3.13: 出芽酵母の形質転換とクローニング

酵母またはSaccharomyces cerevisiaeは、遺伝学および細胞生物学の研究で使用される広く普及している単純な真核生物モデル生物であり、ヒトの細胞プロセスに関する洞察を得ることができます。このビデオでは、形質転換(酵母細胞による外来DNAの取り込み)について説明します。酵母プラスミド、形質転換のための酵母細胞の調製方法、段階的な形質転換手順、およびこの基本的な技術のいくつかのアプリケーションを紹介します。

酵母の形質転換について話す前に、まず形質転換に使用されるDNAの種類であるプラスミドについて説明しましょう。プラスミドは、細胞膜の細孔を容易に通過できるようにスーパーコイル化できる小さな環状の二本鎖DNAです。

プラスミドには、制限エンドヌクレアーゼ、別名「制限酵素」がDNAを切断できるマルチクローニングサイトまたはMCSが含まれています。同じ酵素で切断された目的のDNA断片は、MCSにライゲーションすることができます。 プラスミドには、複製を開始すべき細胞にシグナルを送る複製起点またはORIも含まれています。さらに、プラスミドには選択可能なマーカーがあり、これによりプラスミドを含む酵母細胞が特定の環境条件下で増殖します。プラスミドをうまく取り込まない酵母は、選択マーカーを含む培地では生き残れません。選択可能なマーカーは、薬剤耐性を可能にする遺伝子や、酵母株が他の方法では生成できないアミノ酸を合成することを可能にする酵素をコードする遺伝子をコードすることができます。

シャトルベクターは、複数の宿主種で複製できるプラスミドです。例えば、大腸菌由来のプラスミドは酵母で増殖することができます。 酵母プラスミドは、非統合型または統合型であり、プラスミドがゲノムDNAと結合するか、または独立したままであることを意味します。

酵母で使用されるプラスミドまたはベクターには、5つの異なる一般的なタイプがあります。酵母の形質転換に最も頻繁に使用される2つは、酵母エピソームプラスミドまたはYEpと酵母セントロメティックプラスミドまたはYCpです。これらのタイプのベクトルは両方とも、自律レプリケーションシーケンスまたはARSを含んでいます。ARSには複製の起点が含まれており、酵母での染色体外複製を可能にします。

酵母の形質転換に使用できるいくつかの異なる手順には、スフェロプラスト法、エレクトロポレーション、酢酸リチウムを介した形質転換などがあります。このビデオでは、酢酸リチウムの手順に焦点を当てます。

この形質転換法では、正に帯電したリチウムカチオンが細胞膜およびプラスミドDNA上の電荷を中和します 形質転換混合物に添加された一本鎖DNAは、酵母の細胞壁に結合し、酵母細胞による取り込みに利用可能なプラスミドDNAを残します。急激な温度上昇やヒートショックにさらされると、細胞内と細胞外の間に圧力差が生じ、プラスミドDNAが通過できる細孔が形成されます。 温度が下がると、酵母細胞壁が再形成され、形質転換が完了します。

まず、酵母を形質転換のために調製する方法の段階的な手順から始めましょう。酵母細胞は、まず寒天プレートからコロニーを選び、酵母抽出物ペプトンデキストロース培地(略してYPD)でコロニーを増幅することによって調製する必要があります。

コロニーをプレートから取り出してYPD培地に入れた後、培養物を30°Cで一晩インキュベートします。あなたがここに見るように、シェーカーまたはローラー装置で攪拌したC。酵母細胞を遠心分離によりペレット化し、スーパーナントを除去します。ペレット化された細胞は、所望の緩衝液または滅菌水で再懸濁されます。これらの有能な調製済み酵母細胞は、形質転換手順で使用されます。

酵母細胞を調製したら、まず形質転換混合物を調製することにより、形質転換を行うことができます。

この試薬混合物には、滅菌蒸留水を含める必要があります。50%ポリエチレングリコールまたはPEGの溶液、1M酢酸リチウム、一本鎖DNA、プラスミドDNA、およびコンピテント酵母細胞の10 mg / ml溶液。各溶液の正確な比率は、実験を開始する前に、酵母形質転換に関する研究室の標準プロトコルを参照して計算する必要があります。

次いで、混合物を30°Cでインキュベートする。振とうしながら30分間C。 溶液は、酵母細胞がバラバラにならないように、ボルテックスではなく混合する必要があります。

細胞は、42 ?Cウォーターバスを15分間浴した後、氷の上で2分間冷却します。その後、細胞は遠心分離によって回収されます。

細胞を二重蒸留水に再懸濁し、目的の形質転換体を選択する寒天プレートに播種します。その後、形質転換プレートを30 ?コロニーが形成されるまで2〜4日間C。

形質転換手順には、最適化されるまで、常にポジティブコントロールプレートとネガティブコントロールプレートを含める必要があります。ポジティブコントロールは、選択可能なマーカーを含まないYPDプレート上にプラスミドDNAを含む酵母細胞懸濁液である必要があります。これは、形質転換手順後に細胞が健康であることを示しています。ネガティブコントロールプレートは、抗生物質を含むプレートなど、適切な選択プレート上の酵母細胞懸濁液である必要があります。プレートにはコロニーがなく、汚染がないことを示しています。

酵母の形質転換には、無数の異なる用途があります。形質転換酵母の1つの用途は、酵母-2ハイブリッドシステムを使用して、目的のタンパク質、またはベイトタンパク質と相互作用するタンパク質を同定することです。 結合パートナー候補のライブラリー(preyタンパク質)由来のプラスミドが形質転換され、相互作用が起こると、β-ガラクトシダーゼなどのレポーター遺伝子を活性化する転写因子が放出されます。レポーター遺伝子は、X-galを含むプレート上で相互作用を持つコロニーを青色に変えますか?β-ガラドシダーゼの基質。

複数の欠失は、性的サイクリングを使用する技術を通じて酵母に改変できます。レポーターと削除された遺伝子座を含む一倍体細胞は、ランダムな品揃えまたは減数分裂組換えによって1つの細胞に結合されます。 選択可能なマーカーは、欠失をうまく取り込んだ酵母を選択するために使用されます。この場合、フローサイトメトリーを使用してGFPを発現する細胞を選択します。

酵母は、タンパク質間相互作用に対する突然変異の影響を見るために蛍光標識されたタンパク質で形質転換することができます。 このビデオ記事では、蛍光顕微鏡を使用して、エンドサイトーシスに不可欠なタンパク質間相互作用に対するさまざまな突然変異の影響を研究しました。

あなたはちょうど酵母の変換に関するJoVEのビデオを見ました。これで、プラスミドの基本的な側面、形質転換のための酵母細胞の調製方法、および形質転換手順の実行方法を理解できたはずです。いつものように、ご覧いただきありがとうございます!