マウス大動脈洞におけるアテローム性動脈硬化症の病変の定量分析とキャラクタリゼーション

この手順の全体的な目標は、MI大動脈洞のアテローム性動脈硬化性病変を特徴付け、定量化することです。これは、最初に抽出した心臓を解剖して、頂端部分を分離し、大動脈洞を特定することによって達成されます。次に、心臓の加工された頂端部分でパラフィンブロックを調製します。

次に、大動脈洞を切片化し、スライドに取り付けます。最後に、組織切片を染色します。最終的には、組織化学的および免疫組織化学的分析を通じて、アテローム性動脈硬化性病変のさまざまなサイズと組成を示す結果を得ることができます。

その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるダニエル・ベンガ・ペナルです。マクマスター大学動物研究倫理委員会は、LDLRダブルネガティブマウスを麻酔し、血液を抽出し、安楽死させて固定した後、テキストプロトコルに従って心臓を分離した後、ここに記載されているすべての手順を事前に承認しました。メスを使用して、上行大動脈に垂直な心臓に横方向の切り傷を付けます。心臓の頂端部または上部を埋め込みカセットに入れ、Forminに沈めます。.

次に、カセットをティッシュプロセッサーに入れ、一晩処理します。組織型用のテキストプロトコルに概説されているプログラムを使用して、パラフィンワックスを摂氏62度で一晩溶かします。各プロセス組織を深い組織型に入れ、心臓の界面が型の基部に触れていることを確認してから、溶融したパラフィンワックスを注ぎ、型を完全に満たします。

ラベル付きのプラスチックカセットを使用して金型を覆います。氷上または冷たい表面で型を冷却した後、ブロックを型から分離して大動脈を切断します。ブロックをミクロトームの検体ホルダーに配置し、内側から心臓の上部に向かって切片にすることができます。

ミクロトームを10ミクロンに調整し、心臓を切片にします。スライドガラス上の切片を採取し、光学顕微鏡で観察して位置と向きを決定します。洞は、リーフレットが取り付けられた3つの二部弁基部として表示されるはずです。

大動脈洞の弁が1つまたは2つ明らかになったら、必要に応じてブロックの角度を調整します。バルブに到達したら、ミクロトームを調整して4〜5ミクロンをカットします。最初の 10 個のセクションをそれぞれ個々のスライドガラスの上部に取り付け、その後の 10 個のセクションの各グループを次の位置に配置します。

スライド上。アテローム性動脈硬化病変が観察されなくなるまで、切片を収集し続けます。ヘマチンとエオインで切片を染色して病変を視覚化するには、スライドをエアドライヤーに8分間入れます。

次に、キシレンを使用してセクションを3分間ずつ4回洗浄します。スライドを100%エタノールで3回、それぞれ3分間洗浄します。次に、70%エタノールと50%エタノール。

3回ずつ、それぞれ3分間。蒸留水を使用してスライドをすすぎ、浸します。MAのヘマチンを15分間

洗って走らせます。水道水を5分間。次に、エオインYに1〜5分間浸した後、水を洗浄して5分間蒸留します。

水を5分間ずつ3回洗浄し、蒸留水を50%エタノールを2分間ずつ2回洗浄します。次に、70%エタノールを各洗浄で2分間3回、100%エタノールを洗浄します。

各2分間を3回。次に、キシレンを4回、それぞれ2分間洗浄します。キシレンベースの封入剤を使用して切片をマウントし、光学顕微鏡で画像を撮影します。

大動脈洞から特定の距離で40〜50ミクロン間隔で決定できる病変を同定および定量化するためにイメージングソフトウェアを使用すると、セクションの厚さに応じて、免疫組織化学的および免疫蛍光染色のテキストプロトコルを参照してください。生後5週間のLDLR。陽性マウスには、ここに示すように心臓を固定、分離、および切片化する前に、標準食または高脂肪食を10週間与えました。

マウスに標準的なチャウ食を与えた場合、アテローム性動脈硬化症の発症は非常に限られており、8週のうち15週では検出できない場合があります。高脂肪食は、このモデルでアテローム発生を大幅に加速し、慢性の非細胞コアと線維性キャップを含む大きな進行性病変の形成を誘導します。アテローム性動脈硬化性病変は、病変の発生段階を定義する特定の細胞型および因子の存在を染色することによってさらに特徴付けることができる。

単球の内膜への浸潤は、アテローム発生の内膜の最も初期のイベントの1つを表しています。単球は、細胞の破片や脂質を飲み込むマクロファージに分化します。泡沫細胞として知られる脂質充血マクロファージは、ここで見られる動脈壁に脂肪の筋を作成します。

マクロファージ泡沫細胞は、F 4、80、MAC 3などの特定のマクロファージマーカーに対する抗体で染色することにより、病変発生のすべての段階で検出できます。血管平滑筋細胞またはv SMCは、健康な動脈の内側層に限定されています。VSCは、進行性病変の発生中に内膜内で移動および増殖するように誘導されます。

このパネルに見られるように、V SMCは、その開発後にアルファアクチンに対する抗体で染色することにより同定することができる。この技術は、心血管疾患の分野の研究者が桿体におけるアテローム性動脈硬化病変の発症と進行を探求するための道を歩むことになりました。