短いペプチドの自己組織化によって順序付け生体分子構造の形成

この手順の全体的な目標は、生体分子ネックレスの形でペプチドベースのアセンブリを生成することです。これは、まず、ジフェニルアラニンとそのバッハ保護アナログを適切な量のHFPに別々に溶解し、最終濃度100ミリグラム/ミリリットルまで溶解することにより、ストック溶液を調製することによって達成されます。第2のステップは、10マイクロリットルのジフェニルアラニンペプチド溶液と6マイクロリットルのバッハ保護ジフェニルアラニンペプチド溶液を混合することにより、ペプチドストック溶液を5対3の比率でブレンドすることです。

次に、新たに調製した50%エタノールにブレンドしたペプチド原液を添加して、最終濃度がそれぞれジフェニルアラニン1ミリリットルあたり5ミリグラム、バッハ保護ジフェニルアラニン1ミリリットルあたり3ミリグラムとなる。効果的に、最終的には走査型電子顕微鏡を使用して、2つのペプチドによって共に組み立てられた生体分子ネックレスを示します。ここで示したような自己組織化のプロセスを使用する主な利点は、自発的な進行により、複雑な構造を生成することが可能であることです。

ここでのインビトロは、ペプチドの自己組織化を表し、具体的には、この手順を示すジペプチドの共集合は、大学院生の元研究室であるヌランになります。ジフェニルアラニンを管状構造に自己組織化する手順を開始するには、ジフェニルアラニンペプチドをHFPに溶解することにより、1ミリグラム/ミリリットルのペプチドストック溶液を調製します。溶液の均一性を確保するために、ボルテックスミキサーで数秒間混合し、ペプチドが完全に溶解して溶液が透明になるまでベンチに数分間置いておきます。

ペプチドストック溶液を三重蒸留水で最終濃度2ミリグラム/ミリリットルに希釈します。溶液を室温で24時間保管します。コアセンブル手順では、2ミリグラムのジフェニルアラニンペプチドと1ミリグラムのバッハ保護ジフェニルアラニンペプチドをHFPで別々に溶解し、1ミリグラムあたり100ミリグラム/ミリリットルの濃度にしました。

次に、溶液をボルテックスミキサーで数秒間混合し、ペプチドが完全に溶解して溶液が透明になるまでベンチに数分間置いておきます。10マイクロリットルのジフェニルアラニンペプチド溶液と6マイクロリットルのバッハ保護ジフェニルアラニンペプチド溶液を混合することにより、ペプチドストック溶液を5対3の比率でブレンドします。次に、ボルテックスミキサーを使用して溶液を混合します。

これに続いて、新たに調製した50%エタノールの92マイクロリットルに8マイクロリットルのブレンドペプチドストック溶液を加えて、ジフェニルアラニンの場合は1ミリリットルあたり5ミリグラム、1ミリリットルあたり3ミリグラムの最終濃度を得る。バッハのためにジフェニルアラニンを保護しました。ピペットを使用して溶液を穏やかに混合します。

室温で24時間インキュベートした後、ガラスカバースリップにペプチド溶液を10マイクロリットル滴下し、室温で乾燥させます。ガラスカバースリップにサンプルを金の薄い層でスパッタローターを使用して90秒間コーティングします。終了したら、10〜20キロボルトで動作するSEMを使用してアセンブリを画像化します。

TEM分析では、カーボンで覆われ、ポリマーフィルム支持体で安定化された200メッシュの銅グリッド上に10マイクロリットルのペプチド溶液を滴下します。1分後、濾紙を使用して余分な液体を取り除きます。次に、2%酢酸小便器溶液をシリンジに移し、ゼロポイント22マイクロメートルフィルターユニットを使用してろ過します。

サンプルに留まるには、10マイクロリットルの小便器用アセテート溶液をグリッド上に置きます。30秒後、濾紙を使用して余分な液体を取り除き、120キロボルトで動作するTEMによってグリッド上のサンプルを画像化します。FTIR分析では、30マイクロリットルのペプチド溶液をフッ化カルシウムウィンドウに適用します。

FTIRスペクトルの水シグナルを抑制するために、溶液を室温で乾燥させます。乾燥ペプチドサンプルに酸化重水素を一滴垂らします。サンプルを真空下乾燥剤で乾燥させた後、水素から重水素への交換が最大になるように、前の手順を2回繰り返します。

最後に、重水素化トリグリシン硫酸検出器を使用してFTIRスペクトルを記録します。装置に付属のソフトウェアを使用して透過率の最小値を決定し、ペプチドの自己組織化による秩序構造の形成を実証します。2つの単純な芳香族ペプチドの共集合体を調製し、SEMおよびTEM分析を使用して特性評価しました。

ブレンドされたペプチドは、そのひもを打つための形態の類似性が高いため、直径数百ナノメートルの細長い構造によって接続された直径数ミクロンの球状集合体の構造を形成しました。これらの構造は分子ネックレスと呼ばれます。これらの構造のFM分析は、それらの3次元配置を明確に示しています。

さらに、さまざまなサンプルのさまざまな領域のSEM分析は、このプロセスが高収率で発生したことを示しています。FTIR分析は、ペプチド集合体の二次構造に関する情報を提供します。アミドの吸収スペクトル。

エタノール中のバッハ保護ジフェニルアラニンペプチドによって形成された球状集合体の1つのバンドは、アルファヘリックスの確認を示す1,657逆センチメートルで単一のアミドピークを示した。エタノール中のジフェニルアラニンペプチドによって形成される管状構造は、1,613逆センチメートルと1,682逆センチメートルの2つの特徴的なピークを示し、ベータシートの二次構造と相関しています。2 つのペプチドの共集合体によって形成される生体分子ネックレスの FTIR スペクトルは、個々のペプチドのピーク割り当てから延期されます。

1, 653逆センチメートルの最初のピークはアルファヘリックス構造に対応し、1, 684逆センチメートルの2番目のピークはベータターンの確認に関連しています。さまざまなスペクトルの違いは、生体分子ネックレスのユニークな構造を示しています。このビデオを見れば、色素ペプチドによるペプチドベースのアセンブリの生成方法についてよく理解できるはずです。

この方法は、複雑な構造を形成するために、他の生体分子に容易に適用できます。有機溶剤を持って歩くと非常に危険であることを忘れないでください。手袋。この手順を実行するときは、常に白衣と安全メガネを着用する必要があります。