鳥類の消化器系を通過した後の感染プリオンを識別するための手順

この手順の全体的な目標は、アメリカカラスの消化器系を通る感染性PreOn物質の通過を記録することです。これは、最初に感染性PreOn材料でカラスを測定することによって達成されます。2番目のステップは、強制経口投与後4時間カラスの糞を収集し、マウスに注射する準備をすることです。

次に、マウスに1ミリリットルのカラスの糞便ホモジネートを腹腔内に接種します。最後のステップは、マウスがマウススクレイピーの臨床徴候を示すまで、マウスを毎日監視することです。最終的に、ウェスタンブロット分析を使用して、マウスモデルにおける感染性PreOnの存在を確認し、疾患の伝播を確認します。

カラスが移動できるという考え。CWDは、ある冬の日、捕獲されたヘラジカの施設に車で行き、そこで調査を行い、ロードキルのヘラジカがカラスに餌を与えられているのを見た後、その日の後半に、カラスがどこからともなく空から出てきて、これらの餌桶に着陸し、ヘラジカのすぐ隣で餌を食べ、ヘラジカが消費していた穀物に排便したときに、文献からの観察から多くのことが私たちのところに来ました。コロラド州全体でその夏、ワイオミング州はニューメキシコ州の集中地域で冬を過ごし、ニューメキシコ州のその地域は、いくつかのCABDが出現した場所であり、それは亀裂消耗病の震源地から数百マイル離れたところにあることが起こります。したがって、これらの2つの観察は、カラスがCWDを地形の周りで輸送する役割を果たしている可能性があると考えるようになりました。

誤った腹腔内および経口強制経口強制弁法は研究動物の死につながる可能性があるため、これらの技術の視覚的なデモンストレーションは重要です。まず、スクランブルエッグに青い染料を4滴加え、よく混ぜます。次に、5ミリリットルの染料と卵の混合物を2インチの強制針に引き込み、1人がカラスを優しく拘束します。

カラスのくちばしを喉の下が見えるほど大きく開き、強制針を慎重に食道に挿入します。呼吸の変化が見られる場合は、注射器を取り外して、気管に配置されている可能性があるため、再試行してください。強制針が食道にあることを確認したら、注射器の内容物をゆっくりと搾り出します。

青緑色の汚れた糞便が排泄されなくなるまで、30分ごとにカラスをチェックしてください。テスト用のカラスは、青く染まった糞便の排泄を止めるのに約4時間かかりました。次に、感染していないC 57ブラック6マウスの脳を1部、滅菌PBSとガラスビーズを4部に加え、バレットブレンダーに入れます。

ホモジナイザーは、滑らかな一貫性が達成されるまで、サンプルを1〜5分間均質化します。末期疾患のR ML Chandler株に感染したC 57ブラックシックスマウスの脳を使用してプロセスを繰り返します。次に、均質なものをGの3000倍で1分間遠心分離します。

より大きな粒子状物質を除去するため。次に、上清を取り除き、等量の滅菌済み 1 XPBS で希釈して、脳内物質の体積あたり 10% の重量を生成します。PBSでは、強制経口投与の17時間前に必要になるまで、サンプルを摂氏80度でマイナスに保管します。

カラスペンから食べ物を取り除きますが、水は取り除きません。カラスを治療グループにランダムに割り当て、2インチの強制針を使用して、5ミリリットルの溶かしたばかりの正常または感染したマウス脳ホモジネートで各カラスを経口強制経口投与します。次に、カラスを個々のケージに移します。

強制経口投与後4時間で各ケージ内のすべての糞便を収集してプールします。次に、ガラスビーズを使用した青い弾丸ホモジナイザーで、各カラスのプールされた糞便を均質化します。次に、混合物の500マイクロリットルを取り、滅菌PBS遠心分離機の9.5ミリリットル、15分間の希釈糞便ホモジネートで1〜20に希釈します。

Gを1, 300倍加えてから、上清を新しいチューブに移します。二次微生物感染の脅威を最小限に抑えるために、ホモジネート1ミリリットルあたり1ユニットのペニシリンと1マイクログラムのストレプトマイシンを追加します。.次に、3000MPのレーターでサンプルを70の電力設定で30秒間超音波処理し、残りの微生物の膜を破壊します。

まず、マウスをここに示されている 4 つのグループのいずれかにランダムに割り当てます。グループ1は感染したカラスの糞を受け取ります。グループ2は、感染していないカラスの糞を受け取ります。

グループ3は感染したマウスの脳を受け取り、グループ4は正常なマウスの脳を受け取ります。次に、MNグループ1と2については、スクレーピーポジティブまたはスクレーピーネガティブのカラスの糞便を1ミリリットル引き出します。マウスのグループ番号に応じて25ゲージの針を使用してホモジネートします。

次に、マウスの背側の首の毛皮を握りしめます。親指と人差し指を使用して、腹側を露出させるようにゆっくりと回転させます。マウスの後端を持ち上げて、頭が少し下がるようにします。

針を皮膚から1センチメートル、正中線の外側1センチメートル、仙腸関節の1〜2センチ前に挿入します。次に、わずかに引き戻して、均質なものをマウスの体腔にゆっくりと注入します。次に、凍結マウス脳ホモジネートをスクラップありとなしのホモジネートを調製し、グループ3および4の動物に注射します。

最初にホーズを滅菌PBSで混合物1〜10を希釈します。次に、希釈したスクレイピー陽性の脳ホモジネート1ミリリットルをグループ3のマウスに注入し、希釈したスクレーピーネガティブ脳ホモジネートの1ミリリットルをマウスに注入します。グループ4で。

マウスがスクレイピーの臨床徴候を示すまで、マウスを毎日監視します。臨床徴候には、後弯症、運動失調、尾のこわばり、身だしなみの欠如、衰弱、無気力などがあります。6つの臨床徴候のそれぞれについて私の毎日を採点します。

目に見える兆候が明らかな場合。ゼロは目に見える符号がないことを意味します。1 は中程度、2 つは符号の重度レベルに相当します。

各兆候の1日の合計スコアが8以上に達し、3日間または365日連続して6以上の1日で8以上に達した場合、マウスを安楽死させます。接種後、安楽死直後に脳を採取し、摂氏マイナス80度で保存します。次に、死骸を適切に処理して、不器用な診断を確認します。

凍結したマウスの脳を解凍し、均一な食感が得られるまで、ガラスビーズを使用したBlue Bulletホモジナイザーで個別に均質化します。次に、109.39マイクロリットルのPBSと12.5マイクロリットルの500ミリモルEDTAをpH 8で組み合わせ、3.1マイクロリットルの50マイクログラム/ミリリットルのプロテイナーゼK溶液を組み合わせて、125マイクロリットルのプロテイナーゼK消化液を調製します。次に、脳の17マイクロリットルに3マイクロリットルの消化液を追加します。ホモジネート。

サンプルを摂氏45度で、振とうのあるヒートブロックで30分間インキュベートします。インキュベーションが終了したら、8マイクロリットルのSDSページローディングバッファーを添加して消化液を不活性化し、サンプルを摂氏95度で5分間インキュベートします。次に、サンプルを 12%SDS ページに読み込みます。

ゲル電気泳動でタンパク質を電気泳動し、ゲルをIMON PVDF膜に移す 一度、PVDF膜をPBS中の5%脱脂乳でブロックし、20と岩石の間で0.2%で室温で1時間。次に、インキュベーション後、室温で1時間、スーパーブロックとロックで1〜20,000を希釈したセイヨウダイオスペルオキシダーゼに結合した224とIPRPモノクローナル抗体で膜をプローブします。膜をPBSで1時間洗い流し、0.2%で20の間

メンブレンを化学発光基質と5分間インキュベートすることにより、タンパク質を可視化します。次に、Gボックスゲルドキュメンテーションシステムでメンブレンをイメージングします。罹患マウスは、臨床マウスの擦り傷徴候の発現により同定され、ウェスタン血液分析により疾患確認が完了しました。

正常なマウス脳は、スクレイピーがなく均質で、ここでは左の2レーンで示されています。プロテアーゼKの助けがない場合とない場合の2つのレーンで、プロテアーゼKがない場合、3つの曲がりが見られます。しかし、正常なタンパク質はプロテイナーゼに感受性があるため、第2レーンでは曲がりは見られません。レーン3は、プロテアーゼ分解されたスクレイピーポジティブコントロールサンプルを示しています。

プロテアーゼは、タンパク質のn末端とc末端の喪失により、3つの元のバンドにシフトを引き起こします。しかし、感染したタンパク質は、正常な脳サンプルのように完全に消化することはできません。右図は、接種したカラスの糞便を接種したマウスの脳をプロテイナーゼKで消化したもので、バンドが消化されないため、サンプル中のプリオンの存在が確認されています。

このビデオを見れば、感染性プリオン物質がカラスの消化器系を通過する様子を記録する方法について、より深く理解することができます。その後、腹膜間マウスバイオアッセイで感染性を確認します。