出芽酵母の形質転換とクローニング

Yeast Transformation and Cloning
JoVE Science Education
Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans
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JoVE Science Education Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans
Yeast Transformation and Cloning

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08:30 min
April 30, 2023

Overview

出芽酵母は生物学の研究によく利用される単細胞真核生物です。遺伝子欠失や組み換えタンパクの誘導、細胞内組織を標識するための遺伝子操作である形質転換(細胞の外来DNA導入)という基礎テクニックが酵母実験で頻繁に用いられています。

このビデオでは、どのように、そしてなぜ酵母形質転換を使った実験が行われるかをトピックとしています。プラスミド導入のための酵母細胞の準備工程と共に酵母プラスミドの重要な特徴を紹介し、また酵母形質転換に必要な酢酸リチウム法をプロトコルに準じて見ていきます。最後にこの形質転換法の研究応用例を紹介しています。

Procedure

出芽酵母はヒトの細胞内プロセスを理解するために遺伝子学や生物学の研究に広く使われている真核生物のモデル生物です。 これから、酵母の形質転換すなわち外来DNAの取り込みについて見ていきます。酵母プラスミドについて、形質転換の誘導法、形質転換の工程、さらにその応用編について話していきます。

まずは形質転換に必要なDNA、プラスミドについて説明します。 プラスミドは超らせん構造、小さい環状の二本鎖DNAなので、細胞膜を簡単に通り抜けることができます。

プラスミドには、DNAを切断する制限酵素のマルチクローニングサイト、MCSがあります。 同じ制限酵素で切断された目的とするDNA断片はMCSに挿入できます。 また、プラスミドには複製開始を制御する複製起点、ORIが含まれています。 さらに、プラスミドは、特殊な条件下でのみ酵母増殖を可能にする選択マーカーを持っています。 選択マーカ含有培地では、プラスミドの組み込みに失敗した酵母は生きていけません。 その選択マーカーには、薬物耐性やアミノ酸合成酵素の遺伝情報が組み込まれています。

シャトルベクターは、複数の宿主間で複製可能なプラスミドです。例えば、大腸菌プラスミドは酵母内で増殖できます。 酵母プラスミドはゲノムDNAに組み込むこともそのまま存在することもできます。

酵母には5種類のプラスミドあるいはベクターがあります。 形質転換で最もよく使われるのは、酵母エピソームプラスミドとセントロメアプラスミドです。 どちらのベクターも自立複製配列、ARSを持っています。 ARSは複製起点を含み染色体外でも複製できます。

酵母の形質転換にはスフェロプラスト法、エレクトロポーション法、酢酸リチウム法があります。 このビデオでは、酢酸リチウム法にフォーカスしていきます。

リチウム陽イオンが細胞壁とプラスミドDNAの電荷を中和します。 その後形質転換混合物に加えられている一本鎖DNAが酵母の細胞壁に結合し、プラスミドDNAの取り込みを誘導します。 急劇な高温刺激、ヒートショックにより細胞内外の圧力差が生じ、プラスミドDNAの細胞壁透過性が上昇します。 その後温度が下がると、細胞壁が再構築され、形質転換が完了します。

さて形質転換の誘導方法を段階的に見ていきましょう。 まずは寒天培地からコロニーを埴菌し、酵母エキス、ペプトン、デキストロースを混合したYPD培地で増殖させます。

その後、培地を30℃で一晩、シェーカーかローテーターを使ってインキュベートします。 遠心分離により細胞をペレット状にし上清を除きます。 バッファーか滅菌水で細胞ペレットを再懸濁させ、これらの形質転換受容性酵母を形質転換に使用します。

酵母が準備できたら、形質転換混合物を使って形質転換していきます。

試薬混合液には滅菌蒸留水、50%ポリエチレングリコール、1M酢酸リチウム、10mg/mlの一本鎖DNA,プラスミドDNA、そして形質転換受容性の酵母が含まれています。 各溶液は、各々の研究室のプロトコルに従い正確に計り取ることが大切です。

混合液を30℃で30分インキュベートします。 酵母細胞が壊れないようボルテックスは避けてください。

次に42℃の水層で15分間ヒートショックを加えます。 その後2分間氷で冷まします。 そして遠心分離により細胞を収集します。

細胞を再蒸留水で再懸濁させ、目的の形質転換に適した寒天培地にまきます。 形質転換プレートを30℃で2日から4日コロニーが形成するまでインキュベートします。

形質転換工程では、常にポジティブ、ネガティブコントロールを使用します。 ポジティブコントロールは選択マーカーなしのYPD培地に酵母とプラスミドの懸濁液を播いたもので細胞が正常であることを確認します。 ネガティブコントロールは抗生物質を含む培地に酵母懸濁液を播いたもので、コロニーが存在せずコンタミがないことを確認します。

酵母形質転換を使って数多くの実験ができます。 その一つは、既知のベイト遺伝子を用いてタンパク質相互作用を調べる、酵母ツーハイブリットシステムです。 ライブラリーから検索された未知のプレイ遺伝子を導入したプラスミドで形質転換させると、相互作用で転写因子が遊離され、βガラクトシダーゼのようなレポーター遺伝子を活性化します。 それにより、βガラクトシダーゼの基質であるXgalを含んだプレート上のコロニーは青色を呈します。

また有性生殖時に、いくつかの遺伝子を欠損させる技術もあります。 自由組み合わせ、又は減数分裂性組み換えにより、レポーター遺伝子や欠陥遺伝子をもつ一倍体細胞を他の細胞と融合できます。 酵母の選択マーカーを利用することで欠損導入がスムーズに行えます。 フローサイトメトリー法を使って、GFP発現細胞を選択できます。

タンパク質相互作用における変異を観察するため、同時に蛍光標識することもできます。 エンドサイトーシスに必要なタンパク質相互作用の変異を蛍光顕微鏡で観察できます。

今回のJoVE酵母形質転換編では、プラスミドの基本、形質転換のための酵母誘導、形質転換の工程について学びました。ご覧いただきありがとうございました。

Transcript

Yeast or Saccharomyces cerevisiae, is a widespread simple eukaryotic model organism used in the study of genetics and cell biology that can give insights into human cellular processes. This video discusses transformation – the uptake of foreign DNA by the yeast cell. It will introduce yeast plasmids, how to prepare yeast cells for transformation, a step-by-step transformation procedure, and will provide some applications of this fundamental technique.

Before we talk about the transformation of yeast, let’s first discuss a type of DNA used in transformation: the plasmid. A plasmid is a small, circular, double-stranded DNA that can supercoil so it can easily pass through pores in a cell membrane.

Plasmids contain a multiple cloning site or MCS where restriction endonucleases, AKA “restriction enzymes”, can cut DNA. DNA fragments of interest cut with the same enzymes can then be ligated into the MCS. Plasmids also contain an origin of replication or ORI that signals to the cell where replication should begin. In addition, plasmids have a selectable marker, which allows the yeast cells that contain the plasmid to grow under specific environmental conditions. Yeast that don’t successfully incorporate the plasmid will not survive in media containing the selectable marker. The selectable markers can encode for genes that enable drug-resistance or genes that encode enzymes that enable a yeast strain to synthesize amino acids that they otherwise cannot produce.

Shuttle vectors are plasmids that can replicate in more than one host species. For instance, a plasmid from E. Coli can grow in yeast. Yeast Plasmids can be non-integrating or integrating, mean that the plasmid either combines with the genomic DNA or remains independent.

There are five different general types of plasmids or vectors that are used in yeast. The two that are used most often in the transformation of yeast are the yeast episomal plasmid or YEp and the yeast centrometic plasmid or YCp . Both of these types of vectors contain an autonomous replication sequence or ARS. The ARS contains the origin of replication and allows for extrachromosomal replication in yeast.

There are several different procedures that can be used to transform yeast which include the spheroplast method, electroporation, and lithium acetate-mediated transformation. For this video we will focus on the lithium acetate procedure.

In this transformation method positively-charged lithium cations neutralize charges on the cell membrane and plasmid DNA Single-stranded DNA – added to the transformation mixture – binds to the cell wall of the yeast and leaves the plasmid DNA available for uptake by the yeast cells . The exposure to a sudden increase in temperature, or heat shock creates a pressure difference between the inside and outside of the cell creating pores that plasmid DNA can pass through. When the temperature is decreased, the yeast cell wall will reform and transformation is complete.

Let’s begin with a step-by-step procedure of how to prepare yeast for transformation. Yeast cells must be prepared by first picking a colony from an agar plate and amplifying the colony in yeast extract peptone dextrose medium, abbreviated YPD – a complete medium for yeast growth.

After the colony is picked from a plate and placed into YPD medium, the culture is incubated overnight at 30 °C with agitation on a shaker or roller apparatus, like you see here. The yeast cells are pelleted by centrifugation and the supernant is removed. The pelleted cells are resuspend with the desired buffer or sterile water. These competent prepared yeast cells will be used in the transformation procedure.

Once yeast cells have been prepared, transformation can be carried out by first preparing the transformation mixture.

This reagent mixture should include: sterile distilled water; a solution of 50% polyethylene glycol or PEG, 1M lithium acetate, 10 mg/ml solution of single-stranded DNA, plasmid DNA and competent yeast cells. The exact proportions of each solution should be calculated before beginning the experiment by consulting your laboratory’s standard protocol for yeast transformation.

The mixture is then incubated at 30 °C for 30 minutes with shaking. The solution should be mixed, not vortexed, to ensure the yeast cells do not break apart.

The cells are heat-shocked by placement in a 42 °C water bath for 15 minutes followed by cooling on ice for 2 minutes. The cells are then harvested by centrifugation.

Cells are resuspended in double-distilled water and are plated on agar plates that will select for the desired transformants. Transformation plates are then incubated at 30 °C for two to four days until colonies form.

Transformation procedures should always include positive and negative control plates until they are optimized. The positive control should be a yeast cell suspension with plasmid DNA on a YPD plate that does not contain any selectable marker. This shows that the cells are healthy following the transformation procedure. The negative control plate should be a yeast cell suspension on an appropriate selection plate, such as one that contains antibiotics. The plate should have no colonies and shows that there is no contamination.

There are a myriad of different applications for yeast transformation. One application of transformed yeast is to use a yeast-two hybrid system to identify proteins that interact with your protein of interest, or the bait protein. When a plasmid from a library of candidate binding partners, or prey proteins, are transformed and there is an interaction, a transcription factor is released that will activate a reporter gene, such as Beta-galactosidase. The reporter gene will turn colonies that have an interaction blue when on plates that contain X-gal — a substrate for beta-galadosidase.

Multiple deletions can be engineered into yeast through a technique using sexual cycling. Haploid cells that contain a reporter and deleted locus are combined into one cell through random assortment or meiotic recombination. Selectable markers are used to select for yeast that have successfully incorporated the deletions. In this case, flow cytometry is used to select for cells that express GFP.

Yeast can be transformed with proteins that are fluorescently labeled to view the effect of mutations on protein-protein interactions. This video-article used fluorescent microscopy to study the effects of different mutations on protein-protein interactions essential for endocytosis.

You’ve just watched JoVEs video on yeast transformation. You should now understand the basic aspects of a plasmid, how to prepare yeast cells for transformation and how to perform the transformation procedure. As always, thanks for watching!