Name: 共有結合は、自己組織化単分子膜の手法を用いて表面上のBMP-2の結合 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 学ぶBMP-2の共有結合固定法。自己組織化単分子膜を用いて表面に結合し、生物活性を保持します。抗体結合アッセイと細胞シグナル解析で検証可能な、骨形成因子研究の有用な手法です。

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我々は彼の親切なサポートのために教授JPスパッツ（生物物理化学、ハイデルベルク大学、新素材やバイオシステムズの専攻、知能システムのためのマックスプランク研究所、シュツットガルト）に感謝。マックスプランク研究機構とドイツ学術振興（EAC-AへのDFG SFB/TR79。）からの財政支援も大幅に認められている。

1。 11-Mercaptoundecanoyl-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MU-NHS）の合成<ol><li>室温（RT）で40 mlのジクロロメタン（PA）中の10 mlのアセトン（PA）（ジメチルアミノ）ピリジン1gの11 -メルカプトウンデカン酸- 500mgのN-ヒドロキシスクシンイミドの溶液及び30mgの4滴ずつ加える。 </li><li> 0℃に反応液を冷却し、（窒素雰囲気下）ジクロロメタン10mlを滴下1.1グラムN、N &#39; -ジシクロヘキシルカルボジイミドを加える。 1時間低温で反応を維持し、次いで室温で一晩撹拌する。 </li><li>沈殿物を濾過し、減圧下で乾燥させます。 1:1の割合で石油ベンゼン、酢酸エチル（PA）を用いるフラッシュクロマトグラフィーによって生成物を精製する。 </li></ol> 2。均質な金層の作製<ol><li>精密ワイプとし、酢酸エチル（PA）およびメタノール（PA）の1:1混合物を含有する溶液中で5分間超音波処理して清浄なガラスカバースリップ。 RinsE基質メタノールで、窒素気流下で乾燥させます。 </li><li>スパッタコーティング装置ではクリーンな基板を配置します。チャンバを排気。 60秒間スパッタ法により、クロムターゲットから最上部のクロム酸化物層を除去。金属線と40 nmの金の層を塗布し、その後10nmのクロム層でコートして下にサンプルを置きます。 </li></ol> 3。 BMP-2の表面固定化<ol><li>約1mMの最終濃度までNにおけるMU-NHS、N-dimethlyformamide（DMF）に溶解し、窒素雰囲気下で4時間RTにてMU-NHS溶液中に金基板をインキュベートする。 </li><li> 2分間DMF中で超音波処理表面は、DMF、MeOHで洗浄し、窒素気流下で乾燥させます。 </li><li> 100μg/ mlの（-80℃で保存アリコート）の濃度で滅菌した4 mMのHCl中のrhBMP-2のストック溶液を準備します。ワーキング希釈液（3.5μg/ ml）をするために、PBS / NaClを（PBSで1 M NaClを含む）と、中のストック溶液を希釈使用直前にpH8.5にdjust。 </li><li>一晩4℃でのrhBMP-2作業溶液中にMU-NHS官能表面をインキュベートする。インキュベーション上清を取り除きます。超音波処理は、2分間、PBS / NaCl中に表面および滅​​菌PBS / NaClで3回洗う。 </li></ol> 4。表面特性化<ol><li>抗体の非特異的吸着をブロックするために、抗BMP-2抗体（1:100、1％（重量/体積とのインキュベーション、続いてRTで1時間PBS溶液中の5％BSA（w / v）ので表面をインキュベートするRTで1時間）BSA / PBS溶液）。 PBSおよび30秒間の超音波処理で二回表面を洗浄します。 </li><li>次いで、PBSで二回洗浄し、RTで30分間HRP結合二次抗体（1:1,000、1％（w / v）のBSA / PBS溶液）で基質をインキュベートする。 </li><li>プレートリーダーを用いて570nmでのHRP酵素活性を測定するためにAmplifluレッドアッセイを使用する。 </li></ol> 5。生物学的活性の解析<ol><li>シード1×10 6ウェルPLにおけるウェルあたり5マウスC2C12筋芽細胞10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび37℃/ 5％CO 2で24時間、それらをインキュベートを補充したピルビン酸塩を含有する高グルコースDMEMからなる増殖培地中でのATE。 </li><li>固定化されたBMP-2で飾られた表面に播種する前3-5時間無血清DMEMで細胞を餓死。 </li><li>短期的なシグナル誘導の調査のために、200μlの新鮮な無血清DMEMで培地を交換し、細胞上に固定化BMP-2の表面に配置します。表面は傷を避けるために、先端の細いピンセットで処理する必要があります。 </li><li>優しく表面を削除し、ピペットで培地を吸引、PBSで2回細胞を洗浄。細胞応答の分析に進みます。 </li><li>長期の生物学的活性の分析のため、細胞をプレート低血清条件（2％FBS）で表面及び37℃/ 5％CO 2で培養して上に6日間。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

このプロトコルでは、生物活性のrhBMP-2で官能化表面の調製が記載されている。 ;のrhBMP-2タンパク質の2）の共有結合固定金表面上の二官能性リンカーの自己集合単分子層（SAM）の1）初期形成：このアプローチは、2つのステップを含む。以前の研究では、二官能性リンカーおよび成長因子の有効な結合を検証し、表面固定化のrhBMP-2は、その生物学的活性19を維持することを実証した。固定化された形で提示成長因子の生物活性はまた、タンパク質の放出およびそれらのその後の内在化は、細胞刺激24,25に必須でないことを示す、他の研究で示されている。細胞膜22,2であるため、異なるタイプの受容体の増強された占有率の有効投与量を維持しながら、実際には、成長因子の共有結合固定化は、標的細胞の持続的な刺激を可能にする3,26-28。 固定化されたrhBMP-2、気を提示する表面の調製のために全体の手順を通して表面の処理にとのrhBMP-2溶液を製造する際に注意が必要です。カバーガラスは、清潔で乾燥しなければならず...

骨形成タンパク質2（BMP-2）は、 デノボ骨形成ならびに胚発生および成体のホメオスタシス1-3中のいくつかの組織の調節因子の誘導物質としてトランスフォーミング成長因子（TGF-β）ファミリーの作用のメンバーである。 生物学的に活性なホモ二量体のBMP-2タンパク質の各単量体は、非常にすべてのBMP 4に保存されている「システインノット」モチーフを、含まれています。第七のシステインは二つのモノマー5,6間の分子間結合を形成する、二量体化に関与しているのに対し、7個のシステイン残基の六つは、各単量体を安定化する分子内ジスルフィド結合を形成する。この高度に保存されたシステインノットは、BMP-2タンパク質の三次元構造を定義し、熱、変性剤及び酸性pH 7-9に対する抵抗としてのそのユニークな特性を決定する。 BMP-2は、それによってシグナル伝達を誘導する、セリン/スレオニンキナーゼ膜貫通受容体に結合する<sup&gt; 10月12日。受容体のオリゴマーのモードに応じて、異なるシグナル伝達経路が活性化されています。のSmad非依存のシグナル伝達カスケードは、Smadの複雑な核移行との転写の活性化受容体リン酸化の結果によって活性化されたSmad依存性経路のに対し、p38シグナルを経由して、アルカリホスファターゼ誘導を導くこのような分化の阻害剤（Id）の12〜14などの特定の標的遺伝子。 骨形態では、BMP-2は、このように治癒および骨のデノボ形成を刺激、骨芽細胞への間葉系幹細胞の分化を誘導する。現在、組換え的にBMP-2は、骨折したサイトの治癒を促進するために臨床応用されている表現。骨組織工学における一般的な方法は、局所送達システムと比較して低侵襲性で注射可能な成長因子の使用である。しかしながら、 インビボ研究と臨床応用が示されているその短い生物学的半減期、非特異的locのalizationおよびBMP-2の迅速な局所的クリアランスは、いくつかの、地元の異所性および全身の問題15につながる可能性があります。従って、効果的なプレゼンテーションを得るために、材料内又は上にBMP-2の捕捉または固定化は、標的部位でのそのローカルおよび持続送達のために必要である。持続的な送達は、物理的捕捉、吸着またはイオン錯体16のような非共有結合性の保持の手法を用いて達成することができる。しかしながら、分子17の変性における表面へのタンパク質の非特異的吸着がよい結果が知られている。増殖因子の共有結合のために、支持体の種類は、過去10年間にわたって開発されてきた。例えば、タンパク質のアミノ基またはカルボキシル基を標的とする二官能性連結分子の使用は、必ずしも固定化を達成するために、タンパク質の修飾を必要としないアプローチの一種である。実際には、一方のタンパク質修飾は、タンパク質の配向を制御するという利点を提供人工的なドメイン、ペプチドタグおよび部位特異的鎖の導入は、成長の生物学的活性は、17因子変更することができる。従って、原因支持材料との相互作用のために変性を回避するために、表面が所望の因子18のカップリングに続いて、連結分子の自己組織化単分子膜（SAM）を用いて、例えば、予め官能化することができる。我々は、その遊離アミン残基を標的とすることによって共有結合的に表面にBMP-2を固定化するSAMベースのアプローチを使用して、固定化タンパク質がその短期および長期の生物学的活性の19の両方を保持することが示されている。このプロトコルは、細胞膜で発生し、骨形成シグナルを担当する細胞内シグナル伝達を調節するメカニズムに関するin vitro試験のための細胞にBMP-2を実現するための簡単で効率的な方法を提供します。

<table><tbody><tr><td>N-ヒドロキシスクシンイミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>130672</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>4-(ジメチルアミノ)ピリジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>522805</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>AppliChem</td><td>A2282</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>11-メルカプトゥンデカン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>674427</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ジクロルメタン</td><td>メルク</td><td>106050</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D80002</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>石油ベンゼン</td><td>メルク</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ガラスカバースリップカール</td><td>ロス</td><td>M 875</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>酢酸エチル</td><td>Chem</td><td>A3550</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>カールロス</td><td>4627</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N,N-ジメチルホルムアミド</td><td>カールロス</td><td>T921</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>rhBMP-2</td><td>R&D Systems</td><td>355-BM</td><td>キャリアフリー; E.coli</td></tr><tr><td>PBS</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td>&nbsp; で表されます。</td></tr><tr><td>NaCl</td>カール<td>ロス</td><td>HN00.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)</td><td>ダウコーニング</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>シルガード184シリコーンエラストマーキット</td><td>ダウコーニング</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>対rhBMP-2</td><td>シグマ</td><td>B9553</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td>二次<td>抗体</td></tr><tr><td>アンプリフルレッドアッセイ</td><td>Sigma</td><td>90101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ダルベッコ モディファイド イーグル ミディアム (DMEM) (1x)、液体</td><td>Gibco</td><td>41966</td><td>高グルコース</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td>滅菌ろ過、細胞培養試験</td></tr>済み <tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>トリプシン 0.05% (1x) と EDTA 4Na</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>グリシン (0.1 M)</td><td>Riedel-de Ha&euml;n</td><td>33226</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (1%)</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td>溶解バッファー (ALP アッセイ)19</sup</td></tr><tr><td>>塩化マグネシウム (MgCl2)(1 mM)</td><td>Carl Roth</td><td>HNO3.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>塩化亜鉛 (ZnCl2) (1 mM)</td><td>Carl Roth</td><td>3533.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>p-ニトロフェニルホスフェート(pNPP)</td><td>Sigma</td><td>S0942</td><td>ホスファターゼ基質</td></tr><tr><td>抗ミシン重鎖(MHC)</td><td>発生研究 ハイブリドーマバンク、アイオワ大学</td><td>MF20</td><td>モノクローナル抗体</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウスIgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>シグマ</td><td>D9542</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Ultrsonicバス(Sonorex Super RK 102H)、周波数35 kHz</td><td>BANDELIN electronic GmbH Co. KG&</td><td></td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>MED 020 スパッタコーティングシステム</td><td>BAL-TEC AG</td><td></td><td>コーティング条件 Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec</td></tr><tr><td>Tecan Infinite M200 プレートリーダー</td><td>Tecan</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

共有結合は、自己組織化単分子膜の手法を用いて表面上のbmp-2の結合

Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

骨形成タンパク質2（BMP-2）は、骨組織の細胞外マトリックス中に埋め込まれた成長因子である。このようにして治癒およびデノボ骨形成を刺激する骨芽細胞への間葉系細胞の分化のトリガーとしてBMP-2作用する。足場と組み合わせた組換えヒトBMP-2（のrhBMP-2）の臨床使用は、プレゼンテーションモードに基づいて、最近の論争を調達していると量が送達される。ここで紹介するプロトコルは、細胞へのin vitroでの研究のために、BMP-2を実現するための簡単で効率的な方法を提供します。私たちは、ヘテロ二官能性リンカーからなる自己組織化単分子膜を形成する方法を説明し、のrhBMP-2の共有結合固定化を得るために、その後の結合工程を示す。このアプローチでは、タンパク質の生物学的活性を維持しながら、BMP-2の持続的な提示を実現することができる。実際には、BMP-2の表面固定化は、非特異的な広告を防ぐことによって、ターゲットを絞った調査を可能にするorption、成長因子の量を低減しつつ、最も顕著には、表面からの制御されない放出を阻害する。細胞は、共有結合で固定化したrhBMP-2を提示する表面に露出しているときにBMP-2によって引き起こさ両方短期および長期のシグナル伝達事象は、BMP-2刺激に対する細胞応答に関するin vitro研究のためのこのアプローチが適して、行われている。

それは生物学的に不特定の化学的な調整可能なシステムを提供していますので、我々のセットアップでは、金を賦形剤として選ばれた。さらに、自己組織化単分子膜の適用は、多くの利点を伴う。それらの官能末端基をさらに修正することができながら、SAMは自然に、金属や欠陥の少ないフォーム単層上での「ヘッドグループ」を経由して吸着する。こうして彼らは、制御された、まだ適応性の高い方法で20で、インターフェイスの特性を調整するためのプラットフォームを提供します。 金でコーティングされた表面上のBMP-2の固定化のために、我々は、2段階のアプローチを使用した：1）タンパク質（ 図1参照）とリンカーとを反応さ）の金層にMU-NHSリンカーと結合して、[2。のrhBMP-2の結合を証明するために、我々は、酵素免疫測定法を使用した。このアッセイにおいて、固定化されたrhBMP-2を提示する表面は、BMP-2特異的抗体およびHRPとコンジュゲート二次抗体と共にインキュベートした。後者の結合は、Dが可能Amplifluレッド溶液を使用してetermined。過...

我々は、表面上にBMP-2の効率的な固定化を達成するための方法を記載している。我々のアプローチは、その遊離アミン残基を介してBMP-2の共有結合を達成するために、自己組織化単分子膜の形成に基づく。この方法は、細胞膜でのシグナル伝達を研究するための便利なツールです。

共有結合は、自己組織化単分子膜の手法を用いて表面上のBMP-2の結合

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

この手順の全体的な目標は、BMPの2つの分子をその生物活性を失うことなく、表面に共有結合させることです。これは、最初に物理蒸着によって基板上に金層を形成することによって達成されます。2番目のステップは、mu NHSA二官能性NHSチオールリンカーの自己組織化単層を作成することです。次に、RH BMP 2がリンカーに共有結合します。最後のステップは、超音波処理によって非結合BMP 2を除去することです。最終的に、抗体結合アッセイを使用して、BMP 2が表面に正常に結合することを示し、表面結合BMP 2の生物学的活性は、SMA 1 5 8リン酸化を分析することにより細胞内で決定されます。この方法は、成長因子の細胞表面での受容体への最初の結合がシグナル伝達応答を引き起こすのに十分であるかどうかなど、成長因子生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手順を実演するのは、私の研究室の2人のメンバー、テレサ・ポールとエリザベス・シュワブです。この手順を開始するには、精密ワイプでガラスカバースリップをきれいにし、酢酸エチルとメタノールの1対1の混合物で5分間超音波処理します。超音波処理後、基質をメタノールですすぎ、窒素流下で乾燥させる。クリーンな基板をスパッタコーティング装置にセットし、チャンバーを排気します。クロムターゲットの最上部にある酸化クロム層を60秒間スパッタリングして除去します。次に、基板を10ナノメートルのクロム層でコーティングし、続いて40ナノメートルの金層でコーティングします。終了したら、チャンバーから金の基板を取り出し、脇に置きます。金基質を2つのネックの丸底フラスコに移し、DMF中の1ミリモルM-U-N-H-Sで室温で窒素雰囲気下で4時間インキュベートします。インキュベーション後、DMFで基質を2分間超音波処理します。DMFとメタノールですすぎ、窒素流下で乾燥させます。RHB MP 2 ストック溶液を PBS 中の 1 モル塩化ナトリウムで希釈し、最終濃度を 1 ミリリットルあたり 3.5 マイクログラムにします。使用直前に、滅菌済みの10ミリモル水酸化カリウムを使用して、この作業溶液をpH 8.5に調整します。サンプルの上にA-P-D-M-Sリングを置きます。基質を6ウェルプレートに移し、基質表面のみがインキュベーション溶液にさらされるようにします。次に、官能基化されたM-U-N-H-S基質をRHB MP 2ワーキング溶液と摂氏4度で一晩インキュベートします。インキュベーション上清を除去した後、PBSに1モルの塩化ナトリウムを加え、基質を2分間超音波処理します。終了したら、PBS中の滅菌1モル塩化ナトリウムで基質を3回洗浄し、抗体の非特異的吸収をブロックします。基質をPBS中の5%BSA中で室温で1時間インキュベートします。その後、

covalent-binding-bmp-2-on-surfaces-using-self-assembled-monolayer

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

ここでは、骨形成タンパク質（BMP）固定された細胞のシグナル伝達を可視化する抗体の組み合わせで近接ライゲーションアッセイ（PLA）を、使用する方法を示します。このテクニックは、私たちは、内因性BMP活性化エフェクター複合体の核内蓄積を追跡し、BMP4刺激下で時間をかけて自分のレベルを定量することができました。...

使用BMP4のエフェクター-錯体のダウンストリームシグナリングの検出その場で PLA、近接ライゲーションアッセイ

多種多様な単一分子をAFMチップに共有結合するプロトコールが提示されます。これらの分子が固体支持体および生体界面に付着力および自由エネルギーを決定するための手順および例が提供される。...

原子間力分光法による単一分子の接着性を調査

私たちは、固定化されたタンパク質やアプタマーとナノ構造基板と対峙するナノ生物学的システムの作製と特性評価について説明します。ナノ構造基板のリソグラフィー作製、バイオ機能化、表面増強ラマン分光法(SERS)の特性評価を含む関連する実験ステップが報告されています。表面固定化タンパク質のSERS検出、およびタンパク質-リガンドおよびアプタマー-リガンド結合のプローブが実証されています。...

表面EBL作製したナノ構造基板を用いた生体分子のラマン分光検出の強化

私たちは、流体脂質二重層によって取り囲まれるナノメートルタンパク質のパッチでガラスを官能化するプロトコルを提示します。これらの基板は、高度な光学顕微鏡と互換性があり、細胞接着および遊走の研究のためのプラットフォームとして機能することが期待されます。...

サポートされている脂質二重層中のリガンドナノクラスター配列

骨形態形成タンパク質 2 (BMP2)...

骨形成タンパク質 2 固体表面にクリックケミストリーによるサイト向け固定

このプロトコルを記述する、heterobifunctional シラン カップリング剤による酸化シリコン薄膜表面の原子間力顕微鏡による単一分子力分光法のために設計するで例示されている蛋白質の共有結合固定化、RrgA の相互作用 (毛 1 先端付着性S.

力の単一分子分光法のための蛋白質の共有結合固定

原子間力顕微鏡(AFM)片持ち体先端へのプローブ分子の共有結合は、その物理的性質を調査する上で不可欠な技術である。これにより、AFMベースの単一分子力分光法を介して、高い再現性を持つ伸縮力、脱着力、ポリマーの長さを決定することができます。...

AFMベースの力分光法のための単一分子の共有結合

バイオメンブレン力プローブ(BFP)は、イン ・ス・ ダイナミック・フォース分光法(DFS)の技術です。BFPは、生細胞上の分子相互作用のばね定数を測定するために使用することができる。このプロトコルは、BFPによって検出された分子結合に対するばね定数分析を提示する。...

生体膜力プローブ分光法による分子ばね定数解析

変容成長因子ßファミリー前駆体タンパク質が ゼノプス・ラエビス...

ゼノプス・ラエビス胚の芽球に分泌される成長因子ßファミリー切断産物の分析

骨髄血管ニッチの in vitro モデルは、間葉系細胞および内皮細胞をプレキャスト3D...

イメージングマイクロプレート中のプレキャストポリ(エチレングリコール)(PEG)ヒドロゲルを用いた血管化骨形成骨髄ニッチの簡単な確立

自己組織化金属有機フレームワーク単分子膜の合成および特性評価のためのプロトコルは、ポリマーグラフトされた金属有機フレームワーク(MOF)結晶を使用して提供されます。この手順は、ポリマーグラフトされたMOF粒子が空気-水界面で自己組織化され、走査型電子顕微鏡イメージングによって証明されるように、整形成された自立した単層構造が得られることを示しています。...

高分子被覆粒子を用いた自己組織化有機金属フレームワーク単分子膜の合成と評価

学ぶBMP-2の共有結合固定法。自己組織化単分子膜を用いて表面に結合し、生物活性を保持します。抗体結合アッセイと細胞シグナル解析で検証可能な、骨形成因子研究の有用な手法です。

共有結合は、自己組織化単分子膜の手法を用いて表面上のBMP-2の結合

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