Name: 山中因子の過剰発現によって多能性の成体体細胞のin vivoでの再プログラミング中 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-17T09:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: 学ぶ 成体肝細胞のin vivo再プログラミング法。Yamanaka因子を用いた水力学的尾静脈注射で、多能性獲得と遺伝子発現変化を評価。安全かつ効率的な細胞可塑性研究に応用可能です。

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この研究は、Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC, Swindon, United Kingdom) と欧州委員会の FP-7 Programs NANONEUROHOP (PIEF-GA-2010-276051) と ANTICARB (HEALTH-2008-20157) によって部分的に支援されました。 AYは、教育省(トルコ)からのフルタイムの博士課程奨学金によって支援され、ILはブリティッシュ・カウンシルとCAIXA財団(スペイン)からの部分的な支援を認めています。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に関与していませんでした。

1. pDNAのHTV投与による肝臓組織のin vivoリプログラミング
<ol>
	<li>6週齢の雌のBalb/Cマウスを、処置が行われる前の1週間、動物施設に順応させます。</li>
	<li>蒸留水に0.9%生理食塩水を調製し、0.22μmマイクロフィルターでろ過します。</li>
	<li>マウスあたり1.5 mLの0.9%生理食塩水中に75 μgのpCX-OKS-2Aと75 μgのpCX-cMycプラスミドDNAを含む溶液を調製します。手記：総注入量は、総体重の8〜10%でなければなりません 
	注:注入前に、尾静脈が容易に視覚化され、拡張しているように見えるまで、マウスを37°Cの加熱チャンバーに保管してください。</li>
	<li>注射前(加熱チャンバー内)および注射中(麻酔マスクを使用)にイソフルランによる麻酔を誘発する。</li>
	<li>HTV注入により、27GシリンジでpDNA溶液または生理食塩水コントロールを投与します。注:トランスフェクションを成功させるには、総量を5〜7秒以内に注入する必要があります。</li>
	<li>動物が注射から適切に回復することを確認します。</li>
</ol>
2. qRT-PCR研究のための初代肝細胞の灌流と単離
<ol>
	<li>HTV注射の2、4、8、12、24日後などのさまざまな時点で、イソフルランによる深部麻酔を誘発します。</li>
	<li>動物の腹部に70%エタノールをスプレーし、手術用ハサミで腹側正中線の皮膚を切開し、腹部の筋肉層を解剖して内臓を露出させます。</li>
	<li>横隔膜をはさみで胸腔を露出させるように切断し、ロッキング鉗子でカバ静脈をクランプします。</li>
	<li>内臓を右にずらし、肝臓の葉を動かして、下カバと門脈の両方に簡単にアクセスできるようにします。</li>
	<li>22Gのカテーテルで下カバ静脈をカニューレし、過剰な圧力を避けるために門脈を切断します。</li>
	<li>37°Cで予熱した10 mLのHBSS緩衝液(Ca2+およびMg2+を含まない、重炭酸塩を含む)で灌流を開始し、肝臓が白くなるまで10 mLのシリンジで緩衝液をゆっくりと灌流します(3分間)。</li>
	<li>37°Cに予熱したLiver Digest Mediumを0.6 mL/minの流速(15分間)で、肝臓が腫れて緩むまで灌流を続けます。手記：過剰な消化と灌流は、肝細胞や再プログラムされた細胞に損傷を与える可能性があります。</li>
	<li>4°Cで実験を続けます。</li>
	<li>鎌状靭帯と冠状靭帯を切開した後、鉗子で肝臓を摘出し、肝細胞洗浄培地で洗浄し、100μmの細胞ストレーナーに通して細胞懸濁液を得ます。</li>
	<li>細胞懸濁液を50 mLのチューブに集め、Hepatocyte Wash Mediumで容量を15 mLに調整します。</li>
	<li>細胞懸濁液を50gで4分間遠心分離し、温度を4°Cに保ち、上清(Kupffer細胞と上皮細胞を含む)を廃棄し、細胞ペレット(肝細胞を含む)を10 mLの肝細胞洗浄培地に再懸濁します。手記： 細胞ペレットは非常に慎重に再懸濁されるべきであり、肝細胞は非常に壊れやすい細胞である。</li>
	<li>遠心分離手順を合計3回繰り返し、最終的なペレットを10 mLの肝細胞洗浄培地に再懸濁します。</li>
	<li>光学顕微鏡と血球計算盤を使用して細胞数を推定します。</li>
	<li>2 x 106細胞のアリコートを調製し、300 x gで遠心分離してすべての細胞を回収し、上清を廃棄します。</li>
	<li>この時点で、細胞ペレットを凍結して-20°Cに保ってさらに処理するか、すぐにRNA抽出に使用できます。</li>
</ol>
3. 多能性遺伝子のアップレギュレーションのための単離肝細胞の遺伝子発現研究
<ol>
	<li>サプライヤーの指示に従って、スピンカラムキットを使用して2 x 106細胞からRNAを抽出します。</li>
	<li>抽出した RNA 1 μg を使用して、供給業者の指示に従って 2 ステップの qRT-PCR を実施します。</li>
	<li>生理食塩水を注射した動物の肝細胞をコントロールとして使用して、リプログラミング、多能性、および肝細胞マーカーの相対的な遺伝子発現を修正します。</li>
</ol>
4. タンパク質レベルでの多能性亢進のフローサイトメトリー解析
<ol>
	<li>注射後1日目と4日目に、肝臓灌流を行い、上記のように初代肝細胞を単離します。</li>
	<li>細胞密度を1 x 107 cells/mlに調整し、100 μlのアリコートを調製します。</li>
	<li>BD Cytofix固定バッファーで細胞を固定し、1x BD Perm/Washバッファーで透過処理します。</li>
	<li>抗マウスOCT4-PerCP-Cy5.5または抗マウスNanog-PEのいずれかで細胞を30分間インキュベートします。</li>
	<li>ネガティブコントロールとアイソタイプコントロールを含めます。</li>
	<li>CyAn ADP High Performance Research Flow Cytometerで染色した細胞を解析します。</li>
</ol>
5. 多能性マーカーのための肝臓切片の免疫染色
<ol>
	<li>注射の4日後、上記のように肝臓を灌流しますが、肝臓組織から血液を取り除くためにHBSSバッファーのみを使用します。</li>
	<li>肝臓組織の一部を切断し、2-メチルブタン(液体窒素で予冷)に浸して、凍結切片を続行します。</li>
	<li>凍結組織は、-80°Cに保持するか、クライオスタットを使用して厚さ14 μmの切片に直接切断することができます。</li>
	<li>ティッシュ切片を室温で1時間風乾し、メタノールで後固定し、-20°Cで10分間予冷し、15分間風乾した後、切片をPBSで2回(各5分間)洗浄します。</li>
	<li>ブロッキングバッファー(5% ヤギ血清-0.1% Triton、PBS pH 7.3)で切片を室温で1時間インキュベートした後、洗浄バッファー(1% BSA-0.1% Triton in PBS, pH 7.3)で2回の洗浄ステップを行います。</li>
	<li>組織切片を抗OCT4、抗SOX2、および抗Nanog一次抗体を用いて4°Cで一晩インキュベートします。</li>
	<li>翌日、切片を洗浄バッファーで3回(各5分)洗浄し、二次抗体と室温で1.5時間インキュベー</li>トします。
	<li>肝臓切片をPBSで洗浄し(各5分、3回)、DAPIおよび退色防止剤を含む培地にマウントします。</li>
	<li>落射蛍光顕微鏡でスライドを視覚化します。</li>
</ol>
6. 肝臓組織切片のアルカリホスファターゼ(ALP)染色
<ol>
	<li>前述のように肝臓組織切片を取得します。</li>
	<li>染色を行う前に、組織切片を室温で15分間温めます。</li>
	<li>4%パラホルムアルデヒドで2分間固定します。注:固定時間が長すぎると、ALP活性が低下する可能性があります。</li>
	<li>切片を30分間風乾した後、BCIP/NBT液体基質と37°Cで30分間インキュベートします。</li>
	<li>スライドを蒸留水で洗浄し、水性封入剤を封入します。</li>
	<li>光学顕微鏡でランダムな画像をキャプチャします。</li>
</ol>
7. 肝臓毒性を評価するための血清中のアルブミンと肝酵素レベルの定量化
<ol>
	<li>トランスフェクション後4日目、8日目、12日目、120日目に、心室から直接300μlの血液を採取します。</li>
	<li>凝固を防ぐために、さまざまなサンプルを採取している間、血液を氷上に保ちます。</li>
	<li>すべてのサンプルの準備ができたら、血栓ができるまで37°Cで30分間インキュベー</li>トします。
	<li>サンプルを2,000 x gで5分間遠心分離します。</li>
	<li>血清(上清中)を新しいエッペンドルフチューブに慎重にピペットで移し、サンプルが処理されるまで-80°Cで凍結します。</li>
	<li>アルブミン、ALT、AST、ALP、およびGLDHの血清レベルを分析します。</li>
</ol>
8. 肝毒性を評価するための肝切片のヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)および過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色
<ol>
	<li>HTV注射の2日後、4日後、8日後、12日後、24日後、50日後、120日後など、異なる時点で、前述のようにのみHBSSバッファーによる肝灌流を行う。</li>
	<li>肝臓組織の一部を切り取り、4%パラホルムアルデヒドで固定します。</li>
	<li>肝臓組織をパラフィンブロックに埋め込み、H&EまたはPAS染色で切片化し、染色します。</li>
	<li>光学顕微鏡でランダムな画像をキャプチャします。</li>
</ol>

<ol><li>Blelloch, R., Venere, M., Yen, J., Ramalho-Santos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+In+The+Absence+Of+Drug+Selection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation Of Induced Pluripotent Stem Cells In The Absence Of Drug Selection.</a> Cell Stem Cell. 1, 245-247 (2007).</li>
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<li>Wolff, J. A., Budker, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mechanism+Of+Naked+Dna+Uptake+And+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Genet%22%5BJournal%5D)">The Mechanism Of Naked Dna Uptake And Expression.</a> Adv. Genet. 54, 3-20 (2005).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

この研究は、成体マウス肝臓へのOKSM因子の効率的な移動と過剰発現に続く多能性に向けた in vivo 細胞のリプログラミングの原理実証の証拠を提供します。qRT-PCR、フローサイトメトリー、IHC、血清分析などのさまざまな技術を使用して、標的組織を調査して、 in vivo 細胞の再プログラミングを観察しました。組織におけるOKSM因子の過剰発現の誘導から非常に急速に、多能性マーカーはmRNAおよびタンパク質レベルでアップレギュレートされました(48時間以内)。これらの実験を通じて、組織から抽出された細胞の5〜15%がNanogおよびOct3 / 4陽性であることが示されました。さらに、120日間を通じて肝臓に構造的または機能的異常は観察されませんでした。肝臓以外の組織(肺、脾臓、腎臓、心臓)におけるプラスミドDNAのHTV注入による導入遺伝子の発現は以前に報告されていますが、遺伝子発現レベルは肝細胞よりも少なくとも3桁低かった30。この研究のデータは、 in vivo での 多能性状態への体細胞の再プログラミングが安全、迅速、効率的であることを示しています。一般に、効率の1%未満で3週間以内に多能性(iPS)細胞生成を達成する既存の in vitro 細胞リプログラミング方法論の大部分を考慮して32、多能性への in vivo リプログラミングは非常に興味深い代替手段を提供する可能性があります。多能性への in vivo リプログラミングの概念は、高効率でさまざまなタイプの体細胞に適用できると仮定しています (使用されるベクターによって異なります)、 in vivo で再プログラムされた細胞で達成される機能的多能性のレベルを決定する必要があります。さらに、改良されたプロトコルと技術の開発により、 in vivo で再プログラムされた細胞を抽出し、再生医療の目的に利用できる可能性があります。
成体体細胞をin vivoで高効率で再プログラムするために、従うべきいくつかの重要なステップがあります。標的組織で高レベルの遺伝子発現を達成することが前提条件です。この研究では、HTV注射を使用してプラスミドDNAの肝細胞への効率的な導入と発現を利用することによって、これを説明しました。HTV注射の最も重要な要素は、動物の総体重の8〜10%であるべき量と、5〜7秒以内に実行しなければならない注射の速度です。HTV注射は肝臓の組織損傷を増やし、細胞のリプログラミングの効率に影響を与える可能性があるため、生後6週間未満のマウスは使用しないでください。Balb/CマウスとTNG-Aマウスの両方で同様のレベルのリプログラミングが以前に報告されているため、動物の遺伝的背景は、Nanog遺伝子座に挿入されたeGFPレポーターを運び、Sv129バックグラウンド29で繁殖するトランスジェニック株である。
OKSM因子が標的細胞に効率的に送達され、高レベルの遺伝子発現が可能であれば、多能性状態へのインビボ細胞リプログラミング(決定が必要)は、他の組織タイプにも適用できると推測しています。さまざまな細胞および組織型を標的とするために、さまざまな非ウイルスおよびウイルス遺伝子送達ベクターが前臨床試験および臨床試験で研究されています33。例えば、神経組織または眼組織では、アデノ随伴ウイルスが効率的なin vivo遺伝子導入のための好ましいベクターの選択であったのに対し、筋肉組織では裸のプラスミドDNA注射が比較的高レベルの遺伝子発現をもたらすことが示されている38,39。したがって、遺伝子導入ベクターの方法は、多能性状態への効率的かつ迅速なin vivo細胞リプログラミングを達成するために、組織の種類に応じて慎重に選択する必要があります。

胚性幹細胞の使用に関する倫理的な懸念は、幹細胞研究の発展における制限の一つでした。しかし、山中教授らが4つの転写因子(Oct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc(OKSM))を強制発現させることで、体細胞を多能性細胞(iPS細胞)と名付けたin vitroでのリプログラミングにつながる可能性があることを発見したことで、新たな可能性が開かれました。ウイルス1-5および非ウイルス6-10遺伝子導入、タンパク質細胞質転座11,12、およびmiRNA13-16トランスフェクションは、今日iPS細胞を作製するために使用されているさまざまな方法の一部です。しかし、そのようなリプログラミング方法論は、臨床への応用を制限しているさまざまな問題に悩まされています。b)ウイルスベクターの主な使用;c)培養条件の長期的かつ多段階のプロトコル。d)in vitroで生成されたiPS細胞17-20の移植による腫瘍形成性のリスク。
レトロウイルスによる特定の転写因子3-5の遺伝子導入は、体細胞を再プログラムするために最も一般的に使用される方法です。しかし、挿入突然変異誘発、安定形質導入、および長期のがん原遺伝子発現の可能性によるリスクを含んでいます21,22。プラスミドDNA6,7,23や、リポソームやエレクトロポレーションを用いたRNA10導入などの非ウイルス性遺伝子導入ベクターも研究されています。ウイルスと比較して安全である一方で、これらのベクターは形質導入とリプログラミングの効率が大幅に制限されています24,25。
この新興分野の中心的なドグマの一つは、iPS細胞の生体内移植が制御不能な分化を引き起こし、3つの異なる胚葉からのさまざまな組織からなる腫瘍様腫(奇形腫)の形成につながるというものです。したがって、多能性へのリプログラミングの概念は、主に初代抽出体細胞(最も一般的には線維芽細胞)のin vitro操作に焦点を当ててきました。しかしながら、上述したように、この原理は、細胞の移植時に奇形腫形成または他の形態の腫瘍形成のリスクをそれ自体が高め得る治療(遺伝子導入、成長因子、抗生物質、抗酸化剤)の複数回のラウンドを含む、長く複雑な細胞培養プロトコルに苦しんでいる24〜28。
私たちは、OKSM転写因子の一過性の過剰発現による生体内の成体細胞の再プログラミングがその後の奇形腫の形成につながらないことを提案します29。それを達成する方法は、可能な限り安全な方法で標的組織内で高レベルの転写因子発現を達成することにかかっています。本研究では、細胞をin vivoで多能性に再プログラムするために、肝臓を効率的に標的とすることが示されている、確立されたウイルスフリー遺伝子導入技術を選択しました。この技術には、プラスミドDNAの大量で迅速な流体力学尾静脈(HTV)注入が含まれます30,31。この非ウイルス性遺伝子導入法により、成体肝細胞においてトランスフェクション遺伝子の高発現レベルを達成することができます。さらに、この技術は、ウイルスベクターの使用による潜在的なリスクを最小限に抑えます(例:永久ゲノム挿入、挿入突然変異誘発)。

<table><tbody><tr><td>pCX-OKS-2A pDNA</td><td>Addgene</td><td>19771</td><td>Addgeneから細菌刺し傷として入手、プラスミド工場(ドイツ)でプラスミド生産を行う</td></tr><tr><td>pCX-cMyc</td><td>Addgene</td><td>19772</td><td>Addgeneから細菌刺し傷として入手し、プラスミド工場(ドイツ)でプラスミド生産を行う</td></tr><tr><td>0.22 &mu;mフィルター</td><td>ミリオポア</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>アボット</td><td>B505</td><td></td></tr><tr><td>HBSS バッファー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648</td><td>Ca2+ および Mg2+ フリー、重炭酸</td></tr><tr><td>塩 肝臓消化媒体</td><td>Gibco</td><td>17703-034</td><td></td></tr><tr><td>肝細胞洗浄媒体</td><td>Gibco</td><td>17704-024</td><td></td></tr><tr><td>100 &ミュー;m cell strainer</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin RNA II kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740955.25</td><td>Kit for RNA isolation from cells and tissues</td></tr><tr><td>iScript cDNA synthesis kit</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8890</td><td></td></tr><tr><td>iO SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8880</td><td></td></tr><tr><td>Oct3/4 フォワードプライマー</td><td>Sigma</td><td>sequence given in comments</td><td>TGAGAACCTTCAGGAGATATGCAA</td></tr><tr><td>Oct3/4 リバースプライマー</td><td>シグマ</td><td>配列 コメントで与えられた</td><td>CTCAATGCTAGTTCTCTTTCTCTCTCTCTCTCTCTC</td></tr><tr><td>Sox2 フォワードプライマー</td><td>シグマ</td><td>配列 コメントで与えられた</td><td>GGTTACCTCTCTTCCCCCCACTCCCCAG</td></tr><tr><td>Sox2 リバースプライマー</td><td>シグマ</td><td>配列 コメントで与えられた</td><td>TCACATGTGCGACAGGGGCAG</td></tr><tr><td>C-myc フォワードプライマー</td><td>シグマ</td><td>配列 コメントで与えられた</td><td>CAGAGGAGGAACGAGCTGAAGCGC</td></tr><tr><td>C-myc リバースプライマー</td><td>コメントで与えられた</td><td>シグマ</td>配列 <td>TTATGCACCAGAGTTTCGAAGCTGTTCG</td></tr><tr><td>ナノグフォワードプライマー</td><td>コメントで与えられた</td><td>シグマ</td>配列 <td>CAGAAAAAACCAGTGGTTGAAGACTAG</td></tr><tr><td>ナノグリバースプライマー</td><td>コメントで与えられた</td><td>シグマ</td>配列 <td>GCAATGGATGCTGGGATACTC</td></tr><tr><td>Ecat1 フォワードプライマー</td><td>シグマ</td><td>配列コメントで与えられた</td><td>TGTGGGGCCCTGAAAGGCGAGCTGAGAT</td></tr><tr><td>Ecat1 リバースプライマー</td><td>コメントで与えられた</td><td>シグマ</td>配列 <td>ATGGGCCGCCATACGACGACGCTCAACT</td></tr><tr><td>Rex1 フォワードプライマー</td><td>シグマ</td><td>コメントで与えられた</td><td>ACGAGTGGCAGTTTTTTCTTGGGA</td></tr><tr><td>Rex1 リバースプライマー</td> コメント<td>で与えられた</td><td>シグマ</td>配列 <td>TATGACTCACTTCAGGGGGCACT</td></tr><tr><td>Alb フォワードプライマー</td><td>シグマ</td><td>コメントで与えられたシーケンス</td><td>GTTCGCTACACCCAGAAAGC</td></tr><tr><td>Alb リバースプライマー</td><td>コメント</td><td>で与えられた Sigma コメントで与えられたシーケンス</td><td>CCACACAAGGCAGTCTCTGA</td></tr><tr><td>Aat フォワードプライマー</td><td>コメント</td><td>で与えられた Sigma シーケンス</td><td>CAGAGGAGGCCAAGAAAGTG</td></tr><tr><td>Aat リバースプライマー</td><td>コメント</td><td>で与えられた Sigma コメントで与えられた</td><td>ATGGACAGTCTGGGGAAGTG</td></tr><tr><td>Trf フォワードプライマー</td><td>Sigma</td><td>コメントで示された配列</td><td>ACCATGTTGTGGTCTCACGA</td></tr><tr><td>Trf リバースプライマー</td> コメントで示された<td>配列 シグマ</td> コメント<td>で示された配列</td><td>ACAGAAGGTCCTTGGTGGTG</td></tr><tr><td>B アクチン フォワードプライマー</td> コメントで示された<td>配列 シグマ</td> コメント<td>で示された配列</td><td>GACCTCTATGCCAACACGT</td></tr><tr><td>B アクチン リバースプライマー</td><td>シグマ</td><td>コメントで示された配列</td><td>AGTACTTGCTCAGGAGGA</td></tr><tr><td>BD Cytofix 固定バッファー</td><td>BD バイオサイエンス</td><td></td><td></td>560585</tr><tr><td>1x BD Perm/Wash buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>560585</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス OCT4-PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>560585</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス Nanog-PE</td><td>BD Biosciences 560585</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-メチルブタン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>X100-Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>rabbit pAb anti-OCT4</td><td>Abcam</td><td>ab19857</td><td>3 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>rabbit pAb anti-SOX2</td><td>Abcam</td><td>ab97959</td><td>1 &mu;g / ml</td></tr><tr><td>ウサギpAbアンチNanog</td><td>Abcam</td><td>ab80892</td><td>1 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>マウス mAb 抗 SSEA1</td><td>Abcam</td><td>ab16285</td><td>20 &mu;Cy3</td></tr><tr><td>で標識されたg/ml ヤギpAb抗ウサギIgG</td>、<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>111-165-003-JIR</td><td></td></tr><tr><td>Cy3で標識されたヤギpAb抗マウスIgG</td>の1/250濃度で使用 <td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>115-165-003-JIR</td> 1<td>/250</td></tr><tr><td>VECTASHIELD封入剤をDAPI</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT液剤システム</td><td>Sigma</td><td>B1911</td><td></td></tr><tr><td>水封入剤</td>で使用 <td>Σ16</td><td></td><td></td></tr><tr><td>%パラホルムアルデヒド</td>フィ<td>ッシャー</td><td>AA433689M</td><td>液は16%</td></tr>、4%<tr><td>ヘマトキシリンで使用eosin</td><td>Sigma</td><td>GH53/HT110216</td><td></td></tr><tr><td>PAS 染色</td><td>Sigma</td><td>395B</td><td></td></tr></tbody></table>

山中因子の過剰発現によって多能性の成体体細胞のin vivoでの再プログラミング中

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

定義された要因の強制発現による多能性状態への体細胞の初期化から生じる人工多能性幹（iPS）細胞は、再生医療のための新たな機会を提供しています。 iPS細胞のような臨床用途は、主に既存の再プログラミング方法論の効率が悪く、移植の際に腫瘍を形成する生成されたiPS細胞の危険性のために、これまで限定されていた。 我々は、多能性に向かって体細胞の再プログラミングは、再プログラミング因子の遺伝子導入によりインビボで達成することができるという仮説を立てた。効率的にin vivoで細胞を再プログラミングするためには、山中（OKSM）転写因子の高レベルは、標的組織で発現される必要がある。これは、標的組織に応じて、異なるウ​​イルスまたは非ウイルス性遺伝子ベクターを使用することによって達成することができる。この特定の研究では、プラスミドDNAの流体力学的尾静脈（HTV）の注射を配信するために使用したマウス肝細胞へのOKSM要因。これは実証的証拠大人のin vivoでの再プログラミング、高効率、高速な反応速度を持つ多能性状態への体細胞の提供。さらに、まだ腫瘍または奇形腫形成は、in situで観察されなかった。 これは、 インビボで体細胞を再プログラミングするプロトコルを実行し、将来の異なる組織タイプに適用することができるインビトロと比較して安全に効率よく、迅速に強化された多能性を誘導するために潜在的なアプローチを提供し得ると結論することができる。

図1は、OKSMをコードするプラスミドのマウス肝臓への遺伝子導入と、in vivo細胞リプログラミングを観察するために行われたさまざまな手法の概要を示している。プラスミドのHTV注入後、注入から2日目に、導入したリプログラミング因子（Oct3/4、Sox2、Klf4、およびcMyc）のmRNAレベルにおける遺伝子発現の有意な上昇が観察された。図2aに示すように、これらの因子の発現は注入後の時間経過とともに減少する。内在性多能性マーカー（Nanog、Ecat1、およびRex1）の発現については、注入後2日目および4日目に、生理食塩水を注入した個体の肝細胞と比較してレベルが有意に上昇し、8日目以降はベースラインレベルに戻った(図2b)。同時に、肝細胞特異的遺伝子（Alb、Aat、およびTrf）のダウンレギュレーションにより、肝細胞集団の脱分化が確認された。これは4日目に統計的に有意であり、8日目以降にベースラインレベルに達した(図2d)。
Oct3/4およびNanogのタンパク質レベルでの発現をフローサイトメトリーにより検討した。図に示したように、 図 2cHTV注入後の1日目にはOct3/4のみが発現していましたが、内因性多能性マーカーであるNanogの発現には4日目まで待つ必要がありました。
in vivoでの細胞リプログラミングの発生は、抗OCT4、抗SOX2、および抗Nanog抗体を用いた肝組織の免疫組織化学的分析と、ALP活性の特異的染色によってさらに確認されました。すべてのマーカーおよび酵素活性に対して陽性となる細胞は、OKSMを注入した動物の肝組織において再現性をもって検出されましたが、生理食塩水を注入した対照群では検出されませんでした(Figure 3)。
pDNAのHTV注入によるin vivo細胞リプログラミングに伴う潜在的な毒性副作用およびテラトーマ形成について、血清中の肝酵素レベルの定量化、ならびに120日間にわたる肝組織切片のH&amp;E染色およびPAS染色により検討した。2日目まで一過性で軽度の組織損傷の徴候が観察されたが、それ以降は認められなかった。研究期間中、テラトーマの形成や、異形成または形態学的変化の兆候は認められなかった(Figure 4)。アルブミンおよび肝酵素レベル、および組織切片のグリコーゲン染色で確認したところ、全個体において研究期間を通じて肝臓の構造的または機能的な異常は見られなかった(Figures 4b および cを参考)
<img alt="生体内リプログラミング因子の注入、マウスの図解、プラスミド、組織分析、PCR、サイトメトリー。" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50837/50837fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50837/50837fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図1"> 
図1. in vivo リプログラミング手順とその分析の概略図。プロトコルは、(i) リプログラミング因子の in vivo 投与と、(ii) 組織採取およびサンプル分析という2つの主要な段階で構成される。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50837/50837fig1large.jpg" target="_blank"> ここをクリックして大きな図を表示</a>。
<img alt="遺伝子発現解析。日数経過に伴う相対的発現データを示す棒グラフ。図a-d。科学的結果。" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50837/50837fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50837/50837fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図 2"> 
図 2. 成就マウス肝臓における山中転写因子のin vivo過剰発現。Balb/Cマウスに0.9%生理食塩水のみ、または0.9%生理食塩水に溶解した75 μgのpCX-OKS-2Aおよび75 μgのpCX-cMycをHTV注射し、2、4、8、12、24日目に肝細胞のRT-qPCR解析を行い、以下の相対的遺伝子発現を決定した：(a) 導入した転写因子 (OKSM) および (b) 内因性多能性マーカー； (c) OCT3/4陽性およびNanog陽性細胞のフローサイトメトリー解析； (d)RT-qPCRにより決定した肝細胞マーカーの相対的遺伝子発現。すべての遺伝子発現レベルは、生理食塩水をHTV注射した群で正規化した。(* p&lt;0.05は、分散分析およびTukeyの多重比較検定により、生理食塩水HTV注射群と比較して統計的に有意な差があることを示す)。図はYilmazer et al.29より引用。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50837/50837fig2large.jpg" target="_blank">こちらをクリックして拡大図を表示</a>。
<img alt="生理食塩水投与群とOKSM処理群におけるOCT4、SOX2、NANOGの免疫蛍光顕微鏡による比較" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50837/50837fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50837/50837fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図3"> 
図3. 免疫組織化学による成体マウス肝組織のin vivo細胞リプログラミング。 Balb/Cマウスに、0.9%生理食塩水のみ、あるいは0.9%生理食塩水に溶解した75 μgのpCX-OKS-2Aおよび75 μgのpCX-cMycをHTV注入した。4日目に肝臓を回収し、凍結組織切片を抗OCT4、抗SOX2または抗Nanog抗体で染色して免疫反応性を評価した。また、BCIP/NBTを用いて組織内のALP活性を測定した（40倍）。スケールバーは100 μmを示す。図はYilmazer et al29より改変。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50837/50837fig3large.jpg" target="_blank">こちらをクリックして拡大図を表示</a>。
<img alt="生理食塩水投与群とOKSM治療群における肝組織学、酵素レベル、およびアルブミンの実験結果。" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50837/50837fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50837/50837fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
図4. 肝機能および肝組織病理に対するin vivo細胞リプログラミングの影響。0.9%生理食塩水に溶解した75 μgのpCX-OKS-2Aおよび75 μgのpCX-cMyc、または0.9%生理食塩水のみをHTV投与したBalb/Cマウス。2、4、8、12、50、および120日目に肝組織および血清を採取し、以下について解析した：(a) H&amp;E染色、(b) 肝酵素レベル、(c) アルブミンレベル、(d) PAS染色。代表的な画像は光学顕微鏡（10X）で撮影した。スケールバーは100 μmを示す。図はYilmazer et al.29より改変。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50837/50837fig4large.jpg" target="_blank">ここをクリックして拡大図を表示</a>。

この研究は、奇形腫を生成せずに、生体内での体細胞の多能性に向けた再プログラミングを示しています。ヤマンカ因子をコードするプラスミドDNAの流体力学的尾静脈注入を使用して、成体肝細胞の多能性が強化された細胞へのin vivoリプログラミングを誘導しました。

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

次の実験の全体的な目標は、体細胞のin vivo微小環境における多能性に向けたリプログラミングを誘導し、評価することです。これは、ヤマナカ因子をコードするプラスミドDNAをシリンジにロードし、それらをA BCマウスの尾静脈に流体力学的に注入することで達成されます。初代肝細胞は肝臓組織から単離され、関連する遺伝子およびタンパク質の発現レベルは、リアルタイムのQ-R-T-P-C-Rおよびフローサイトメトリーによって研究されます。次に、肝臓組織全体を切片化し、さまざまな手法で染色して、組織の再プログラミングを確認し、手順の毒性を評価します。リプログラミング、多能性、および肝細胞特異的マーカーの遺伝子およびタンパク質発現の違いを示す結果が得られます。さらに、このアプローチの安全性は、生化学的および組織学的証拠によっても検証されています。体細胞をin vivoでリプログラミングする主な利点は、それが迅速、効率的、かつ一過性に起こることです。この方法は、リプログラミング分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、in vivoで成体に多能性を誘導した結果。麻酔を開始するには、生後6週間のメスのブルビーマウス。次に、山中因子をコードするプラスミドDNA溶液ENCと、添付のテキストプロトコルに記載されている生理食塩水コントロールを調製しますトランスフェクションを成功させるためには、注射後所定の時点で5〜7秒以内に全用量を注入します。胸腔を露出させ、温熱したHBSSバッファーで肝臓を灌流することにより、初代肝細胞を分離し、次に肝臓消化培地灌流を毎分0.6リットルの流速で15分間、肝臓が腫れて緩むまで灌流します。次に、ファロールと冠状動脈の靭帯を切断した後、鉗子で肝臓を切除します。初代肝細胞の単離の詳細については、この追加のJoVEビデオの手順を参照してください。次に、肝臓を100ミクロンの細胞ストレーナーに通しながら、肝細胞洗浄培地で肝臓を洗浄します。細胞懸濁液を得るには、細胞懸濁液を50ミリリットルのチューブに集め、肝細胞洗浄培地で容量を15ミリリットルに調整します。次に、細胞懸濁液を50 Gで摂氏4度で4分間遠心分離します。上清を捨て、細胞ペレットを懸濁します。10ミリリットルの肝細胞洗浄培地では、肝細胞は非常に壊れやすい細胞であるため、細胞ペレットは慎重に懸濁する必要があります。遠心分離手順を合計3回繰り返し、最終的なペレットを10ミリリットルの肝細胞洗浄培地に懸濁します。次に、ヘモサイトメーターと光学顕微鏡を使用して細胞数を推定し、単離された肝細胞の遺伝子発現を研究します。まず、Gの300倍で6番目の細胞に10の2倍を遠心分離し、スナットを廃棄します。次に、サプライヤーの指示に従って、スピンカラムキットを使用して細胞からRNAを抽出します。次に、治療群と対照群から抽出した 1 マイクログラムの RNA を使用して 2 段階の Q-R-T-P-C-R を実行し、リプログラミング多能性および肝細胞マーカーのレベルの変化を探します。細胞の多能性の向上をタンパク質レベルで解析するには、単離した肝細胞を取り出し、細胞の密度を10の10倍から1ミリリットルあたり7番目の細胞に調整します。フローサイトメトリーでは、細胞懸濁液の100マイクロリットルのアリコートを調製し、100マイクロリットルのBD細胞に固定します。固定後、固定バッファーを室温で20分間固定し、細胞をペレット化して再蘇生させ、100マイクロリットルの1X BD浸透洗浄バッファーに懸濁し、10分間インキュベートし、室温で加えます。次に、多能性細胞に発現する転写因子の一次抗体と細胞を30分間インキュベートします。これには、CP SCI 5.5 による対マウス T フォーまたは対米ナグ pe のいずれかが含まれます。ネガティブコントロールとアイソタイプコントロールも必ず含めてください。次に、プラスミドDNAクライオ切片、肝臓への注入の4日後に、CP sci 5.5およびPEチャネルを使用してフローサイトメーターで染色された細胞を、添付のテキストプロトコルに記載されているように分析します。次に、ブロッキングバッファーでメタノール固定切片を室温で1時間インキュベートし、続いて2回の洗浄ステップでそれぞれ5分間、洗浄バッファーを使用します。次に、抗T抗体4、抗ソックス2抗体、抗ナグ一次抗体を別々のスライドに添加し、肝臓組織を完全に覆うようにします。サンプルを異常を防ぐために覆い、切片を摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、切片を洗浄バッファーでそれぞれ5分間、3回洗浄します。その後、インキュベーション後、それぞれの二次抗体と室温で1.5時間インキュベートします。肝臓の切片をPBSでそれぞれ5分間3回洗います。それらをダッピーアンチフェードミディアムに取り付け、カバースリップで保護します。次に、落射蛍光顕微鏡でスライドを視覚化します。クライオ切片を室温で15分間温め、4%パラホルムアルデヒドで2分間固定します。その後、スライドを30分間風乾します。乾燥したら、切片をB-C-I-P-N-B-T液体基質と摂氏37度で30分間インキュベートします。この間、溶液は組織内でアルカリホスファターゼと反応し、顕微鏡で見える不溶性の沈殿物を形成します。30分後、スライドを蒸留水で洗浄し、水性封入剤でマウントします。次に、4日目、8日目、12日目、120日目に光学顕微鏡を使用して画像を撮影します。トランスフェクション後、心室から直接300マイクロリットルの血液を採取します。さまざまなサンプルが収集されている間、血液を氷上に置いて、血液が早く凝固しすぎないようにします。すべてのサンプルが収集されたら、摂氏37度で30分間、または血栓ができるまでインキュベートします。次に、サンプルを2000Gで5分間遠心分離し、血清を新しいeinorチューブに慎重にピペットで移します。次に、分光光度計を使用して、アルブミンと肝臓酵素、A-L-T-A-S-T-A-L-P、GLDHの血清レベルを分析します。肝臓毒性を評価するために血液をスクリーニングすることに加えて、添付のテキストプロトコルに記載されているように、パラフィン包埋組織切片も調製します。次に、HおよびDまたはPIS染色で組織を染色し、キャプチャされた画像を分析します。プラスミドの流体力学的尾静脈注射後の光学顕微鏡検査では、トランスフェクションされたリプログラミング因子の遺伝子発現が大幅に増加しました。mRNAレベルでのT3、4、ソックス2、およびcmicは、注射後2日目に観察されました。これらの因子の発現は、注射後、時間とともに減少します。内因性多能性マーカーであるナノg ECAT oneおよびREX oneは、注射後2日目と4日目に生理食塩水を注射した動物の肝細胞と比較して大幅にアップレギュレーションされ、8日目以降はベースラインレベルに戻りました。同時に、肝細胞集団の脱分化は、4日目に統計的に有意であり、8日目以降にベースラインレベルに達した肝細胞特異的遺伝子、A-L-B-A-A-T、およびTRFのダウンレギュレーションによって確認されました。また、T-3-4とnagのタンパク質レベルでの発現を、ここに示すようにフローサイトメトリーで調べました。OC 3 4 のみが初日に表現されます。HTV注射後、内因性多能性マーカーnano Gの発現には、4日目まで待つ必要がありました。in vivo細胞のリプログラミングの発生は、肝臓組織の免疫組織化学的分析によってさらに確認されました。すべてのマーカーおよび酵素活性に対する陽性細胞は、KSM注射動物の肝臓組織に再現性がありますが、生理食塩水注射コントロールには見られません。H染色、e染色、PAS染色は、組織損傷の一過性ではあるが重篤ではない徴候を示し、2日目以降に消失した。研究期間中、奇形腫の形成や異形成や形態学的変化の兆候は観察されませんでした。また、ここに示されているアルブミンと肝臓の酵素レベルによって確認されたように、どの動物についても、研究の過程を通じて肝臓の機能異常はありませんでした。この研究は、多能性に向けたin vivo細胞のリプログラミングの原理的な証拠の証明を提供します。これは、山中因子の投与後に、急速に、推移的に、効率的に起こりました。私たちは、適切な遺伝子があれば、肝臓以外の他の組織でもin vivoリプログラミングを達成できるという仮説を立てました。肝臓ベクターは、標的組織をトランスフェクションするように設計されています。さらに、プロトコルと技術の改善により、さらなる研究に使用するin vivoプログラム細胞を抽出することが可能になるかもしれません。

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Biology

生物学

このビデオでは、誘導レンチウイルスを用いて誘導多能性幹細胞を生成するための手順を示して発現するOct4は、レトロウイルスベクター、c -...

ソックス- 2の強制発現によってMEFSからiPS細胞を生成し、OCT - 4、c - Mycの、とKLF4

Stemgent Doxの誘導性マウスTFのレンチセットは、人工多能性幹（iPS）細胞に、マウス胚性繊維芽細胞（MEF）を再プログラムすることができます。ここでは、マウスプログラミング転​​写因子Oct4のDOX誘導性発現のためのプロトコルを示す、レトロウイルスベクター、KLF4およびc -...

4つの転写因子とマウス胚線維芽細胞を再プログラムすることによって誘導多能性幹細胞の生成、ドキシサイクリンは、レンチウイルス伝達系の誘導性

我々は、人的要因Oct4は、レトロウイルスベクター、Nanogの、そしてLin28のレンチウイルスを介した配信を用いてヒトの体細胞から誘導多能性幹細胞の生成のためのプロトコルを示す。多分化能は、形態と胚性幹（ES）細胞特異的マーカーの存在によって確認された。...

StemgentヒトTFのレンチセットでヒト線維芽細胞を再プログラムすることによって誘導多能性幹細胞の生成

大人の線維芽細胞から再プログラムヒト人工多能性幹細胞のコロニーを選択し、分離

人工多能性幹細胞の生成は、自家移植の導出のための魅力的な展望を提供しています。しかし、多能性状態と面倒な再分化の進行はまだ臨床の翻訳を妨げます。ここでは、成人のヒト線維芽細胞の誘導および誘導神経前駆細胞への直接変換と神経系統へその後の分化を説明します。...

成人ヒト線維芽細胞の導出と拡張神経前駆細胞へのそれらの直接変換

誘導多能性幹細胞（iPS細胞）が臨床応用および基礎研究のための患者特有の組織のソースを表します。ここでは、非組み込みエピソームプラスミドを用いてウイルスを含まないiPS細胞に凍結バフィーコートから得たヒト末梢血単核細胞（PBMNCs）を再プログラムするために詳細なプロトコルを提示します。...

非統合ソームプラスミドを用いて凍結軟膜から誘導多能性幹細胞の生成

体 SCs の可用性は再生医療の重要な疾患モデル作製と SC プロパティへの洞察力を得るために。再プログラムする実験的戦略の紹介、体外が単一の転写コアクチベーター...

・ デ ・ ノボヤップ/タズによる体細胞の幹細胞の生成

ここで初期化因子をエンコード変更された Mrna を用いた誘導多能性幹細胞に主線維芽細胞をプログラムし直すための臨床的に関連性の高い、高効率、フィーダー フリー法について述べるし、成熟したマイクロ Rna 367/302 を模倣しています。リプログラミング効率を評価する手法クローン iPSC のコロニーを拡大し、トラ 1 60...

RNA に基づく誘導多能性幹細胞に主線維芽細胞のプログラムし直す

細胞リプログラミングでは、多能性細胞状態を調節し維持する主要遺伝子の導入が必要です。記載されたプロトコルは、ウイルス/統合方法なしでヒト皮膚線維芽細胞からの誘導多能性幹細胞(iPSC)コロニーの形成を可能にするが、非修飾RNA(NM-RNA)を免疫回避因子と組み合わせて細胞防御機構を低下させる。...

腹部皮膚からの成人ヒト皮膚線維芽細胞の分離と非積分法を用いた人工多能性幹細胞の生成

ない細胞株が存在しないと肝類洞内皮細胞（SECS）の研究は、動物から得られた初代培養細胞を使用して実行する必要があります。このメソッドは、その後の培養と実験のためのSECの浄化のための肝臓の消化および分画遠心法に依存しています。...

肝灌流による肝細胞の精製した生体肝エンドサイトーシスに

学ぶ 成体肝細胞のin vivo再プログラミング法。Yamanaka因子を用いた水力学的尾静脈注射で、多能性獲得と遺伝子発現変化を評価。安全かつ効率的な細胞可塑性研究に応用可能です。

山中因子の過剰発現によって多能性の成体体細胞のin vivoでの再プログラミング中

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