Name: 初代ヒト骨髄およびその悪性腫瘍を研究する三次元組織培養モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 学ぶ 初代ヒト骨髄細胞の三次元組織培養モデル。骨髄マトリックスを用いて生理的微小環境を再現し、細胞の可視化や下流解析を可能にする。造血機能研究に有用です。

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この作品は、健康、国立がん研究所（1R21CA141039）、BDバイオサイエンス研究助成賞、がんパデュー大学センター米国癌協会の制度研究助成（IRG＃58-006-53）、国立研究所からの補助金によって賄われていた研究、健康研究およびアルバータがん会研究イニシアティブプログラムのカナダの協会。 MPは、国立衛生研究所、国立がん研究所、がん予防インターンシッププログラムによってサポートされていました（R25CA128770、PI：D. Teegarden）腫瘍学科学総合研究センターとパデュー大学のディスカバリー·ラーニング研究所で投与。

1。事前準備<ol><li> 4℃で滅菌した血清学的ピペットおよびピペットチップを保つ トラブルシューティング：室温（RT）でマトリゲルゲル、寒ピペット·チップを使用して、培養セットアップ時にゲル化マトリゲルを防ぐことができます。 </li><li> 4℃で一晩マトリゲルの瓶を解凍する。 </li></ol> 2。試薬の調製<ol><li>フィブロネクチンのストック溶液の調製：100mlの蒸留水に100mgのヒトフィブロネクチンを溶解することによってフィブロネクチンの1 mg / mlのストック溶液を作る。 6ヶ月まで4℃でのフィブロネクチンが溶解したら、滅菌フィルター、分量、店舗。 トラブルシューティング：フィブロネクチンは、迅速に溶解37℃の水浴セット内の数分間溶液をインキュベートしていない場合</li><li> 10×PBSの調製：80gの塩化ナトリウムのNaCl、14.4グラムのNa 2 HPO 4、2gのKClおよび2.4グラムのKH 2 POを溶解<suB&gt;蒸留水1Lに4。 7.4、滅菌フィルターにpHを設定し、6ヶ月まで4℃で保存する。 </li><li>中和緩衝液20の調製：1 M HEPESおよび10×PBS原液を使用して、2×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で100mMのHEPESを含有する溶液を作る。 7.0に溶液のpHを調整します。 2〜3ヶ月、4℃で保存してください。 </li><li>ラット尾コラーゲンタイプの2 mg / mlの溶液の調製は、I：中和バッファー（ステップ2.3）中の2 mg / mlのコラーゲンI溶液を加えます。低速でのソリューションをボルテックスし、上下にピペッティングにより穏やかに混合。このコラーゲンは非常に粘性であるため、ピペッティングしながら、気泡の発生を避ける。これは、新鮮なたびに、コラーゲンI溶液を調製することが推奨される。使用するまで氷上で溶液を準備しておく。 </li><li>骨内膜コーティング（引き裂く）の調製：1X＆で、それぞれ77μg/ mlのおよび29μg/ mlの、最終濃度を2 mg / mlのコラーゲンIストック（2.1および2.4ステップ）で1 mg / mlのフィブロネクチン株式ミックス＃160;滅菌PBS。混合し、1ヶ月まで4℃で保存する。 </li><li>再構築された骨基質（RBM）の調製： <ol><li>氷上の予冷1.5mlのマイクロチューブ。常時氷上すべてのマトリックス溶液を保管してください。 </li><li> 4部マトリゲル（マトリゲル濃度はロットごとに異なりますが、変動は無視できる程度であることが判明した）、1 mg / mlのフィブロネクチンの2.5部と第ペッティングマトリゲルによる氷上で2 mg / mlのコラーゲンIへの1の部分をミックスフィブロネクチンとコラーゲンIをマトリゲルを追加し、コールドピペットチップを使用して、管を4℃以上の温度で固化し始めるので、マトリゲルピペッティングしながら、すぐに動作します。気泡を導入しないよう、上下にピペッティングによって、非常に静かに行列を混ぜる。 RBMを混合しながら氷上でチューブを保持します。 </li></ol></li><li>骨髄増殖培地（BMGM）の調製：6.2×10 -4 MのCaCl 2、10 -6 Mコハク酸ナトリウム、10 -6 Mヒドロコルチゾン、20％ヒト血漿（BMGM含有する500mlのを作る正常または健常ドナーまたは患者から採取悪性）、およびRPMI-1640中の1％のペニシリン/ストレプトマイシン。のCaCl 2、コハク酸ナトリウム、ヒドロコルチゾン及びサプリメントは、1,000倍のストック溶液として&gt; 6ヶ月間-80℃で保存することができる。細胞株を成長させる際に、ウシ胎児血清（FBS）は、ヒト血漿の代わりに用いることができる。 </li><li> 10％中性緩衝ホルマリン（NBF）の調製：10％容量/ vのPBSで1Xを、37％ホルムアルデヒドストック溶液を追加よく混合し、光から保護し、2〜3週間、室温で保管してください。 </li><li> 1％ウシ血清アルブミン（BSA）の調製：BSAの適量を秤量し、1×PBSに溶かし。 4℃で保存し、1週間以内に使用しています。 BSA溶液は、より長い期間にわたって冷蔵した場合汚染さ傾向がある。あるいは、BSA溶液を等分し、長期保存のために-20℃で凍結することができる。凍結融解を避ける。 </li><li>細胞回収液（CRS）の調製：5mMのEDTA、1mMのバナジン酸ナトリウムせ（Naを&lt;メイク1×PBS中にサブ&gt; 3 VO 4）および1.5mMのフッ化ナトリウム（NaFの）溶液。 6ヶ月まで4℃で滅菌フィルターや店舗。 </li></ol> 3。非悪性および悪性のヒトBM細胞の組み込み3次元培養<ol><li>製造業者の説明書に従って、フィコール - プラーク勾配遠心分離により、一次BM単核細胞を精製する。 オプションのステップ ：細胞は、培養期間を通して細胞増殖を追跡する製造業者の指示につき0.25μMカルボキシフルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステル（CFSE）で標識することができる。 トラブルシューティング：細胞はCFSE染色後に死亡した場合は濃度が細胞の種類に依存するため、CFSEの量を滴定、0.25μMのは、一次骨髄単核細胞に適しています。 </li><li> 48ウェル組織培養処理プレートの各ウェルにREND液65μlを加える。ウェルの全面を覆うように均等にソリューションを広げ、&gt; 30インキュベートRTで分。 </li><li> 48ウェルプレートのウェルあたり1×PBSを10μlの0.5×10 6細胞の密度で細胞懸濁液を準備します。 1.5 mlのマイクロ遠心チューブにウェルあたりRBM行列100μlの細胞懸濁液を混ぜる。優しく上下にピペッティングにより細胞やRBM行列を混ぜ、泡を導入することを避ける。マトリックスのゲル化を防ぐために氷の上で、細胞/マトリックス混合物を保管してください。 注意：RBMシステムは完全にスケーラブルであり、非48ウェルフォーマットにシステムを設定するために、使用されるプレートの表面積に基づいてすべての試薬 ​​（行列や培地）の量を調整します。それに応じてめっきされる細胞の数をスケール。 </li><li>残りRENDを吸引し、ウェルの中央に、細胞/マトリックス混合物を追加します。すぐに、均一にウェルの表面全体を覆​​うように、細胞/マトリックス混合物を広げた。 37°Cで30〜60分間プレートを置き、5％CO 2組織培養インキュベータマトリックスを固化することを可能にする。振ったり、DISしないでくださいインキュベーション中、プレートをTURB。 トラブルシューティング：めっき前によく混ぜ、RBMのセルの偏在を防ぐため。すべての5の目だけでなく、チューブの底にセトリング細胞を避けるために、メッキ後に混ぜる。一度メッキ、細胞がマトリックスに表面張力により井戸の底に沈むしないでください。 トラブルシューティング：、RBMのセルの偏在を防ぐメッキによく前にミックスする。よくチューブの底にセトリング細胞を避けるために、メッキごとに5 回目の後に混ぜる。一度メッキ、細胞がマトリックスに表面張力により井戸の底に沈むしないでください。 </li><li> 37℃に設定した水浴中で予熱しBMGM </li><li> 30分後、行列が適切に設定されていることを確認してください、それはプレートが傾いたときに移動しない層のような柔らかいゲルを形成する。暖かいBMGM 1mlで細胞/マトリックス層を重ねる。非常にゆっくりと行列ピペット媒体の引き裂きを回避するために使用して（滴ずつ分注）血清学的ピペット。 37℃で、所望の時間のために、5％のCO 2組織培養インキュベーターや文化に組み立てRBM文化を置きます。 注：細胞生存率は、培地を交換せずに少なくとも30日間維持され、培地交換が必要な場合にのみたびに、培地の50％を変更する。 重要なステップ：それは冷たい温度が既に設定されている行列を乱す可能性があるため媒体が冷えていないことが重要です。それは柔らかいマトリックス層を壊すかもしれないで、マトリックスの上にメディアを噴出しないように注意してください。 トラブルシューティング：RBMシステムにおける細胞生存率が低い場合、細胞密度は、BM吸引液からの一次単核細胞以外の細胞を操作するときに実験的に決定されなければならない。細胞株を操作する場合、不死化細胞株は、初代細胞よりも速く増殖するように、細胞数を10倍減少させる。 </li></ol> 4。 「イン行列 &#39;イメージング<ol><li><strong&gt;光学顕微鏡<ol><li>明視野画像を用いて直接RBMで培養された細胞、微分干渉コントラスト（DIC）、共焦点又はマトリックスは、約1mmの厚さであるように、長距離の撮像を可能に任意の他の撮像技術。上から下まで全体の文化イメージに顕微鏡の多くで利用可能なzスタック機能を使用します。 </li></ol></li><li> 免疫蛍光染色 ヒント：以下の免疫染色プロトコルは染色/洗浄溶液を吸引しないようには、代わりにプレートを傾け、ピペットを用いてソリューションを削除します。 <ol><li>ピペットを使用してBMGMを削除し、RT 1XのPBSを100μl/洗浄/ウェルで2〜3倍を洗う。十分なPBSをウェルの表面全体をカバーするために使用されていることを確認してください。 </li><li>室温で15分間10％のNBFの（48ウェルプレート用）100μl/ウェルを添加することにより、マトリックス内の細胞を固定。 NBFを削除して、RT 1XのPBSを100μl/洗浄/ウェルで細胞を2回洗浄します。 ノート：それは、マトリックスを液化可能性がある冷たいNBFの使用は避けてください。 </li><li> PBSを除去する、抗体の非特異的結合をブロックするために室温で一晩又は4℃で1時間、1％BSAを加える。 </li><li>必要な希釈で、1％BSA中の一次抗体溶液を準備します。希釈は、メーカーに確認するか、最適な抗体濃度を決定するために滴定、各抗体ごとに異なります。一次抗体溶液100μL/ウェルを添加し、製造業者の指示に従ってインキュベートする。 重要なステップ：蛍光団または蛍光色素に結合させた抗体を含む全てのインキュベーションは、暗闇の中で行われるべきである。 </li><li>一次抗体溶液を除去し、5分間×PBSで3回洗浄します。 </li><li>間接免疫蛍光染色のために、室温で1時間の蛍光プローブに結合させた二次抗体とインキュベートします。製造元が推奨する濃度で、1％BSA中で抗体を希釈する。 </li><li>二次Aを削除ntibody液と5分間×PBSで3回洗浄します。 トラブルシューティング：高いバックグラウンドを回避するために撮像中に、蛍光結合二次抗体を滴定し、十分な信号を提供し、最も低い濃度を使用しています。高いバックグラウンドがまだ問題になる場合は、洗浄工程の数と期間を増やすか、直接結合一次抗体を使用して、ステップ4.2.6をスキップします。 </li><li>核は、製造業者によって示唆さの希釈率で、 &#39;、6 - ジアミジノ2 - フェニルインドール（DAPI）核染色溶液を4染色を追加し、室温で7-10分間インキュベートする。 </li><li>核染色溶液を除去し、5分間1X PBSで2回洗う。 </li><li>最後の洗浄から、PBSを削除し、蛍光を維持するために試料上に、封入剤の滴（正規集合）を追加します。蛍光または共焦点顕微鏡上で適切な励起/発光の設定を使用してイメージ。 注：画像は、染色の2日以内に行われるべきであるマトリックス及びRBMの完全性と蛍光シグナルが失われるの劣化を回避することができる。すぐに画像化されていない場合は、染色されたサンプルが撮像されるまで、光から保護し、4℃で維持されるべきである。 </li></ol></li></ol> 5。 RBMから細胞を分離<ol><li>マトリックス層を乱すことなく静かに培地を除去します。吸引しないでください。 </li><li>洗浄細胞は、滅菌1×PBSで2倍。吸引しないでください。 </li><li>各ウェルに氷冷したCRSの0.5ミリリットルを追加し、激しく上下にピペッティングにより、細胞と一緒に行列全体の層を除去する。 1.5 mlのマイクロ遠心チューブ内の細胞、マトリックス、およびCRSを収集します。氷の上に置きます。 </li><li>同じウェルに追加の0.5ミリリットル、CRSを追加し、すべての残りの材料を集める。同じマイクロ遠心チューブに移します。 </li><li>渦細胞、マトリックス、およびCRSの混合物と1時間、氷上でインキュベートする。渦細胞は15分毎に、マトリックスからの放出を容易にする。 </li><li> 1時間後、目に見える塊の後に混合物を確認してください行列の存在すべきである。 トラブルシューティング：行列の塊が1時間後に観察される場合は、より大きなチューブに転送細胞/マトリックス/ CRSの混合物、CRSの追加の2〜5ミリリットルを追加し、さらに30〜60分間インキュベートする。 </li><li> 4℃で5〜10分間、1,000 rpmで、CRSでの遠心細胞上清を除去し、冷たい1×1mlのPBSに細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li> 5〜10分間1,000 rpmで遠心分離し、上清を除去します。 PBS洗浄をもう一度繰り返します。 </li><li>第PBS洗浄等は、 インビボ移植において 、フローサイトメトリー、マトリックスおよび単離された細胞からの細胞の回復は、このようなDNA / RNA /タンパク質の単離などの任意の下流の適用のために使用することができる完了する。 </li></ol>

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著者らは、競合する利害を宣言していません。

RBMモデルは、BMの細胞組成物は、最大30日間、ex vivoで維持される総合的なシステムを提供しています。その機能が密接に生体内で見つかったBMアーキテクチャを模倣に従ってRBM自己層別化で成長させた骨髄細胞。さらに、これは多発性骨髄腫クローン8の膨張を可能にする最初のシステムである。 BM細胞の力強い成長と文化の全体的な成功を確保するための最も重要なステップは次のとおりです。1）&gt; 70％の生存率と赤​​血球の大部分は自由にBM細胞の健康な集団を得るために、2）を確保することマトリックス成分を十分に混合し、細胞がマトリックス全体に均一に分布している、3）増殖培地がシステムに追加されたときにマトリックスに損傷を与えないように注意することれる。悪性細胞増殖のロバスト性を確保するために、増殖培地を細胞培養されている患者の診断と一致するヒト血漿を補充すべきである。 O認められたRBMシステムのアフィン制約は、BM間質区画せずにCD34 +造血幹細胞、CD20 + B細胞およびCD138 +形質細胞の精製された集団をサポートすることができないことである。 <p cla...

組織培養は、無傷の生物において各種の処理を比較するとき、全身の変動を最小限に抑えるために制御された環境における細胞の挙動を研究するために開発された。この方法は、最初に初期の1900年の1,2年に設立され、組織外植片をガラス皿にex vivoで培養した技術を意味した。半ば1900年代では、システムではなく、無傷の組織の断片よりも分散した細胞を増殖するように適合され、用語「組織培養」と「細胞培養」は3の代名詞となった。このような従来の細胞培養系において、細胞は、種々の成長因子を補充した増殖培地を重層した組織培養プラスチックの表面上に成長させる。接着細胞培養、細胞が付着し、細胞を懸濁液中で増殖された組織培養プラスチックおよび非接着性培養物、上に広げ：培養物の2つのタイプが種々の細胞の接着能力に基づいて、浮上している。細胞の初期の頃から培養物は、多数の不死化細胞株は、HeLa細胞4、第一のヒト癌細胞株として、作成されている。これらの細胞株は、細胞培養で無限に増殖する能力を有し、そしてほとんどが生存能力を維持するために特別な処理を必要としない。 元の細胞培養法の還元主義的アプローチは、細胞生存および増殖を維持するのに必要なだけ最低限の成分を含むことによって、可能な限りシステムを簡素化するために設計された。しかし、簡略化された細胞培養アプローチは、有限の寿命を有するex vivoで最も主要なヒト細胞タイプをサポートすることができない。従って、新たな培養系は、したがって、細胞外植片を生理的条件下で増殖させ、可能な限り厳密に組織微小環境に近似するように設計されている。還元主義/従来の細胞培養手法とは対照的に、3次元（3-D）培養システムは、現在、種々の培養を効率的に好適な方法になってきているヒト細胞株および初代細胞は、その後、支持微小環境の文脈において、健康および疾患に関与する機構を研究する。このような3次元システムは、通常、目的の細胞型を研究する組織の微小環境を再現するためには、成長因子を添加し、再構成された行列、および/またはメディアを使用して設定されています。これらの3次元（3-D）培養モデルの第一は、乳腺発達を研究するために開発された。乳腺上皮細胞をマトリゲルに包埋した天然条件下、コラーゲンIVおよび細胞外マトリックス（ECM）のラミニン豊富な供給源を細胞に提供し、成長培地を重層する。このような条件下では、乳房上皮細胞が乳腺腺房に似たクラスターを形成し、乳腺刺激ホルモンによる刺激の際に、これらの腺房は、腺房様構造の中空lumenaに、カゼイン、および他の乳タンパク質を分泌した。カゼイン分泌あってもプロラクチン5の添加後、標準的な培養では観察されなかったさらに、細胞の形態学的および表現型の特徴を維持における微小環境の役割を強調している。細胞は、それらの生理学的微小環境の文脈から取り出される正常な細胞機能の喪失の別のデモでは、支持的微小環境なしに、ケラチノサイトは重層化表皮6を形成するために失敗していることの証明である。他の3-Dモデルの数は、初代細胞のex vivo増殖7,8を可能にするために作成されている。 細胞挙動における微小環境の重要な役割は、エレガントな乳腺上皮細胞は、私が行列コラーゲン中で培養し、マトリゲル内に形成された正確に偏光した腺房と比較した「インサイド·アウト」腺房形成の研究で実証された。ラミニン産筋上皮細胞は、コラーゲンI培養9に追加されたときに適切な形態のこの損失は、元に戻されました。また、正確な微小環境を正確に必要です遺伝子型症状。 CEACAM1は、非トランスフェクトCEACAM陰性細胞とまったく同じように動作し、細胞 - 細胞接着分子でトランスフェクトされた皿、MCF7乳癌細胞で増殖させた。しかし、非悪性乳腺上皮10との間に確立されているようにCEACAM1にトランスフェクトされたMCF7細胞は、中空lumenaの正規表現型および形態腺房に戻りつつECM、野生型MCF7形腫瘍のような構造と接触し、マトリゲルで培養した。同様に、乳癌細胞におけるβ1-インテグリンの遮断は、標準的な培養条件下で、それらの動作を変更したが、3-D培養物で行った同じ実験は、β1-インテグリンの遮断が正常な表現型11に悪性細胞を戻すことを実証しない。したがって、組織微小環境は、細胞生存率を維持するために必要とされるだけでなく、適切な細胞機能を保持する。 細胞の挙動は、生理的条件下で研究することができるシステムを提供することに加えてsは3-D培養物は、新規治療薬8,12,13の前臨床試験のための堅牢で信頼性の高い媒体として機能する。 3-Dで細胞を培養すると、細胞-細胞および細胞-ECM間接着の寄与を評価することができる環境媒介性薬剤耐性14に記載の条件下での治験化合物のスクリーニングを可能にする。さらに、新規化合物のオフターゲット毒性は、種々の組織の複数の細胞区画に組み込むことによって確認することができる。このようなスクリーンは、より迅速に行われ、より費用対効果のインビボ 8 で同等の試験よりもすることができる。 ここでは、正常および悪性の骨髄（BM）細胞が密接にヒトBMの微小環境を模倣するシステムにおいてex vivoで増殖する 、再構成された骨髄（RBM）の3-Dモデルの設定を提示する。 BM間質の様々な構成要素を有する2-D培養物は、液体または接着共培養において初代ヒトBM細胞を増殖する以前の試み、又は3-D、半固体寒天培養物は、組織微小環境15-18の成分を細胞に供給することができないことに限られた成功しか収めていない。これらのシステムでは、一次骨髄細胞は、貧しい人々の生存能力を持っていたし、ex vivoでの増殖することができませんでした。ヒトBM前駆細胞は、BM間質細胞との共培養スフェロイドで増殖させる別のシステムは、造血幹細胞の生存および増殖は、少なくとも96時間持続した19 3-Dシステムである。造血前駆細胞生物学の理解に非常に有益なものの、このシステムは、忠実にその有用性を制限するため、ECM成分が存在しないためBMの微小環境を再現しない。ここで説明するRBMモデルは、人間の骨髄の両方細胞および細胞外区画は、in vitroで再構成され、総合的なシステムを提供します。我々は、RBM培養物は、正常ヒトBM細胞のex vivoでの増殖を支持することができることを示しているとして、我々様々な血液疾患の患者から単離された細胞のようにチェック！

<table><tbody><tr><td>CellTrace CFSE 増殖キット-フローサイトメトリー用</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>ヒト血漿由来フィブロネクチン</td><td>Millipore</td><td>NG1884448</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Lifesciences</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル基底膜マトリックス</td><td>BD Biosciences 354234</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ラットテールコラーゲン I 型</td><td>BDBiosciences</td><td>354249</td><td>MilliporeのコラーゲンIは、このプロトコルを使用して適切にポリマー化しません</td></tr><tr><td>蛍光用VECTASHIELD封入剤 (レギュラーセット)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX錠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4648</td><td>TR染色用TRAP染色用</td></tr><tr><td>SigmaFast BCIP/NBT錠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5655</td><td>アルカリホスファターゼ染色用</td></tr><tr><td>ツァイス共焦点LSM 510顕微鏡&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 510ソフトウェア</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>共焦点解析用画像解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200M 倒立顕微鏡&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaMorphソフトウェア</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Axiovert 200M</td></tr><tr><td>FAC用画像解析ソフトウェアソートフローサイトメーター&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellQuest Proソフトウェア&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>のフローサイトメトリーデータ解析用ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

初代ヒト骨髄およびその悪性腫瘍を研究する三次元組織培養モデル

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

組織培養は、通常の開発から病気に、細胞機能の多くの側面を研究するための貴重なツールとなっている。従来の細胞培養方法は、組織培養皿の固体基質に付着したり、液体媒体中で懸濁液中で増殖するいずれかの細胞の能力に依存する。多数の不死化細胞株が作成され、そのようなアプローチを用いて成長させた初代細胞がex vivoで成長させる必要がある場合、しかしながら、これらの方法はしばしば失敗する。このような障害は、組織培養プラスチックは、細胞増殖のための表面として使用される一般的なシステムからの組織の微小環境の適切な細胞外マトリックス成分の不在に起因している。細胞外マトリクスは、組織微小環境の不可欠な構成要素であり、その存在は、細胞の極性化、生存および増殖などの生理的機能の維持のために重要である。ここでは、一次骨髄セル3次元組織培養法を提示lsのは、ヒト骨（RBM系）の微小環境を再現するように処方細胞外マトリックス中で増殖させる。細胞外マトリックス中に埋め込まれ、細胞は、このように一次組織の細胞組成を維持しながら、細胞生存および増殖は、30日まで持続することができる総合的なシステムを提供し、ヒト血漿を補充した培地を介して栄養素が供給される。 RBMシステムを使用して、我々は成功し、正常なドナーや患者アミ​​ロイドーシス、および様々な血液悪性腫瘍からの一次骨髄細胞を成長している。 RBMシステムは、直接、イン行列リアルタイム細胞の挙動の可視化と新規治療薬の前臨床効果の評価が可能になります。さらに、細胞は、RBMから単離し、続いてインビボでの移植、細胞選別、フローサイトメトリー、および核酸とタンパク質分析のために使用することができる。一緒になって、RBMの方法は、一次骨marroの成長のために信頼性の高いシステムを提供しています生理的条件下で細胞ワット。

一次骨髄細胞は、標準的な組織培養条件下で増殖することができないので、RBMシステムは密接に培養システムを提供し、骨の微小環境を模倣し、ex vivoで BM細胞を増殖するために作成された。 BM細胞外マトリックス、フィブロネクチン、コラーゲンI、コラーゲンIV、ラミニンおよび21の主要な構成要素は、この3-D培養物に構造的な足場を提供するために、RBMマトリックスに組み込んだ。骨内膜、コラーゲンI及びフィブロネクチンに富む骨とBMとの間のインタフェースは、これらのタンパク質を用いて組織培養皿の表面を被覆することによって再構築した。 BM内で複数の細胞区画間のクロストークは、組織の全体的な恒常性に貢献しています。細胞成分のいずれも省略されていないことを保証するために、RBMの文化は、人間の骨髄穿刺吸引生検から分別されていない単核細胞を使用して設定した。システムは、ホルモン、増殖因子が供給されていることを確認する循環環境に存在するd個のサイトカインは、培養培地は、ヒト血漿非悪性BM細胞はRBMに置かれたときに患者からの血漿は、悪性の培養物に添加しながら（ すなわち、正常なドナーからの...

標準的な培養法では、細胞は、それらの生理的環境から採取し、皿のプラスチック表面上に成長した。初代ヒト骨髄細胞の挙動を研究するために、我々は、細胞が組織の天然の微小環境をrecapitulating条件下で増殖される3-D培養系を作成した。

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

この手順の全体的な目的は、ヒト骨髄の細胞内および細胞間微小環境を密接に再現する培養システムを構築することです。まず、組織培養ウェルの表面を工業用マトリックスでコーティングします。次に、骨髄単核細胞またはその他の目的の細胞を骨髄マトリックスと混合します。その後、工業用マトリックスを除去し、細胞とマトリックスの混合物をウェルに添加します。マトリックスがゲル化した後、その上に増殖培地を重層します。最終的に、細胞をマトリックス内で直接可視化するか、あるいは下流の解析のために分離することが可能です。これは、既存の細胞培養法と比較して有用です。例えば、標準的な組織培養法や、プラスチック上で細胞を増殖させる共培養モデルなどが挙げられます。3D培養法を用いる主な利点は、細胞が生理的な微小環境内で増殖するため、組織の本来の状態における細胞の研究が可能になることです。細胞を播種するための48ウェルプレートを用意します。まず、各ウェルに65 µLの工業用コーティング溶液を加え、ウェルの表面全体を覆うように溶液を均一に広げます。この手法は他の表面にも適用可能です。その後、プレートを室温で少なくとも30分間インキュベートします。その間に、PBSを用いて細胞密度 50,000 cells/µL の細胞懸濁液を調製します。各ウェルに 10 µL ずつ添加するのに十分な量を調製し、エプンドー管の中で、細胞懸濁液と1ウェルあたり 100 µL の再構成骨マトリックスを混合します。気泡が入らないように注意しながら、静かに混ぜ合わせてください。プレートの処理が完了した際にマトリックスがゲル化しないよう、混合液は氷上で保持してください。インキュベーション後、吸引によりすべての液体とコーティング溶液を除去します。その後、マトリックスを含む十分に混合した細胞懸濁液を100 µLずつ各ウェルに加えます。ピペットを使用してプレートを素早く傾け、ウェルの表面全体を均一に覆います。細胞を完全にロードすると凝集するため、ウェルを充填する間も懸濁液を混ぜ合わせ続けてください。マトリックスが凝固するまで、プレートを静止状態で30〜60分間インキュベートします。次に、骨髄増殖培地を37 °Cに設定したウォーターバスで予熱します。30分間インキュベートした後、マトリックスが適切に固まっているかを確認してください。良好なマトリックスは、プレートを傾けても動かない柔らかいゲル状の層を形成します。マトリックスが準備できたら、セロロジカルピペットを使用して、1 mLの培地を滴下するようにゆっくりと重ねます。その後、組み立てた再構築骨マトリックス培養物をインキュベーターに戻し、培地交換なしで最大30日間培養します。培地交換が必要な場合は、一度に培地の半分のみを交換してください。マトリックス層を乱さないように、培地をゆっくりと除去します。プレートを傾け、ピペットを用いて培地を静かに排出してください。マトリックス層の上から培地を吸引しないでください。細胞を染色する際、溶液の交換にはこの手法を用いてください。3D培養のウェルから培地を除去する場合、ウェルの側面から除去することが非常に重要です。そうしないと、マトリックスが乱れ、同一の手法で接着している細胞が失われる可能性があります。滅菌済みの1×PBSで細胞を2回洗浄します。その後、各サンプルに氷冷した細胞回収溶液を0.5 mL加えます。激しくピペッティングすることで、細胞とともにマトリックス層全体を除去します。それぞれ、回収物をマイクロ遠心チューブに移し、氷上に置きます。その後、同じウェルにリカバリー溶液をさらに0.5 mL加え、残りの材料をすべて回収します。すべての回収物をボルテックスし、氷上で1時間インキュベートします。この1時間の間に、マトリックスからの細胞放出を促進するため、15分ごとにチューブをボルテックスします。1時間後、混合物の中にマトリックスの目に見える凝集塊がないか確認します。通常は存在しませんが、もし存在する場合は、混合物をより大きなチューブに移し、細胞回収溶液をさらに 2 ～ 5 mL 加えてください。その後、細胞をさらに 30 ～ 60 分間インキュベートします。定期的にボルテックス処理を行い、マトリックスの塊が消失したことを再度確認してください。マトリックスの凝集がなくなった後、混合物を1000 RPMで5〜10分間、4 °Cで遠心分離します。その後、上清を除去し、細胞ペレットを1 mLの冷えた1x PBSに再懸濁します。遠心分離を繰り返します。上清を新鮮なPBSに置換し、洗浄を繰り返します。これを3回行います。3回目のPBS洗浄後、次の手順に適した溶液で細胞を回収します。骨髄細胞を再構成骨マトリックス中で30日間培養し、光学顕微鏡を用いて200倍の倍率で定期的にイメージングを行いました。ストローマ要素は5日目に初めて検出されましたが、14日目までには明確に認められました。培養期間を通じて、細胞はマトリックス中を遊走し、独立したクラスターを形成して凝集した。悪性細胞の塊は時間とともに拡大し、RBMにおいて過剰成長するストローマ成分の組成を評価した。RBMと工業用コーティングの境界における細胞の形態を評価した。細胞をフィブロネクチン、アクチン、および核で染色した。ストローマ形態を持つ細胞を可視化したところ、高いアルカリホスファターゼ活性を持つ前骨芽細胞であることが示された。これらの細胞は、アリザリンレッド染色によって判定された通り、カルシウムを石灰化させる能力を有していた。脂質滴が視認できる細胞は、オイルレッドでの陽性染色に基づき、脂肪細胞として同定された。時折多核を伴う赤染細胞が前骨吸収細胞として認識され、酒石酸耐性酸ホスファターゼ陽性を示しました。3D培養から細胞を単離した後、さまざまな解析が可能です。例えば、微小環境で育成されたさまざまな細胞の細胞表現型を解析することができます。遺伝子およびタンパク質の発現を研究できるだけでなく、3D条件下でこれらの細胞からどのような分子が分泌されるかを決定することも可能です。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

造血のための3D培養系は、ヒト臍帯血および白血病骨髄細胞を用いて記述されています。方法は、細胞外マトリックスタンパク質でコーティングされた多孔質のポリウレタン合成足場の使用に基づいています。この足場は、細胞の広い範囲に対応するために適応可能である。...

正常と異常ヒト造血のex vivoでの擬態

試験系として、ヒトの3D腫瘍組織を作成するための方法が記載されている。これらの技術は、脱細胞化生体血管柄足場（BioVaSc）、初代ヒト細胞およびフローバイオリアクターにおける動的条件下で、ならびに、静的条件下で培養することができる腫瘍細胞株に基づいている。...

人間の3次元の組織工学<em&gt; in vitroで</em&gt;腫瘍テストシステム

プロトコルは、ヒト骨組織外植片モデル系において乳癌細胞の移動、増殖およびコロニー形成を研究するために記載されている。...

培養ヒト大腿骨組織外植するための方法は、転移性ニッチの乳癌細胞コロニー形成を研究する

ヒト多発性骨髄腫（MM）細胞は、間葉系細胞と生存および増殖のための細胞外マトリックス成分の支援微小環境が必要です。我々は、腫瘍の増殖、浸潤および血管形成に対する抗がん剤の効果を研究するために移植されたヒト骨髄腫および間葉細胞とin vivoでニワトリ胚モデルを確立しました。...

腫瘍の増殖、浸潤及び血管新生を研究するために、ニワトリでのヒト多発性骨髄腫異種移植モデルの確立

マウスにおける異なるヒト化骨髄ニッチを作成し、ライブイメージする方法が提示される。ヒト間葉系細胞によって作り出された支持的ニッチに基づいて、ヒト内皮細胞の添加はヒト血管の形成を誘導するが、rhBMP-2の添加はヒト - マウスキメラ成熟骨組織の形成を誘導する。...

マウスにおけるヒト化骨髄微小環境のバイオエンジニアリングとライブイメージングによるそれらの可視化

このプロトコルでは、生体外で人間前臨床モデルの末梢血単球培養がん細胞破骨細胞の相互作用を模倣する乳房癌細胞から破骨細胞形成の開発について説明します。モデルは、骨転移形成の理解を深めると治療オプションの改善される可能性があります。...

破骨細胞形成乳房癌細胞と共培養末梢血単球からの人間の前臨床モデルの開発

骨外植の元生体培養は、骨生理学の研究や骨のリモデリングや骨疾患における薬物の潜在的な評価のための貴重なツールとなり得る。提示されたプロトコルは、新生児マウスの頭蓋骨から分離されたカルヴァリアの調製および培養、ならびにその用途を記述する。...

カルバリア共培養と組織病量を用いた骨リモデリングと腫瘍-骨微小環境の再現

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骨肉腫に対する三次元骨細胞外マトリックス モデル

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生理学的または子宮頸部の文脈における常在細胞間のダイナミクスと相互作用を調査するためのヒト骨髄3Dモデル

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イメージングマイクロプレート中のプレキャストポリ(エチレングリコール)(PEG)ヒドロゲルを用いた血管化骨形成骨髄ニッチの簡単な確立

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ヒト骨細胞と脱細胞化細胞外マトリックスを用いて筋骨格系疾患をモデル化する3D骨培養プラットフォーム

学ぶ 初代ヒト骨髄細胞の三次元組織培養モデル。骨髄マトリックスを用いて生理的微小環境を再現し、細胞の可視化や下流解析を可能にする。造血機能研究に有用です。

初代ヒト骨髄およびその悪性腫瘍を研究する三次元組織培養モデル

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