
この手順の全体的な目標は、19 FMRIを使用してin vivoで19個のF標識細胞の数を画像化し、定量化することです。これは、臨床または前臨床の環境で行うことができます。これは、まず適切な19F剤で細胞を標識することによって達成されます。
これはほとんどの場合、生体外で行われます。第2のステップは、細胞当たりの19F含量を定量化することであり、これは既知の参照を持つ19FおよびMRを用いて行うことができる。細胞あたり19のF含有量は、実験中も一定であると仮定し、そうでない場合は補正係数を計算する必要があります。
次に、被験者を1つのHおよび19 FMRIを用いてin vivoでイメージングし、転写された標識細胞を局在化します。画像データからの定量化には、既知の参照と適切なイメージングパラメータが不可欠です。最後のステップは、画像データを処理してセル数を計算することです。
可能な限り、Ex vivo組織学またはその他の技術を使用してデータを裏付けることができます。最終的に、in vivo細胞追跡用の19 FMRIは、本文で概説されている特定の仮定を前提として、転写された細胞の局在と関連する期間にわたる数を研究するために使用できます。この手法は、超常磁性細胞標識を用いたHMRIのような既存の方法と比較した場合の主な利点として、交絡するバックグラウンドシグナルがなく、画像データから直接細胞数を決定できることです。
この方法は、細胞がどこにあるのか、さまざまな時点で細胞がいくつ存在するのかなど、細胞治療の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。このプロトコルを開始するには、まず、2ミリリットルの培地中の100万細胞あたり4ミリグラムの濃度で未成熟樹状細胞に19F標識を添加します。次に、静かに渦を巻いて混ぜます。
次に、樹状細胞を標識付きで3日間インキュベートしてから、成熟させて収穫します。次に、細胞を収集し、少なくとも3回洗って余分なラベルを取り除きます。PBSカウントでは、得られた細胞は、注射またはさらなる試験のために少量のPBSに再懸濁します。
ここで述べるプロトコールは、これらの特定の樹状細胞および標識に関連することに留意されたい。したがって、別の細胞タイプのプロトコールは、文献で見つけるか、研究者によって最適化される必要があります。既知の数の標識細胞をNMRチューブに入れます。
次に、10マイクロリットルの5%tri Fluorまたは酸性酸、またはTFAを追加します。TFAの共振周波数がラベルとの重なりにより不適当な場合は、代替の可溶性化合物を使用してください。NMR分光計に試料を入れ、フッ素19スペクトルを得ます。
次に、参照とサンプルのピークまたはサンプルのメインピークの下の相対面積を計算し、次にサンプル中の細胞あたりの平均フッ素数を計算します。このプロセス全体を平均して繰り返すと、統計的な有意性が得られることに注意してください。これは、MRIスキャナーで直接分光法を使用して行うこともできます。
また、この手順では、多数の細胞の平均フッ素19負荷のみが明らかになり、細胞間のばらつきは明らかにならないことにも注意してください。細胞の取り込みの均一性をチェックするには、19 F剤に蛍光成分が存在する必要があります。ここでは、シナリオ3のみが細胞の均質な標識を示していますが、これは計算では常に想定されていますが、これは、完全に麻酔をかけたマウスをクレードルに置き、スキャン中の動きを防ぐために固定することにより、イメージング用に設定された顕微鏡法などの補完的な技術を使用して検証できます。
また、スキャン中の生理学的モニタリングのために、温度と呼吸制御を接続します。必要に応じて、動物の隣に外部参照を配置し、参照と関心領域の両方をコイルの中心に配置する必要があります。19 Fイメージングの解剖学的基準として、従来の陽子MRIスキャンから取得を開始します。
次に、システムをセルマーカーの 19 F 周波数に調整し、19 FMRI スキャンを実行します。理想的には、19 FMRI スキャンは従来の MRI と同じ視野とスライス選択を持ちますが、解像度は低くなる可能性があります。次に、ここで示す式を使用して19Fのリファレンス・パルス・ゲインを求め、19のFNMRスペクトルを取込みて19Fの周波数を求めます。
無線周波数コイル依存性因子Cを別のin vitro実験で推定します。表面コイルなどの均質なBプロファイルの無線周波数コイルを使用すると、19 Fデータの定量化が妨げられる可能性があります。信号は19 F濃度だけでなく、コイルからの距離にも依存するためです。
したがって、1つのHチャネルでBの1つのマップを取得して、19Fデータを遡及的に補正します。これには、1つのHと19Fのコイルプロファイルが比例係数Cを除いて同一であり、19Fの領域で十分な1つのHバックグラウンド信号が提供されている必要があります。19 Fデータを補正するには、まず2フリップ角度法で1 Hフリップ角度マップを取得します。
非常に長いTRが1つのHTに対して3倍を超えるグラジエントエコースキャンを使用し、コイルの近くで推定フリップ角度が90度をわずかに下回る。次に、最初のスキャンの2倍のフリップ角度で2番目のグラジエントエコースキャンを取得します。1 番目と 2 番目のグラジエント ECHO スキャンの信号と感度を使用して、vle X、Y、Z での 1 つの H フリップ角度アルファを計算します。
19 Fのフリップ角度は、係数1を除いて同じですが、比例Bプロファイルにより、励起フリップ角度アルファ、リフォーカスフリップ角度2アルファのスピンエコーシーケンスからの19 F信号強度の減衰が、信号受信中に画面に表示されます。ここでは、不完全な励起による減衰が見られます。次に、全体的な減衰を計算できます。
なお、完全90度の場合には1つに正規化され、180度励起再焦点フリップ角度の場合には、B19F画像信号強度を補正したSI19F補正したものをこの式で計算して、1枚のHと19Fの重ね合わせ画像を作成する。画像データをエクスポートし、画像Jなどの画像処理プログラムでファイルを開き、必要に応じて画像調整を適用し、すべての画像で同じ調整を維持するようにしてください。次に、19枚のF画像を偽色でレンダリングし、対応する1枚のH画像にオーバーレイします。
信号を位置を特定するには、関連するセルを含む19F等級の画像を選択し、サンプルに示すように、関連するセル、参照、およびノイズ値の被写体外の領域に対してROIを可視描画します。ここでは、わかりやすくするために1つのH解剖学的スキャンが示されていることに注意してください。その後、単純な比例性とセルあたり 19 F の値を使用して、ROI のセル数を推定できます。
これらの画像は、ドレナージリンパ節にホーミングする19個のF標識細胞の転写を含むプロトコルの典型的な結果からのものです。ここでは、A TFAリファレンスを使用して100万個の標識細胞からなる19のFNMRスペクトルを示し、in vivoイメージングの代表的な処理済み画像を示します。細胞に使用されたのと同じラベルの密封容器からなる参照をマウスの足の間に置いた。
記載されたプロトコルを適用することにより、生の19F等級の画像に基づいて約120万の細胞数を計算しました。19 F画像は、グレースケールの解剖学的陽子画像に偽色で重ね合わされています。新しい実験を設定する際には、フッ素の検証が重要です。
MRIは、組織学、光学イメージング、またはその他の方法で結果が得られます。例えば、細胞が死滅してもフッ素標識が組織内に残り、偽陽性のシグナルにつながる可能性があることに注意することが重要です。
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概要
本記事では、ex vivoでラベル化した細胞を用いたマウスモデルにおける、MRIによるin vivo細胞トラッキングのプロトコルについて解説します。この手順では、in vivoでの19Fラベル細胞のイメージングと定量化に焦点を当てており、臨床および前臨床の両方の設定に適用可能です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- イメージング技術
- 細胞トラッキング
背景
- 生体内イメージングは、生体における細胞挙動を理解する上で極めて重要です。
- 19F MRIを用いることで、標識細胞の非侵襲的な追跡が可能になります。
- イメージングの準備として、細胞をex vivoで標識することが一般的です。
- 正確な解析には、標識細胞の定量化が不可欠です。
研究の目的
- in vivo で 19F ラベル化細胞を追跡するための信頼性の高い手法を開発すること。
- MRI技術を用いて細胞あたりの19F含有量を定量化する。
- さまざまな研究環境で活用可能なプロトコルを提供すること。
使用した手法
- 適切な19F標識剤を用いた細胞のex vivo標識。
- 19F MRIを用いた、生体内における標識細胞のイメージング。
- 既知のリファレンスを用いた細胞あたりの19F含有量の定量化
- 実験中に19F含有量が変動する場合の補正係数の算出。
主な結果
- 本プロトコルにより、19F標識細胞のin vivo追跡に成功した。
- 定量化法によって、細胞含有量に関する信頼性の高いデータが得られた。
- 本研究は、臨床および前臨床の両方の設定において19F MRIを使用することの実現可能性を実証している。
- 精度を維持するために、必要に応じて補正係数を適用することができる。
結論
- 開発されたプロトコルにより、生体内での細胞の追跡および定量能が向上します。
- 19F MRIは、細胞トラッキング研究に従事する研究者にとって有用なツールである。
- 今後の応用として、神経科学および生物学におけるさまざまな分野への拡大が期待されます。
よくある質問
産業界における重要性
in vivo 19F MRIは、電離放射線を用いずに非侵襲的な細胞トラッキングを定量的に行うことを可能にし、細胞治療における前臨床および臨床応用を支援します。この手法は、画像データから標識細胞を直接定量できるため、従来のMRI技術と比較して、背景信号による混同を低減させることができます。この能力により、生体内分布研究における予測の信頼性が向上し、細胞治療の開発パイプラインにおけるgo/no-go判断をサポートします。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：生体内における免疫細胞の局在と持続性を追跡することで、治療仮説の検証を可能にします。
- 運用の価値：標的組織への細胞移行を定量的に評価することにより、生物学的リスクの低減（de-risking）を支援します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：信頼性の高い細胞標識および定量プロトコルを確立することにより、下流のワークフローに向けて検証済みの生物学的システムを準備します。
- 運用的価値：細胞あたりの19F含有量の測定と参照ベースのキャリブレーションを通じて、アッセイの標準化と再現性に対応します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：動物モデルにおいて移入細胞の経時的な追跡を可能にすることで、発見から前臨床バリデーションまでの連続性を記述します。
- 運用的価値：細胞数と局在に関する定量的な経時データを提供することで、リスク調整後の進展判断を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、仮説検証からリード化合物の同定、さらには前臨床試験による検証に至るまでの創薬プロセスの連続体に組み込まれており、細胞治療候補物質の反復的な最適化を支援します。
- 探索生物学：本手法が、直接的な細胞定量化を通じて、どのように仮説検証、パスウェイの解明、および生物学的なリスク低減を支援するかを説明します。
- スクリーニング：19F MRI信号の細胞数への比例性を利用した、アッセイの準備状況、再現性、および定量的な出力について記述します。
- 分析：時系列および治療群間での条件比較に役立つ、測定値、リードアウト、または統計的出力について強調します。
- トランスレーショナルリサーチ：関連する疾患モデルにおける縦断的なイメージング研究を通じて、本手法を前臨床段階の連続性と結びつけます。
- エンタープライズ再利用：本手法を、複数のプロジェクトや治療領域にわたる多様な細胞タイプを追跡するための、再利用可能な機能として位置づけます。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 予測精度の向上、標的の検証、細胞運命研究におけるメカニズム的な曖昧さの解消。
- 運用的価値： 細胞種、ラベル、およびイメージングプラットフォームにおける標準化、再現性、および拡張性の確保。
- 戦略的価値： 細胞治療開発における、より適切なgo/no-go判断、資本効率の向上、および後期段階における生物学的リスクの低減。
- ポートフォリオへの影響： 定量的な生体内分布データに基づく、リスク調整後の優先順位付けおよび推進決定。
実施上の検討事項
- 細胞標識、MRI物理学、および画像定量化における専門的な科学知識が必要です。
- デュアルチューンMRIシステムおよび分光機能を含む、装置および分析インフラストラクチャが必要です。
- 標識プロトコル、参照化合物、および画像解析パイプラインに関するチーム間の標準化が求められます。
- モデルシステム、細胞種、および19F標識剤に応じた適合性の検討が必要です。
- 細胞あたりの19F標識が均一であるという想定や、直交法による検証の必要性などの実用的な制限があります。
