化学的に媒介種間相互作用を検出するための共培養を使用して

次の実験の全体的な目標は、分泌された化合物によって媒介され、細菌の遺伝子発現の変化につながるさまざまな微生物間の相互作用を特定することです。これは、寒天ペトリプレート上で環境微生物をコロニーとする蛍光転写レポーターを含む細菌株を培養することによって達成されます。オレンジ色の円は、環境微生物のコロニーを表しています。

青い円がレポーターのコロニーですが、固体培地で増殖すると、これらのコロニーが産生する代謝物が寒天を通じて拡散し、近くのレポーターコロニーで遺伝子発現を活性化します。ここで星で示されている潜在的なヒットは、レポーターの遺伝子発現を変化させる化合物を分泌している可能性のあるコロニーです。これらの生物は、共培養スクリーンプレートから単離されます。

これらの潜在的な誘導物質は、レポーターの細菌遺伝子発現を変化させる分子を分泌する生物であることを確認するために、二次スクリーニングで再試験されます。この方法は、微妙にバチルス菌と土壌生物とのバイオフィルム形成相互作用に関する洞察を提供しますが、ブドウ球菌またはシュードモナス菌種の病原性発現に影響を与える微生物相互作用などの他のシステムにも適用できます。確かに、それは理論的には、任意の遺伝的に扱いやすい微生物の任意のレポーターのための遺伝子発現を変更する微生物の相互作用を識別するために適用することができます 選択した生物のための蛍光レポーターコンストラクトを生成した後、テキストプロトコルに従って、ヘラを使用して土壌と円錐形のチューブを収集する前に、露出した表面土壌の上部0.5センチメートルを除去して土壌を収集します。 土壌1グラムあたり10ミリリットルの割合で0.85%滅菌生理食塩水を加えて土壌スラリーを作り、それを1分間渦巻いて土壌粒子からバクテリアを取り除きます。

土壌スラリーを1分間沈殿させた後、上部水層を新しいチューブに移し、テキストプロトコルに従ってレポーターと土壌サンプルを希釈し、レポーターコンストラクトを単独で活性化しない条件下で、共培養スクリーンプレートの中心にそれぞれ50マイクロリットルをスポットします。また、土壌サンプルのみとレポーターのみをコントロールとしてプレートします。各プレートに約23mmの滅菌ガラスビーズを加え、プレートをベンチトップに置いたまま前後に振って細胞を広げます。

液体が吸収されるまで回転させながら、プレートを裏返し、ビーズをエタノール入りのビーカーに捨てます。蛍光を使用して共培養プレートをインキュベートした後、プレートの上部から始めて、プレートを視野を横切ってゆっくりと前後に動かして明るいスポットにします。1回完全にスイープした後、プレートを90度回転させ、このプロセスを繰り返します。

蛍光スポットが検出されたら、明視野照明をゆっくりとオンにし、蛍光が細菌のコロニーに関連しているかどうかを判断します。推定誘導生物を単離すること、これは蛍光コロニーに近位の非蛍光コロニーになります。それらをフィールドの中央に配置します view 蛍光灯をつけたまま、利き手でアクセスできます。

ゆっくりとBrightfieldをオンにして、形状と位置で蛍光コロニーと周囲の誘導生物を識別します ガラス棒を使用して、滅菌済みの丸い200マイクロリットルのゲルローディングチップを手に取り、鉛筆のように保持します。外側の手のひらをステージに当てて、作業面で安定させます。次に、もう一方の手を手の内側の親指側に置いてピッキングツールを安定させ、ピペットの先端をプレート表面の上に保ちます。

それを視野内に移動し、選択するコロニーの中央に配置します。ヒントは焦点が合っていません。手の外縁を使って、ピペットの先端をゆっくりと回転させて、ピッキングするコロニーまで下げます。

ピッキングツールを回転させずに、先端が接触する他のコロニーの数を最小限に抑えようとして、非常に軽く触れます。新しいプレートの一部に先端を縞模様にします。コロニーをピッキングした後、アッセイガイドラインに従ってプレートをインキュベートします。

コロニーが見える場合は、ステレオスコープを使用して、プレート上で単一または複数の種類の生物が成長しているかどうかを判断します restreak 各morphoタイプを新しいプレートに載せ、成長するまでインキュベートします。推定誘導体が真の誘導因子であるかどうかをテストするには、レポーターの芝生と非蛍光性の親株を準備します。プレートが乾いたら、滅菌爪楊枝を使用してテストコロニーから細胞を選びます。

ブランクプレートにパッチを当ててから、2つの芝生プレートにパッチを当てます。あるいは、蘇生し、無菌プラスチック獣医の液体媒体の1ミリリットルに推定誘導生物を懸濁し、各懸濁液のODを正規化した後、懸濁液のOD600を測定して、0.5スポットのOD600に到達する、各懸濁液の1マイクロリットルを3つのプレートのそれぞれに。最後に、生物を成長させた後、解剖顕微鏡下で蛍光を使用して、蛍光レポーター株を活性化するが、親制御株を活性化しない推定誘導生物を同定します。

ここでのスクリーニングは、蛍光転写レポーターを使用して、バイオフィルムマトリックスの構造成分の遺伝子発現を変化させる化合物を分泌する土壌生物を同定するために使用されました。理想的には、各共培養プレートには、個々のコロニーの間隔が狭い土壌コロニーに対するレポーターの比率が1対1である必要があります。ここでは、レポーターコロニーの比率が青色の円で示されているのに対し、土壌のコロニーが茶色の円で示されているのに比べて、共培養プレートから実際に誘導する生物を特定する信頼性がどのように高まるかを示しています。

誘導する土壌生物は、レポーターを活性化する化合物を分泌します。複数のレポーターコロニーがプレート上に誘導され、レポーターと土壌の比率が高いため、星で示される他の推定誘導物質から赤で示されている真の誘導物質の同定が容易になります。栄養素含有量は成長コロニー形成の程度を制御し、接種の希釈は結果として生じるコロニーが適切に分散されるかどうかを決定します。

この共培養に見られるように、画像Bの微量は、土壌からの多数の微生物に応答して蛍光バイオフィルムマトリックスを生成します。調査した土壌では、Ptap A YFPマトリックスレポーターのヒット率が高かった。これは、類似のスクリーニングからの未発表の結果とは対照的です。

胞子形成と能力の報告者を使用して、ヒットはほとんどまたはまったく特定されませんでした。したがって、異なる細胞タイプのHIレートは非常に変動し、事前に予測するのが難しい場合があります。ここに示されているのは、誘導可能性のあるコロニーを単離する前と後の共培養スクリーンプレートの2つの例です。

パッチ法とスポット法の両方による陰性結果と陽性結果をここに示し、二次スクリーニングで調査したコロニーの約50%が真陽性です。この手順に続いて、他の方法、例えば、誘導生物の系統発生的同一性を決定するための16 s SR DNAシーケンシング、またはNMRにおけるHPLC質量分析を使用して活性化合物の化学的同一性を決定するための他の方法を実行することができます。