チップ上でのストレス誘発抗生物質感受性試験

次の実験の全体的な目標は、目的の抗生物質に対する細菌の感受性を迅速に決定することです。これは、まず対数期の細菌をマイクロ流体チャネルの底に固定化することによって達成されます。第 2 ステップでは、抗生物質と生きた死んだ蛍光染色物を含む培地を高流速でチャネルに押し込み、細菌にストレスを与え、抗生物質を標的とする生化学的経路を活性化します。

次に、細菌の生存率を監視するために、2分ごとに1時間にわたって位相差および蛍光画像が自動的に収集され、実験の各時点で取得された画像から正規化された細菌死率が計算されます。最終的に、細菌の抗生物質感受性の表現型は、正規化された細胞死率の経時的な増加から決定されます。この手法は、ブロス、希釈、マイクロカルチャーなどの既存の表現型感受性試験法と比較した場合の主な利点は、この方法が細菌分裂のモニタリングを必要としないことです。

むしろ、既存の小さな集団から直接、彼らの感受性プロファイルにアクセスすることができます。この技術の意味は、方法が迅速であるため、耐性細菌感染症の診断に向けて広がり、簡単に多重化および自動化することができます PDMS層を作成するには、1時間後に室温で真空チャンバー内で新たに調製したPDMS粘性混合物を脱気することから始め、スケールを使用して、DGAs PDMS混合物の事前定義された質量をアルミニウム金型に充填します。PDMSを金型の中央にゆっくりと注ぎ、金型を水平にし、ピンが露出しないように注意します。

PDMSを摂氏37度のオーブンで一晩硬化させます。翌朝、トップモールドプレートをリリースし、硬化したPDMSをモールドから慎重に取り外して、フローセルを組み立てます。まず、ガラス窓をフローセルのポケットに入れます。

次に、アクティブ面を上にして、フローセルのポケット内のガラス窓の上にコーティングされたスライドガラスを置きます。新しく作成された PDMS レイヤーで、チャネルが下を向いており、チャネル入力が金属プレートのスルー ホールと揃っています。層の間から空気をそっと押し出し、PDMSがガラス窓に面するようにPDMSスライドアセンブリを裏返します。

PDMSチャネル入力を金属プレートの貫通穴と重ねてから、プレッシャープレートを上に置き、ネジを締めます。次に、組み立てたフローセルを顕微鏡の下に置き、顕微鏡倍率を60倍に設定し、チャネル位置を事前に位置合わせして、フローセルにロードするための対数相細菌を準備します。継代培養後、250 RPMおよび37°Cで振とうしながら3時間インキュベートし、10ミリリットルの培養物を1,650倍Gおよび室温で2分間遠心分離する。

次に、上清を取り除き、ペレットを1ミリリットルの新鮮なMH 2培地に再懸濁します。次に、1ミリリットルのシリンジに短い長さのチューブを取り付け、チューブを1ミリリットルの培地で洗い流し、細菌懸濁液を引き込むときに気泡を避けるためにチューブに少量の培地を残します。次に、0.7ミリリットルの細菌をシリンジに装填し、フローセルの2つのチャネルを細菌細胞培養液で満たします。

チャネルの透明度は、バクテリアで満たされると変化します。次に、フローセルを摂氏37度で45分間インキュベートし、細菌がスライド表面に付着するのを待ちます。実験のための溶液を準備するため。

まず、2つの60ミリリットル注射器に新しく調製した制御溶液を充填し、2つの60ミリリットル注射器に新たに調製した抗生物質溶液を満たします。シリンジをフリックして気泡を取り除き、インプットチューブを取り付けて、それぞれの溶液をチューブの端に押し込みます。溶液はアルミホイルで包んでおき、試薬の光による劣化を防ぎます。

次に、実験溶液を入れたシリンジを一度に1つずつポンプに取り付けます。必要に応じてプランジャーを絞って、ポンプに取り付けます。シリンジ保持クロスバーでシリンジを所定の位置にロックします。

ポンプ速度を1分あたり1ミリリットル、ポンプ容量を60ミリリットルに設定し、すべてのシリンジから安定した液体の流れが見えるまでポンプを洗い流します。次に、インキュベーターからフローセルを取り出し、事前に不整列した顕微鏡ステージに取り付けて実験を開始します。次に、シリンジから来る1つの入力チューブと、廃液ボトルに送られる1つの出力チューブを各フローセルチャネルに接続します。

この時点で、実験は完全にセットアップされ、開始する準備が整いました。位相差取得時間を 10 ミリ秒、蛍光取得時間を 1600 ミリ秒に設定し、各位置の位相コントラストと蛍光画像を取得してから、フローを開始します。フロー画像の開始前に、チャネル内の負荷されたバクテリアの密度が高いため、チャネルの下部に焦点を合わせることができない場合があることに注意してください。

次に、液体の流れを開始します。顕微鏡がチャネルの底部に焦点が合っていることをすぐに確認してください。次に、フローの最初の1分以内にターゲット領域の位相コントラストと蛍光画像を撮影します。

最初の画像セットから 2 分ごとに画像を取得し、60 分のフローが発生します。必要に応じて焦点を合わせ直し、実験が適切に進行していることを確認するために、取得した位相差と蛍光データを調べることができます。このデータサンプルでは、感受性ひずみがチャネル1と2にロードされ、抵抗ひずみがチャネル3と4にロードされました。

実験の最後に、漂白剤と水を順次塗布して洗浄サイクルを実行します。4つの20ミリリットルの注射器に10ミリリットルの10%漂白剤溶液を入れ、4つの60ミリリットルの注射器に水を入れます。脱泡後、漂白剤を充填したシリンジをフローセルに取り付け、ポンプ速度を1分あたり1ミリリットル、ポンプ容量を3ミリリットルに設定します。

ポンプを3分間運転し、画面上のチャネルのクリーニングを監視します。3分後、漂白剤シリンジを水シリンジに交換し、1分あたり1ミリリットルで30分間運転します。最後に、画像処理ソフトウェアを使用して、各画像内の細菌の数をカウントします。

正規化された細菌細胞死率は、NFが蛍光画像カウントでカウントされた死んだ細菌の数に等しい次の式を使用して、時間の関数として計算します。また、NPは、位相差画像から決定される細菌の総数と等しくなります。ここに示す画像は、マイクロ流体フローセル内のオキサシリンに対する感受性ブドウ球菌アリア株の時間依存的な応答を示しています。

これらの象限は、実験開始から1分後と1時間後に取得された位相コントラスト画像と、ここに示す対応する蛍光画像を示しています。実験の終了までに蛍光細菌の数の大幅な増加が観察され、チャネル内の細胞死と、個々のエポキシコーティングスライドの確率的不均一性による抗生物質に対する菌株の感受性が示されています。この変動を説明するために、持続的な純粋なストレス下で実験全体を通して細菌細胞の損失があるかもしれません、死んだ細胞集団の各蛍光画像は、共に取得された位相コントラスト画像で正規化され、総細胞集団を同じ時点の1秒以内に与えます。

これらの拡大は、カウントアルゴリズムが、密集した位相コントラスト画像よりも蛍光画像内の個々の細菌を正確にカウントするのに成功していることを示しています。死細胞染色は、個々の死んだ細菌に対して高い蛍光コントラストを与えます。蛍光菌の数が全体の5%を超えることはめったにないため、各細菌は背景に比べて非常に明るいです。

そのため、蛍光菌を高い精度で容易に計数することができます。例えば、この実験では、5個の全828個の細菌が検出され、赤で強調表示された174個がここで死んでいると判断された。3つの異なる実験の正規化されたMSSAおよびMr.RSAのデータは、耐性株について予想されたとおりに示されており、正規化された細胞死は0.5%未満で低く、実験の過程で変化しません。

しかし、感受性株は、細胞死が着実に増加し、実験終了時には1%を超える高い値を示します。感受性株の細胞死の開始は実験によってわずかに異なりますが、通常は10分から30分の間に起こります。抗生物質耐性病原体を扱うことは非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には常に敗血症技術などの予防策を講じる必要があることを忘れないでください。

この技術は、研究者が細菌がストレスにどのように反応するかを探求する道を開き、新しい迅速診断の開発と新薬の発見に影響を与えます。