モノクローナル抗体TG30およびGCTM-2を用いた細胞表面抗原の検出によるヒト胚性幹細胞の濃縮とパージ

この手順の全体的な目標は、ヒト胚性幹細胞サブセットを、TG 30およびGC TMの2つのモノクローナル抗体の細胞表面抗原結合によって選別することです。これは、最初にヒト胚性幹細胞またはHESC培養物を単一細胞懸濁液に解離させることによって達成されます。第2ステップでは、HESCをモノクローナル抗体TG30およびGCTM2で染色します。

最後に、細胞を蛍光活性化細胞選別によって分離し、培養に戻します。最終的に、選別された細胞のコロニー形成能力は、フローサイトメトリーと位相コントラスト顕微鏡によって評価できます。この手法の主なイメージは、目視観察などの既存の方法よりも優れている点として、多数の細胞に対して細胞ごとに客観的な多能性を測定し、これにより分化した細胞から胚性幹細胞を分離しやすく

この方法は、培養条件の変化がさまざまなヒト胚性幹細胞やヒト人工多能性幹細胞株に定量的にどのような影響を与えるかなど、多能性分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。今日、この手順を実演するのは、私の研究室の研究者であるGeorge Zoe Hun ChiとBay Wangで、培養されたHess細胞株を含む2つのT 75フラスコからHess培養培地を吸引することからヘス単一細胞懸濁液を作ることから始めます。各フラスコを10ミリリットルのDPBSで洗浄し、次に各培養物を3ミリリットルのトリプルE発現解離溶液(摂氏37度および5%CO2)でインキュベー

5分後、フラスコの側面をぶつけて細胞を取り除き、顕微鏡下で剥離を確認します。次に、滅菌された10ミリリットルのピペットを使用して、各フラスコに10ミリリットルの冷培養培地を追加します。解離した細胞をフラスコ壁に対して数回穏やかにトライレートして、主に単一細胞懸濁液を実現します。

次に、hesシングルセル懸濁液を70ミクロンのセルストレーナーを介して滅菌済みの50ミリリットルポリプロピレンチューブにプールし、Hess細胞表面抗原を染色します。まず、150マイクロリットルの培地に約100, 000個の細胞を6つの制御1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブのそれぞれに入れます。次に、コントロールチューブおよび残りのソートサンプルを目的の一次抗体と、アイソタイプコントロールを含む培地中でそれぞれ200マイクロリットルおよび約9ミリリットルの最終反応量でインキュベー

チューブを氷の上に水平に置き、ロッキングプラットフォームの上で30分間穏やかに混合します。細胞をスピンダウンした後、上清を捨て、ソーティングサンプルを20ミリリットルの冷培養培地で洗浄し、対照サンプルを200マイクロリットルの低温培地で洗浄します。次に、2.5 mLの最終容量でソートサンプルを適切な二次抗体と低温培養培地でインキュベートし、200 μLの最終容量のコントロールで、調製したばかりのPE抗US CD 90.2抗体をこの時点で適切なコントロールチューブに加えます。

もう一度、ロッキングプラットフォームの上で氷の上でチューブを水平に30分間静かに混合します。細胞をスピンダウンした後、ソーティングサンプルを20ミリリットルの冷培養培地に、コントロールを200マイクロリットルに再懸濁し、培地で細胞を2回洗浄します。ヨウ化プロピジウムを添加した2〜3ミリリットルの冷培養培地に選別サンプルを再懸濁し、未染色細胞を除く各コントロールを300マイクロリットルに

次に、5ミリリットルのポリスチレン丸底試験管に結合された35ミクロンの蓋細胞ストレーナーを介して個々の細胞懸濁液を濾し、チューブを遠心分離して、ストレーナーの蓋に残っている細胞懸濁液をチューブに押し込みます。次に、チューブの側面を軽くたたいて、各単一細胞懸濁液を再懸濁し、細胞を氷上に置きます。TG 30 GCTM 2 蛍光活性化セルソーティング用のフローサイトメーターをセットアップし、解離した Hess 細胞懸濁液を単一細胞としてゲートし、潜在的な凝集物やダブレットを排除します。

次に、前方散乱ゲートと側面散乱ゲートで潜在的な破片を取り除き、無傷のセルのみが選別されるようにします。次に、ヨウ化プロピジウムの発現に基づいて生存不能な細胞を除外します。マウス胚性線維芽細胞または覚せい剤フィーダー細胞を、マウスCD 90.2 peの発現に基づくネガティブセレクションによりゲートアウトします。

TG 30 G CTM 2 ネガティブ歩行を、未染色細胞のバックグラウンド自家蛍光とアイソタイプコントロールに応じて設定します。その後、メスフィーダーを含まない単離された生存可能なHESC画分は、最終的にTG 30、陰性GCT、M2、低、TG 30、中、TM、2、中、TG 30、高GCTM、2つの高亜集団に分画することができます。フローサイトメーターをセットアップした後、5ミリリットルのポリスチレン丸底試験管2本にそれぞれ1ミリリットルの覚せい剤コンディショニング培地を加え、氷の上に置きます。

次いで、分化したTG30陰性GCTM2個と多能性TG30高GCTMの2個の高細胞分画からそれぞれ400,000個の細胞を回収する。収集チューブをスピンダウンした後、各細胞ペレットを1ミリリットルの平衡化済みMEF馴化培地に懸濁します。次に、あらかじめ平衡化したMEF密度の3分の1のT75フラスコに、メスコンディショニング培地の各画分からHESCを1つ播種し、細胞培養物を摂氏37度、5%CO2でインキュベートし、培地を約2週間毎日リフレッシュします。

多能性TG 30高GCTMの2つの高細胞の培養は、1週間後にヒト幹様コロニーを示し、9〜11日で約80%coの流暢さに達します。TG 30陰性GC TMの培養物、2つの陰性細胞は、主に線維芽細胞のような細胞の芝生として成長し、11〜13日で共流暢さに達します。細胞表面抗原TG 30およびGC TM 2の複合検出により、幹細胞マーカーおよび系統特異的転写因子の発現によって示されるように、多能性段階および早期HESC分化のさまざまな段階で多数の細胞サブセットを識別でき、以前の報告と一致して、TG 30 GC TMは2つのネガティブロー、 ここでは、この研究に用いたヒト胚性幹細胞雄性1系統内で中部および高亜分画を区別することができ、TG30 GCTMの2フローサイトメトリー分析に典型的な異なるゲート亜集団の割合をここに示す実験で示している。

規定数のTG 30ネガティブGCT M 2ネガティブ細胞をソーティング後に約2週間連続培養し、その後、TG 30ネガティブGCT M 2ネガティブフラクションのみを回収してから再プレーティングを行いました。各継代において、結果は、最初のTG30陰性gct Mの2つの陰性部分分画が、連続的なパッケージング後にTG30陰性のGCT Mの2つの陰性分化細胞を濃縮することを示している。TG 30高GCT Mの2つの高細胞のマイナーな集団は、最初の継代で検出されますが、最終的には、さらなるパッケージングとともに消失し、多能性幹細胞を含まないサンプルのみが残ります。

ここでは、14日後の分化したTG30陰性GCTMの芝生の典型的な形態が示されている。14日後に見られる散発的なHESC様コロニーは、TG30陰性GC TMの2つの陰性細胞と混ざり合っており、これは汚染されたTG30高GCT Mの2つの高細胞によって生成される可能性が最も高いことに注意してください。これはめったに起こらないことであり、このアッセイを使用した以前の観察に基づく最初の事後事実の経過では、TG 30高GCTMの2つの高細胞の収集と培養により、コロニー形成多能性HSCが濃縮されることが期待されます。

そこで、これらの代表培養物において、フローサイトメトリーによる選別後の多能性TG30高GCTM2高細胞の連続パッケージングも検討し、TG30およびG CTM2個を用いて細胞をFAX選別し、各継代でTG30高GCTM 2個高細胞のみを置換した。このようにして、細胞の大部分が多能性に関連する部分画分に位置していることが観察され、これは、TG30陰性G CTMの2つの陰性細胞の小さな割合を分化および再生する能力も維持する多能性細胞の濃縮集団を示す。さらに、TG30高G、CTMの2つの高選別細胞の連続培養は、継代後も多数のHESC様コロニーを示し、また多能性状態の維持を示す。

この手順を試行する際は、この手順に従って結果の再現性を確保するために、毎回使用する前にファックス機を校正することを忘れないでください。マイクロアレイ、全ゲノムシーケンシング、奇形腫などの他の方法を実行して、これらの細胞が本当に多能性であるかなどの質問に答えることができます。この技術は、人工多能性幹細胞の分野の研究者が、ヒト胚性幹細胞と比較してこれらの細胞の安全性と安定性を探求する道を開きました。

このビデオを見た後、ペリート細胞を濃縮するために、ヒトenbr幹細胞の混合培養物を慎重に調製し染色する方法を十分に理解しているはずです。人間の細胞を扱う作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には、手袋を着用したり、安全キャビネットでクラス2で作業するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。