Name: チップ上でのストレス誘発抗生物質感受性試験 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: 学ぶマイクロ流体チップを用いたストレス誘発型抗生物質感受性試験法。高速フロー条件下で細菌を固定し、蛍光染色と位相差顕微鏡で生存率をリアルタイム評価します。迅速な薬剤感受性判定に貢献します。

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フラウンホーファー製造イノベーションセンターのエンジニアと学生に感謝します。実験システムの設計、加工、自動化を支援するために、アンドレアス・プリンツェン、ホルガー・ヴィルツ、ダグ・フォス、デビッド・チャーギン、そしてスドン・シュー博士に感謝します。ジュリア・クッカーツ、メラニー・ツィンマーマン、ニコ・クレッツマー、ティム・ガンベル、ジョシュ・ビジャヌエバ、清水実、カタジナ・クリガの実験に関する研究に感謝します。私たちは、ハーバード大学ブロード研究所のイメージングプラットフォームのアン・E・カーペンター博士とマーク・アンソニー・ブレイ博士が、CellProfilerの画像分析ルーチンの開発に協力していることを認めます。このプロジェクトは、国立アレルギー・感染症研究所のR21AI079474および1R01AI101446の賞によって部分的に支援されました。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立アレルギー・感染症研究所または国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。プロジェクトはフラウンホーファーUSAによってもサポートされました。

1. PDMS レイヤを作成する(図1)
<ol><li>PDMSと硬化剤を10:1比で激しく混合する。気泡を除去するには、真空チャンバー内の粘性混合物を室温で1時間脱気する。</li>
	<li>スケールで、アルミニウムモールドの上にゆっくりとPDMSを注ぎます。中央から注ぎ、金型を平準化してください。ピンを隠したままにしてください。目標重量が達成されたら、注ぎ込み停止します。 当社の金型は、PDMSの4 gと硬化試薬の0.4 gを必要とします。
</li>
	<li>オーブン内の金型を平準化し、一晩で37°Cで硬化します。 代替硬化時間は、60°Cで2時間、または90°Cで1時間である。
</li>
	<li>金型の端に沿って硬化したPDMS層を解剖し、一対の鉗子で鋳型表面から慎重に剥がします。70%エタノールとQチップで金型表面を洗浄します。</li>
</ol>2. 図2に従ってフローセルを組み立てる
ガラススライド付きPDMSの標準アセンブリは、PDMSと顕微鏡ガラススライド間のリークフリー結合を保証する両方の表面の酸素プラズマ処理によって行われます。提示されたプロトコルでは、プラズマ処理はガラススライド上の化学コーティングを破壊するであろう。そのため、スライドはプラズマ処理ではなく圧力密閉されています。
<ol><li>フローセルポケットにガラス窓を置きます。</li>
	<li>コーティングされたガラススライドをフローセルのポケットの内側にスライドさせ、その上にチャネルを下に向けて配置します。PDMS スライドを、チャンネル入力が金属板のスルーホールに合うように配置します。層の間から空気をそっと押し出します。</li>
	<li>PDMS がガラス窓に向かるように PDMS/ガラス スライド アセンブリを反転します。PDMS チャンネル入力を金属板のスルーホールと重ね合たします。</li>
	<li>圧力プレートを上に置き、ネジを締めます。</li>
	<li>組み立てたフローセルを顕微鏡の下に置きます。顕微鏡の倍率を60倍に設定し、チャンネル位置を事前に調整します。</li>
</ol>3. ログフェーズ細菌の準備
<ol><li>実験の前日:細菌コロニーを有する2%NaCl(MH2)を含むミューラーヒントンスープの50mlを接種する。37°Cで一晩250rpmで振る。 1つまたは2つの細菌株は、記載されたセットアップのための1つの実験で研究することができる。
</li>
	<li>実験前: MH2培地の50 mlに一晩細菌培養50 μlを混合します。細菌が対数相であることを確認するために、37°Cで3時間250 rpmで振ります。</li>
</ol>4. 実験液コンポーネントが必要になる前に少なくとも10分温める
<ol><li>蛍光色素(5mMストック)とリソスタフィン(10μg/mlストック)を室温で解凍します。</li>
	<li>オキサシリン粉末を室温まで温めます。</li>
</ol>5. 細菌懸濁液の準備とロード
<ol><li>3時間のサブカルチャーの終了後:10mlの細菌培養と遠心分離機を1,650 x gで2分間服用します。</li>
	<li>上清を取り除き、新鮮なMH2培地の1mlで細菌を再懸濁します。</li>
	<li>1 ml ルアー ロック シリンジに短い長さのチューブを取り付けます。1 ml のメディアでシリンジチューブを洗い流します。細菌の懸濁液に引き込むときに気泡を避けるために、チューブに少しメディアを残します。</li>
	<li>0.7mlの細菌タイプ1を注射器に浸します。フローセルの2つのチャネルを細菌タイプ1で満たします。 caの後にチャネルの反対側に液体が表示されるのを見てください。150 μl。 チャネルの透明度は、細菌で満たされると変化します。
</li>
	<li>複数の細菌タイプを実験する場合は、細菌タイプ2の負荷手順をフローセルの残りの2つのチャネルに繰り返します。</li>
	<li>37 °Cで37°Cのフローセルを45分間置き、スライド表面に細菌の沈降と付着を可能にします。</li>
</ol>6. 実験ソリューションの準備と読み込み
<ol><li>14 μlの蛍光色素ストック(5 mM)と126 μlのMH2メディアを混合して、0.5 mM蛍光色素溶液を140 μl用意します。</li>
	<li>40mlのMH2培地で10mgのオキサシリンを希釈し、250μg/mlオキサシリンの最終濃度を得る。</li>
	<li>0.25 μM蛍光色素と0.7 ng/mlのリソスタフィンの最終濃度で130mlの制御溶液を調製します。これを行うには、65 μlの蛍光色素(0.5 mM)、9.12 μlのリソスタフィンストック(10 μg/ml)、130 mlのMH2培地を混合します。</li>
	<li>0.25 μM蛍光色素、0.7 ng/mlのリソスタフィン、50 μg/ml オキサシリンの最終濃度で130 mlの抗生物質溶液を調製します。これを行うには、65 μlの蛍光色素(0.5 mM)、9.12 μlのリソスタフィンストック(10 μg/ml)、オキサシリン26ml(250μg/ml)、MH2培地104mlを混合します。</li>
	<li>2つの60 mlシリンジをコントロール溶液で満たし、60ml注射器2個を抗生物質溶液で充填します。試薬の光による劣化を避けるために、溶液をアルミホイルで包み込みます。 チューブのフラッシュによる損失を考慮して、注射器をオーバーフィルします。
</li>
	<li>フリックして、シリンジから気泡を取り除く。入力チューブをテストソリューションでチップに取り付けて埋めます。</li>
	<li>ポンプにスポイトを取り付ける。最初に最小ボリュームのシリンジを置き、プランジャーの位置をロックします。残りのシリンジをポンプに取り付け、必要に応じてプランジャーを絞ります。</li>
	<li>ポンプ速度を1 ml/minに、ポンプの体積を60 mlに設定します。すべての注射器から液体の安定した流れが見えるまで、ポンプでフラッシュを行います。</li>
</ol>7. 顕微鏡下にフローセルを設置する
<ol><li>遠心分離機からフローセルを取り出し、顕微鏡のステージに取り付ける(図3)。</li>
	<li>各フローセルチャンネル(チャンネルごとに1つの入力/1出力)に入出力チューブを接続します。 出力を 4 つの異なるコンテナーに集めることで、個々のチャンネル出力ボリュームを測定できます。</li>
</ol>8. 60分の実験を実行する
<ol><li>ステップ 2.5 から事前に配置された位置を確認します。顕微鏡の視野がチャネルの中心になっていない場合や、焦点が合っていない場合は、設定を調整して新しい位置を保存します。 負荷の多い細菌の密度が高いため、流動開始前に正確な焦点合わせができない場合があります。
</li>
	<li>位相コントラスト取得時間を10ミリ秒、蛍光集録時間を1,600ミリ秒に設定します。</li>
	<li>フローを開始する前に、各位置の位相コントラストと蛍光画像を取得します。 これは、ロードされた細菌密度の定性的な推定値を与えます。
</li>
	<li>液体の流れを開始し、顕微鏡がチャネルの底部に焦点を合わせているか確認してください。</li>
	<li>フローの最初の1分以内にターゲット領域の位相コントラストと蛍光画像を撮ります。</li>
	<li>フローの60分まで画像の最初のセットの後に2分ごとに画像を取得します。必要に応じて再フォーカスします。</li>
</ol>9. フローセルの消毒
<ol><li>ビーカー(100ml)で10%漂白液を作ります。4 x 20 ml の注射器を 10 ml の混合物で充填します。シリンジをデバブルし、フローセルに取り付けます。 チャネルが細菌を取り除くのに約1〜2分かかります。
</li>
	<li>ポンプ速度を1 ml/minに、ポンプの体積を3 mlに設定します。3分間走ります。</li>
	<li>4 x 60 ml のシリンジに 60 ml の DI 水を入れます。シリンジをデバブルし、フローセルに取り付けます。</li>
	<li>ポンプ速度を1 ml/minに、ポンプの体積を30 mlに設定します。30分間走ります。</li>
	<li>マイクロスコープ下でのチャネルクリーニングを監視します。</li>
	<li>フローセルを分解します。使用したエポキシスライドを破棄します。フローセル成分をDI水に20分間浸漬し、エアドライにします。</li>
</ol>10. 画像の分析とデータの生成
<ol><li>各画像の細菌数を数えます。 オープンアクセスソフトウェアは、CellProfilerは、バッチ画像処理16を実行するために使用されます。CellProfiler ルーチンの概要を表 1 にまとめて います。位相コントラスト画像(Np)に存在する細菌の数は、総細菌数を示す。蛍光画像(Nf)に見える細菌の数は、死んだ細菌の数を示します。
</li>
	<li>正規化された細菌細胞死率を時間の関数として計算する。<ol>
<li>個々の画像の Nf および Np をデータ分析ソフトウェアにインポートします。</li>
		<li>t = Tの分数(Nf/N p)で与えられた特定の時点で、各チャネルの死んだ細菌の割合を計算する。</li>
		<li>実験の最初に存在する死んだ細菌の割合(t = 1分)を、制御と実験チャネルの両方に差し引く。</li>
		<li>制御チャネルに存在する死んだ細菌の割合を、次の式で各時点の実験チャネルに存在する細菌から差し引きます。 <img alt="Data Analysis Equation" fo:content-width="6in" height="217" src="/files/ftp_upload/50828/Data_analysis_equation.png" width="620">
</li>
		 <li>実験の過程で DPノルム 対 t をグラフ化します。 細胞死率が1%を超えるサンプルは感受性が高いと見なされ、0.5%未満の死亡は抵抗性を示す。これら 2 つのカットオフの間に含まれる割合は不確定と見なされ、サンプルを再度テストする必要があります。
</li>
		<li>スプレッドシートを使用して、さまざまな実験の結果を要約および分析します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mairhofer, J., Roppert, K., Ertl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+systems+for+pathogen+sensing%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Microfluidic systems for pathogen sensing: a review.</a> Sensors. 9, 4804-4823 (2009).</li>
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</ol>

マイクロ流体法は特許出願中です:ザウアー・バッジA、シャロンA、カラシニコフM、ウィルツH、発明者;細菌抗生物質耐性/感受性特許PCT/US10/33523の迅速な検出のための方法および装置。

提示されたプロトコルは、メチシリン感受性およびメチシリン耐性 黄色ブドウ球 菌株10を用いた一連の実験において検証され、最適化された。したがって、このプロトコルは、細菌細胞壁生合成に影響を与える作用のメカニズムを有する S.アウレウス および他の抗生物質の他の株に直接適用されるべきである。 S.アウレウス以外の細菌タイプは、可溶性(酵素)および機械的応力のストレスパラメータの変動を必要とする場合があります。もし、ブドウ 球菌 以外の細菌種の試験で可溶性ストレッサーが望まれる場合、リソスタフィンはブドウ球菌特異的酵素であるため、別のストレス剤が必要となる。
せん断応力の量は液体の流量に比例し、チャネルのサイズに反比例するため、原理的には大きな値の範囲内で変化させることができる。応力の達成値は、次の実験要因によって制限されます:固定化基材がより高い流量下で細菌を保持する能力、漏れることなく高圧を維持するマイクロ流体アセンブリ、システム内の液体流動抵抗、流量を不安定にしたり、流...

細菌耐性の上昇は、最後の手段の私たちの薬を保護するために、速い表現型ベースの抗生物質感受性テストの必要性を強化します。標準的な感受性テストは、完了するまでに複数の(8-24)時間を要する抗生物質の存在下での細菌増殖阻害に基づいている。我々は、抗生物質の作用を加速するために生合成経路のストレス活性化に依存する微小流体プラットフォーム上で新しい抗生物質感受性試験を開発した。
マイクロ流体スケールでの抗生物質感受性試験は、少数の細菌を必要とするため、効果的なサンプル使用の利点を運びます。さらに、マイクロ流体デバイスは、複数の条件1,2の下で複数のサンプルをテストするために多重化することができます。最近、抗生物質感受性検査のための微小流体法の数が報告されている3-9.これらの方法では、細菌はナノおよびピコリットル液滴3,7の内部で増殖し、マイクロ流体チャネル4〜6、8の全容で、またはチャネル9の底面に電気的に局在する単一細菌として増殖する。これらの検査はマイクロ流体チャネルで行われますが、それらはすべて従来の方法と同様の抗生物質の存在と不在で微生物の成長を監視します。成長の測定は光学密度、pH敏感な色素、または明るい視野/位相のコントラストまたは蛍光のイメージ を介して 取られる。これらの検査のいくつかは従来の方法よりも速いが、それらはそれぞれ受動的に抗生物質耐性を検出する。言い換えれば、これらの方法は、最終的な読み出しとして細菌の増殖を待つ必要があります。
対照的に、我々は、抗生物質感受性生化学的経路10を活性化するためにせん断と酵素ストレスの組み合わせを使用する方法を開発した。これらの抗生物質でストレスを受けた細菌に挑戦することは、より迅速な感受性テストを作成します。抗生物質に耐性のある細菌は、ストレスの多い状態に耐えることができます。一方、影響を受けやすい細菌は、複合ストレスによって急速に殺される。1時間後の細胞死の割合は、蛍光死細胞染色を用いた顕微鏡で測定し、細菌の表現型(耐性対感受性)を定義する。
我々の方法の成功の実現のためには、細菌はマイクロ流体チャネルの底面に固定化されなければならない。このようにして、細菌は様々なストレスを受け、同時に単一の平面で顕微鏡下で画像化することができる。コーティングされた顕微鏡のガラススライドは細菌の固定化のために使用される。スライドは非特異性タンパク質結合のためのエポキシド基を製造業者によって前塗りされる。これらのエポキシドの細菌表面タンパク質への非特異的結合は、共有結合してバクテリアをスライド表面に結合させる。
株は、抗生物質の不在(対照)および存在(実験)において同一の条件(せん断+酵素ストレス)下で試験される。各チャネルの位相コントラストおよび蛍光顕微鏡写真は、1時間毎に2分ごとに自動的に撮影される。次に、実験チャネル内の死んだ細菌の割合を制御チャネルに存在するものと比較することによって、抵抗の指定が行われます。1時間後、細胞死率が1%を超えるサンプルは感受性とみなされ、0.5%未満の死亡は抵抗性を示す。これら 2 つのカットオフの間に含まれる割合は不確定と見なされ、サンプルを再度テストする必要があります。
マイクロ流体チャネルはPDMSで定義されており、これはマイクロ流体デバイス11に適した材料である。PDMSは広範囲の波長で光学的に透明であり、生体適合性、不活性、ガスに対する透過性、および液体への透過性が低い。したがって、これらの実験に適しています。
機械的/せん断応力は、固定化された細菌の上に室温メディアの流れによって作成されます。(注:メディアを37°Cに温めるのは、アッセイの結果に大きな影響を与えならない。自動シリンジポンプは、マイクロ流体チャネル(200 μm x 400 μm)を通してマイクロ流体チャネル(200 μm x 400 μm)を介して培地(死細胞染色+/- 抗生物質を含む)を強制的に、6.25kPaのせん断力または剪断速度6,000秒-1を与える。この速度は、以前に研究した ブドウ球菌のせん断応力と等しいかそれを超えています。
この酵素は、リソスタフィンが、 ブドウ球菌 細胞壁に直接損傷を与えるため、予備実験のために選択された。リソスタフィン(0.7 ng/ml)の濃度は、細菌細胞壁損傷を引き起こすのに十分であったが、実験の時間枠で抗生物質なしで細菌細胞死を引き起こすには十分ではなかった。リソスタフィンは、細菌感受性の正しい指定のために必要とされないが、それは結果を増強し、感受性株における細胞死の増加につながる。対照的に、せん断応力はアッセイ機能にとって重要です。メチシリン感受性 黄色ブドウ球菌 株が流れがない場合にリソスタフィンとオキサシリンで治療すると、実験の過程で細胞死は記録されません。
細胞生存率は、蛍光死細胞染色12で監視される。色素の選択は、損傷した細胞のみを選択的に染色する能力、生きた細胞に対する非毒性、およびバックグラウンドの低い蛍光に基づいており、追加のステップなしで細胞培地に直接添加することができた。0.25μMの蛍光色素濃度の選択は、蛍光励起光への1.6秒の曝露時間中に許容可能なシグナルレベルを達成することであった。
β-ラクタム, オキサシリン, 私たちの予備研究で使用されました。.メチシリン耐性 S.アウレウス (MRSA)種はオキサシリンに耐性があり、実験の時間枠でかなりの細胞死を示さない。50μg/mlの濃度は予備研究で決定した。抗生物質の濃度が低いほど耐性株と感受性株の分離が少なかったが、高濃度は実験的結果に大きな違いを生じなかった。
我々は以前、細菌細胞壁13 に直接影響を及ぼす機械的および酵素的ストレスと、細胞壁生合成を阻害する抗生物質を組み合わせた試験の成功した開発について報告した。これらの原理実証実験は、MRSAおよびメチシリン感受性 S.アウレウス (MSSA)のパネルで行われた。しかし、適切な実験パラメータの選択により、我々の方法は、細菌の複数の種と抗生物質の複数のクラスに適用可能であるべきです。

<table><tbody><tr><td>SYTOX Green</td><td>Invitrogen Corporation</td><td>S7020</td><td>死細胞蛍光染色</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Sigma Aldrich, Inc</td><td>A9418-5G</td><td>リソスタフィンの保存に使用</td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich, Inc</td><td>S8750-500G</td><td>リソスタフィンの保存に使用</td></tr><tr><td>リソスタフィン&nbsp;</td><td>Cell Sciences</td><td>CRL309A</td><td>1 mgの固体としてお届けします。保存用:20 mM酢酸ナトリウムに溶解します。BSA溶液と混合して、最終濃度を1%BSAおよび100μにします。g/ml &nbsp;リソスタフィンの貯蔵用&nbsp;</td></tr><tr><td>オキサシリン塩</td><td>Sigma Aldrich, Inc</td><td>28221-1G</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>ミューラー ヒントン ブロス</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>DF0757-17-6</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>シグマ アルドリクッシュ</td><td>S3014-500G</td><td>オートクレーブ前にミューラー・ヒルトン・ブロスに 2%</td></tr> 添加 <tr><td>1 ml、ルアーロック・シリンジ&nbsp;</td><td>BD(ベックトン、ディキンソン、コンプ)</td><td>14-823-2F</td><td></td></tr><tr><td>2オンス、ルアーロックシリンジ</td><td>BD(ベックトン、ディキンソン、コンプ)</td><td>309653 - 60 mL</td><td>オーバーフィル ~65 ml</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒立蛍光顕微鏡 オリンパス IX-70</td><td>ケンブリッジ・サイエンティフィック</td><td>9349</td><td></td></tr><tr><td>60X, 蛍光/位相差対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td>LCPlan F1 60x/0.70 Ph2</td><td></td></tr><tr><td>Retiga 12ビットモノクロCCDカメラ</td><td>QImaging</td><td>RET-4000R-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡自動化</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>シャッター 位相差/蛍光</td><td>PRIOR Scientific</td><td>H204/H202</td><td></td></tr><tr><td>X/Y Stage&nbsp;</td><td>PRIOR Scientific</td><td>H107AENN</td><td></td></tr><tr><td>フォーカスモーター</td><td>PRIOR Scientific</td><td>H122</td><td></td></tr><tr><td>XYZ制御用ジョイスティック</td><td>PRIOR Scientific</td><td>CS152EF</td><td></td></tr><tr><td>Proscanコントローラー</td><td>PRIOR Scientific</td><td>H3-XY2</td><td></td></tr><tr><td>画像取得ソフトウェア</td><td>フラウンホーファーCMI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フローセルアセンブリおよびPDMS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>フローセル</td><td>BU科学機器施設/フラウンホーファーCMI</td><td>3333-1044</td><td>設計図面はフラウンホーファーCMI</td></tr><tr><td>で作成されました ガラス窓</td><td>フラウンホーファーCMI</td><td>3333-1054</td><td>ガラス窓はフラウンホーファーで適切なサイズにカットされました</td></tr><tr><td>ボロフロート窓 50 mm x 50 mm</td><td>Edmund Optics Inc.</td><td>NT48-543</td><td></td></tr><tr><td>シーリングプレート</td><td>BU 科学機器 施設</td><td>3333-1045</td><td></td></tr><tr><td>エポキシガラススライド</td><td>Arrayit Corporation</td><td>SuperEpoxy 2</td><td></td></tr><tr><td>PDMS マスター</td><td>フラウンホーファー CMI</td><td>3333-1053</td><td>マスター アルミニウムまたは真鍮で加工 UPM-0005 (ウルトラプレシシオンフライカッティングマシン)</td></tr><tr><td>PDMS スライドデザイン</td><td>フラウンホーファー CMI</td><td>3333-1053</td><td></td></tr><tr><td>チューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ナット、スーパーフランジレスTinytight、ヘッドレス、1/16インチ、PEEK、緑&nbsp;</td><td>IDEX健康科学</td><td>M-644-03</td><td>フローセルの入力/出力は、このフェルール</td></tr><tr><td>フェルール、Tinytight、1/16インチ、6-40、.030インチTH、PEEK w / SSロックリング、黒</td><td>色IDEX健康科学</td><td>M-657</td><td></td></tr><tr><td>ナット、スーパーフランジレスTinytight、ヘッドレス、1 / 16-1 / 32インチ、1 / 4-28、PEEK、天然</td><td>IDEX健康科学</td><td>P-255フェ</td><td></td></tr><tr><td>ルール、スーパーFalngeless、1/16インチ、テフゼル(ETFE)、黄色</td><td>IDEX健康科学</td><td>P-259</td><td>は、ルアーロックアダプター</td></tr><tr><td>チューブ、テフロンFEP、.030インチx 1/16インチx 20フィート、緑&nbsp;</td><td>IDEXヘルスサイエンス</td><td>1520G</td><td></td></tr><tr><td>アダプター、メスルアーをメス1 / 4-28、PEEK、赤&nbspにクイック接続します。</td><td>IDEXヘルスサイエンス</td><td>P-658</td><td></td></tr></tbody></table>

チップ上でのストレス誘発抗生物質感受性試験

Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

ストレスベースの環境下での抗生物質感受性試験のための迅速な微小流体法を開発しました。液体はマイクロ流体チャネルの底に固定化された細菌の上に高速で渡される。ストレスと抗生物質の存在下では、細菌の影響を受けやすい株は急速に死ぬ。しかし、耐性菌は、これらのストレスの多い条件を生き残ります。この方法の背後にある仮説は新しいです:抗生物質の標的である生化学的経路のストレス活性化は、抗生物質感受性検査を加速することができます。標準的な抗生物質感受性試験方法と比較して、抗生物質の適用中に、速度制限ステップ(細菌増殖)は省略される。この方法の技術的実装は、標準的な手法と革新的なアプローチの組み合わせです。この方法の標準的な部分には、細菌培養プロトコル、ポリジメチルシロキサン(PDMS)におけるマイクロ流体チャネルの定義、蛍光による細胞生存率モニタリング、細菌カウント用のバッチ画像処理が含まれる。この方法の革新的な部分は、機械的ストレスアプリケーションのための培養培地フローの使用、細菌を損傷するが殺さない酵素の使用、細菌の付着のためのマイクロアレイ基質の使用にある。開発されたプラットフォームは、抗生物質および非抗生物質関連の医薬品開発および試験に使用することができます。標準的な細菌懸濁液実験と比較して、薬物の効果は、制御された期間にわたって繰り返しオンとオフを切り上げることができる。同じ実験の過程で同じ細菌集団の反復観察が可能である。

図4に示すデータは、抗生物質含有微小流体チャネルにおける経時の影響を受けやすい黄色ブドウ球菌株の応答を示す。1分および1時間実験の最後に取得した位相コントラスト画像を図4AおよびBに示す。分析された1時間のデータは、赤色で強調表示された細菌(合計5,828)で図4Cに示されています。対応する蛍光画像を図4DおよびEに示す。分析した1時間のデータを図4Fに示し、蛍光細菌を赤色で強調表示した(死者174個)。
この一連のイメージは、いくつかの点を示しています。最も重要なことは、蛍光細菌の数の有意な増加が実験の終わりまでに観察される( 図4D と Eで1分と60分の明るい蛍光スポットの数を比較する)、チャネル内の細胞死を示す。これらの結果は、影響を受け...

我々は、迅速な抗生物質感受性試験のためのマイクロ流体プラットフォームを開発した。液体はマイクロ流体チャネルの底に固定化された細菌の上に高速で渡される。ストレスと抗生物質の存在下では、細菌の影響を受けやすい株は急速に死ぬ。しかし、耐性菌は、これらのストレスの多い条件を生き残ることができます。

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

次の実験の全体的な目標は、目的の抗生物質に対する細菌の感受性を迅速に決定することです。これは、まず対数期の細菌をマイクロ流体チャネルの底に固定化することによって達成されます。第 2 ステップでは、抗生物質と生きた死んだ蛍光染色物を含む培地を高流速でチャネルに押し込み、細菌にストレスを与え、抗生物質を標的とする生化学的経路を活性化します。次に、細菌の生存率を監視するために、2分ごとに1時間にわたって位相差および蛍光画像が自動的に収集され、実験の各時点で取得された画像から正規化された細菌死率が計算されます。最終的に、細菌の抗生物質感受性の表現型は、正規化された細胞死率の経時的な増加から決定されます。この手法は、ブロス、希釈、マイクロカルチャーなどの既存の表現型感受性試験法と比較した場合の主な利点は、この方法が細菌分裂のモニタリングを必要としないことです。むしろ、既存の小さな集団から直接、彼らの感受性プロファイルにアクセスすることができます。この技術の意味は、方法が迅速であるため、耐性細菌感染症の診断に向けて広がり、簡単に多重化および自動化することができます PDMS層を作成するには、1時間後に室温で真空チャンバー内で新たに調製したPDMS粘性混合物を脱気することから始め、スケールを使用して、DGAs PDMS混合物の事前定義された質量をアルミニウム金型に充填します。PDMSを金型の中央にゆっくりと注ぎ、金型を水平にし、ピンが露出しないように注意します。PDMSを摂氏37度のオーブンで一晩硬化させます。翌朝、トップモールドプレートをリリースし、硬化したPDMSをモールドから慎重に取り外して、フローセルを組み立てます。まず、ガラス窓をフローセルのポケットに入れます。次に、アクティブ面を上にして、フローセルのポケット内のガラス窓の上にコーティングされたスライドガラスを置きます。新しく作成された PDMS レイヤーで、チャネルが下を向いており、チャネル入力が金属プレートのスルー ホールと揃っています。層の間から空気をそっと押し出し、PDMSがガラス窓に面するようにPDMSスライドアセンブリを裏返します。PDMSチャネル入力を金属プレートの貫通穴と重ねてから、プレッシャープレートを上に置き、ネジを締めます。次に、組み立てたフローセルを顕微鏡の下に置き、顕微鏡倍率を60倍に設定し、チャネル位置を事前に位置合わせして、フローセルにロードするための対数相細菌を準備します。継代培養後、250 RPMおよび37°Cで振とうしながら3時間インキュベートし、10ミリリットルの培養物を1,650倍Gおよび室温で2分間遠心分離する。次に、上清を取り除き、ペレットを1ミリリットルの新鮮なMH 2培地に再懸濁します。次に、1ミリリットルのシリンジに短い長さのチューブを取り付け、チューブを1ミリリットルの培地で洗い流し、細菌懸濁液を引き込むときに気泡を避けるためにチューブに少量の培地を残します。次に、0.7ミリリットルの細菌をシリンジに装填し、フローセルの2つのチャネルを細菌細胞培養液で満たします。チャネルの透明度は、バクテリアで満たされると変化します。次に、フローセルを摂氏37度で45分間インキュベートし、細菌がスライド表面に付着するのを待ちます。実験のための溶液を準備するため。まず、2つの60ミリリットル注射器に新しく調製した制御溶液を充填し、2つの60ミリリットル注射器に新たに調製した抗生物質溶液を満たします。シリンジをフリックして気泡を取り除き、インプットチューブを取り付けて、それぞれの溶液をチューブの端に押し込みます。溶液はアルミホイルで包んでおき、試薬の光による劣化を防ぎます。次に、実験溶液を入れたシリンジを一度に1つずつポンプに取り付けます。必要に応じてプランジャーを絞って、ポンプに取り付けます。シリンジ保持クロスバーでシリンジを所定の位置にロックします。ポンプ速度を1分あたり1ミリリットル、ポンプ容量を60ミリリットルに設定し、すべてのシリンジから安定した液体の流れが見えるまでポンプを洗い流します。次に、インキュベーターからフローセルを取り出し、事前に不整列した顕微鏡ステージに取り付けて実験を開始します。次に、シリンジから来る1つの入力チューブと、廃液ボトルに送られる1つの出力チューブを各フローセルチャネルに接続します。この時点で、実験は完全にセットアップされ、開始する準備が整いました。位相差取得時間を 10 ミリ秒、蛍光取得時間を 1600 ミリ秒に設定し、各位置の位相コントラストと蛍光画像を取得してから、フローを開始します。フロー画像の開始前に、チャネル内の負荷されたバクテリアの密度が高いため、チャネルの下部に焦点を合わせることができない場合があることに注意してください。次に、液体の流れを開始します。顕微鏡がチャネルの底部に焦点が合っていることをすぐに確認してください。次に、フローの最初の1分以内にターゲット領域の位相コントラストと蛍光画像を撮影します。最初の画像セットから 2 分ごとに画像を取得し、60 分のフローが発生します。必要に応じて焦点を合わせ直し、実験が適切に進行していることを確認するために、取得した位相差と蛍光データを調べることができます。このデータサンプルでは、感受性ひずみがチャネル1と2にロードされ、抵抗ひずみがチャネル3と4にロードされました。実験の最後に、漂白剤と水を順次塗布して洗浄サイクルを実行します。4つの20ミリリットルの注射器に10ミリリットルの10%漂白剤溶液を入れ、4つの60ミリリットルの注射器に水を入れます。脱泡後、漂白剤を充填したシリンジをフローセルに取り付け、ポンプ速度を1分あたり1ミリリットル、ポンプ容量を3ミリリットルに設定します。ポンプを3分間運転し、画面上のチャネルのクリーニングを監視します。3分後、漂白剤シリンジを水シリンジに交換し、1分あたり1ミリリットルで30分間運転します。最後に、画像処理ソフトウェアを使用して、各画像内の細菌の数をカウントします。正規化された細菌細胞死率は、NFが蛍光画像カウントでカウントされた死んだ細菌の数に等しい次の式を使用して、時間の関数として計算します。また、NPは、位相差画像から決定される細菌の総数と等しくなります。ここに示す画像は、マイクロ流体フローセル内のオキサシリンに対する感受性ブドウ球菌アリア株の時間依存的な応答を示しています。これらの象限は、実験開始から1分後と1時間後に取得された位相コントラスト画像と、ここに示す対応する蛍光画像を示しています。実験の終了までに蛍光細菌の数の大幅な増加が観察され、チャネル内の細胞死と、個々のエポキシコーティングスライドの確率的不均一性による抗生物質に対する菌株の感受性が示されています。この変動を説明するために、持続的な純粋なストレス下で実験全体を通して細菌細胞の損失があるかもしれません、死んだ細胞集団の各蛍光画像は、共に取得された位相コントラスト画像で正規化され、総細胞集団を同じ時点の1秒以内に与えます。これらの拡大は、カウントアルゴリズムが、密集した位相コントラスト画像よりも蛍光画像内の個々の細菌を正確にカウントするのに成功していることを示しています。死細胞染色は、個々の死んだ細菌に対して高い蛍光コントラストを与えます。蛍光菌の数が全体の5%を超えることはめったにないため、各細菌は背景に比べて非常に明るいです。そのため、蛍光菌を高い精度で容易に計数することができます。例えば、この実験では、5個の全828個の細菌が検出され、赤で強調表示された174個がここで死んでいると判断された。3つの異なる実験の正規化されたMSSAおよびMr.RSAのデータは、耐性株について予想されたとおりに示されており、正規化された細胞死は0.5%未満で低く、実験の過程で変化しません。しかし、感受性株は、細胞死が着実に増加し、実験終了時には1%を超える高い値を示します。感受性株の細胞死の開始は実験によってわずかに異なりますが、通常は10分から30分の間に起こります。抗生物質耐性病原体を扱うことは非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には常に敗血症技術などの予防策を講じる必要があることを忘れないでください。この技術は、研究者が細菌がストレスにどのように反応するかを探求する道を開き、新しい迅速診断の開発と新薬の発見に影響を与えます。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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出典: Zhang, M. ら、 単一細菌における重水素取り込みの刺激ラマン散乱イメージングによる迅速抗菌薬感受性試験。J. Vis. Exp.

誘導ラマン散乱顕微鏡を用いた細菌抗生物質感受性の検出

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チップ上でのストレス誘発抗生物質感受性試験

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