人間の細胞に基づく、血液脳関門の接触モデルの作製のための改善された方法

この手順では、多孔性メンブレンの両面にアストロサイトと血管内皮細胞を共培養することにより、血液脳関門をin vitroでシミュレーションすることを目的としています。まず、多孔性メンブレンの内腔側に細胞外マトリックスをコーティングします。コラーゲンなどのタンパク質を用い、外側にシリコンチューブ、内側にシリコンプラグを装着してインサートを反転させることで、メンブレンの外腔側の上に取り外し可能なウェルを作成します。

次に、アストロサイト細胞を逆向きのインサートに播種し、外腔側に接着させます。その後、チューブを取り除き、インサートを通常向きに戻して、培地を満たしたウェルに入れます。続いて、インサートの内腔側に内皮細胞を播種し、対向するアストロサイトと共培養します。

最終的に、蛍光トレーサーの透過性を確認するか、経内皮電気抵抗（TEER）を測定することで、さまざまな刺激剤に反応したin vitro BBBの透過性の変化を測定します。この手順の実演を行うのは、私の研究室のポストドクターであるBarry Nigo氏です。彼は博士課程において、血液脳関門を模倣するために我々が使用しているこの改良型播種プロトコルを開発しました。もともと、より簡易的な播種方法を試した際、ポアからの培地の漏出や培地量の少なさに非常に苦慮したことから、この手法を考案しました。

これにより、アストロサイトの定着期間が短く不十分となり、我々の手順ではこの問題の解決に取り組んでいます。組織培養用インサートを24ウェルプレートのウェルに配置します。次に、インサートの内腔面をコーティングするため、132 µg/mLのラットコラーゲンIを50 µL添加し、残留酸を除去するために、加湿された37 °Cのインクリベーターで一晩インキュベートします。その後、インサートの外腔面と内腔面の両方を二回蒸留水で洗浄します。

次に、インサートを反転させ、多孔質膜の縁に短い弾性シリコンチューブを緩やかに装着させます。これにより、実質的に外膜側の表面の上に新しいウェルを作成します。そして、下面を密封します。

片端に0.2 mL PCRチューブの切断した先端を密封したシリコンチューブ製のプラグを用意します。次に、滅菌鉗子を使用して、シリコンプラグを管腔腔内に挿入し、膜から約1～2 mmの距離に達するまで進めます。続いて、維持培地200 µLに懸濁した40,000個のアストロサイトを、外膜表面上のシリコンウェル内に直接播種します。

アストロサイトの接着状態をモニタリングするために、6.5 mmのインサートと同じ表面積を持ち、位相差顕微鏡による細胞の視覚化がより容易な標準的な96ウェルプレートを使用します。アストロサイト細胞懸濁液を同量、96ウェルプレートの8つのウェルに播種します。これを経時的に観察し、96ウェルプレート内、およびひいてはインサート膜内のアストロサイトが、無菌状態を維持するのに十分な接着を得た時点を決定します。

未ろ過の空気への曝露を最小限に抑えるため、組み立てたインサートを2枚の6ウェルプレートで挟んで搬送します。アストロサイトを接着させるため、細胞をインキュベーターに入れます。同時に、コントロール用の96ウェルプレートもインキュベーターに入れてください。

約4時間後、コントロールの96ウェルを確認し、アストロサイトが付着しているかを確認します。付着が確認されたら、インサートアセンブリを組織培養フードに戻します。外側のシリコンチューブとプラグをゆっくりと取り除きます。

次に、インサートを通常の上向きの向きに戻し、1ウェルあたり800 µLの血管内皮細胞維持培地が入ったウェルに配置します。20,000個の脳血管内皮細胞を200 µLでコラーゲンコートされた管腔面へ播種し、培地交換なしでBEC培地を用いて3日間共培養します。その後、実験に供します。

後で使用するために、シリコンチューブとプラグをエタノールで洗浄した後、オートクレーブで滅菌します。in vitro 血液脳関門を刺激するには、まず、外腔側および内腔側の培地を、それぞれ 600 µL および 100 µL の無血清 BECs 培地に交換します。内腔側の洗浄液を吸引し、刺激剤を含む無血清培地 100 µL と交換します。

アストロサイト画分からin vitro BBBを誘導する場合、アブルミナール側（外側）の培地を吸引し、刺激剤を含む600 µLの無血清培地と交換します。ヒト接触型血液脳関門モデルを構築するため、ラベル化トレーサーを用いた標準的なパラセルラー（細胞間）またはトランスセルラー（細胞内）透過性アッセイを継続します。ヒト不死化アストロサイトおよび脳血管内皮細胞は、アストロサイトの足突起が内皮細胞に接触できるよう、3 µmの孔径を持つ多孔質メンブレン上で培養されます。

この手法により、アストロサイトとBECの最適な連続播種期間が確保され、その結果、細胞の脱落を最小限に抑えつつ多孔質表面に強固に接着し、播種から3日後には共流動的に増殖しました。両細胞種は、多孔質膜上で細胞特異的なマーカーを維持しており、これはSVGにおけるグリア・フィブリラリー・アシッド・プロテイン（GFAP）およびNECにおけるフォン・ヴィレブランド因子（VWF）の発現パターンによって示されています。

コンタクトBBBモデルの最も基本的な特徴と一致して、アストロサイトNFEは3ミクロンの孔を通って管腔側コンパートメントに移行することができます。したがって、このサイズの孔に位置するSVGとBESの間には、潜在的にコンタクトが存在し得ます。さらに、SEMイメージングにより、SVGとBBCがメンブレンの孔の上に直接成長することが可能であることが示されました。この現象は、in vitro BBBコンタクトモデルの物理的バリア機能に人為的に寄与します。

本研究では、ヒト接触血液脳関門（BBB）モデルを用いて、BＢBに対する組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA）というフィブリン溶解剤の影響を検討しました。これらのin vitro研究により、tPAが、薬理学的に妥当な範囲内の濃度および時間依存的な方法で、完全なBBBの透過性を実際に増加させることが確認されました。tPAへの曝露後、多孔性膜上のSVGアストロサイトに劇的な形態変化が見られたことから、tPAに対するアストロサイトの反応がtPA誘発性のBBB開口の根拠となっていることが示唆されました。

この手法は、脳卒中患者の血栓溶解に用いられるt-PAという血栓溶解薬に対して血液脳関門がどのように反応するかを調査することを目的とした我々の研究において、重要な役割を果たしました。本手法を文献で示したのはこれが初めてであり、他の研究者が各自の目的に合わせてこの手法を採用することを期待しています。