初代ヒト骨髄およびその悪性腫瘍を研究する三次元組織培養モデル

この手順の全体的な目標は、ヒトの骨髄の細胞内および細胞内の微小環境を厳密に再現する培養システムを設定することです。まず、組織培養ウェルの表面を工業用マトリックスでコーティングします。次に、骨髄単核細胞、または目的の他の細胞を骨髄マトリックスと混合します。

その後、工業用マトリックスを除去し、細胞マトリックス混合物をウェルに添加します。マトリックスがゼリー状になると、成長培地でオーバーレイされます。最終的には、細胞をマトリックス内で直接可視化することも、下流の分析のために分離することもできます 細胞を培養する既存の方法と比較して。

例えば、標準的な組織培養方法や、プラスチック上で細胞を増殖させる共培養モデルなどです。3D培養法を使用する主な利点は、細胞が生理学的微小環境内で増殖するため、組織の本来の条件内で細胞を研究できることです。細胞を播種する48ウェルプレートを調製します。

最初にそれぞれに65マイクロリットルの工業用コーティング溶液を加えることにより、溶液をウェルの表面全体を覆うように均一に広げます。この方法は、他のサーフェスにも拡張可能です。プレートを室温で少なくとも30分間インキュベートします。

その間に、PBSのマイクロリットルあたり50, 000個の細胞の細胞懸濁液を準備します。各ウェルに10マイクロリットルを追加するのに十分な準備をし、次にアイノールチューブで、細胞懸濁液を100マイクロリットルの再構築骨マトリックスと混合します。泡が入らないように、やさしく混ぜます。

プレートが完成したときにマトリックスがゲル化しないように、混合物を氷の上に保ちます。インキュベーションし、吸引によってすべての液体とドテコーティング溶液を取り除きます。次に、100マイクロリットルのよく混合された細胞懸濁液とマトリックスをそれぞれに加えます。

ピペットを使用してプレートをすばやく傾け、ウェルの全面を均等に覆います。ウェルフィル間で懸濁液を混合し続けます。完全にロードされると細胞が凝集します。マトリックスが固まるまで、攪拌せずにプレートを30〜60分間インキュベー

次に、骨髄増殖培地を摂氏37度に設定された水浴で予温します。30分間のインキュベーション後、マトリックスが正しく硬化したことを確認します。良好なマトリックスは、プレートを傾けても動かない柔らかいゲル状の層を形成します。

マトリックスの準備ができたら、血清ピペットを使用して、ミリリットルのミディアムドロップワイズで優しく重ねます。その後、組み立てた再構築骨基質培養物をインキュベーターに最大30日間戻し、培地を変更せずに戻します。媒体の変更が必要な場合は、一度に媒体の半分だけを交換してください。

マトリックス層を乱さずに培地を静かに取り除きます。プレートを傾け、ピペットを使用して培地を静かに排水します。後でマトリックス上でメディアを吸引しないでください。

細胞を染色するとき。この手法は、ソリューションの変更に使用します。3D培養のウェルから培地を取り出すためには、ウェルの側面から培地を取り出すことが非常に重要です。

そうしないと、マトリックスが乱され、セルが失われる可能性があります。滅菌済みのXPBSで細胞を2回洗浄します。次に、それぞれに半ミリリットルの氷冷セル回収溶液を追加します。

ピペッティングで上下させることにより、細胞とともにマトリックス層全体をよく除去します。それぞれについて、コレクションをマイクロ遠心チューブによく移し、氷の上に置きます。次に、同じウェルにさらに半ミリリットルの回収溶液を追加し、残りの材料をすべて収集します。

すべてのコレクションを渦巻きにし、氷の上で1時間インキュベートします。1時間の間に、15分ごとにチューブをボルテックスして、マトリックスからの細胞の放出を促進します。1時間後、混合物にマトリックスの塊が見えていないか確認します。

何も存在しないはずですが、存在する場合は、混合物をより大きなチューブに移し、さらに2〜5ミリリットルの細胞回収溶液を追加します。その後、細胞をさらに30〜60分間インキュベートします。定期的にボルテックスし、マトリックスの塊がないかどうかを再度確認します。

マトリックスが凝集しなくなったとき。混合物を1000RPMで摂氏4度で5〜10分間遠心分離します。次に、上清を取り除き、細胞ペレットを1ミリリットルの冷たいXPBSに再懸濁します。

遠心分離を繰り返します。上澄みを新しいPBSと交換し、洗浄を繰り返します。3回目です。

3回目のPBS洗浄後、次の手順のために適切な溶液で細胞を回収します。骨髄細胞を再構築した骨基質中で30日間増殖させ、光学顕微鏡で200倍の倍率で定期的に画像化しました。間質要素は5日目に最初に検出されましたが、14日目までにはっきりと明らかになりました。

培養期間中、細胞はマトリックスを通って移動し、異なるクラスターに凝集しました。悪性細胞の塊は、RBMで増殖する間質成分の組成を評価するために、経時的に拡大しました。RBMと工業用コーティングとの間の移行における細胞の形態を評価した。

細胞は、フィブロネクチン、アクチン、および核について染色されました。間質形態を有する可視化細胞は、アルカリホスファターゼ活性が高いpres骨芽細胞であることが示されました。彼らは、ザリンによって決定されたカルシウムを無機化することができ、脂肪滴の目に見える存在を有する細胞は、油による陽性染色に基づいて脂肪細胞として同定された。

時折複数の核を持つ赤血球は、pres破骨細胞として認識され、酒石酸耐性酸性ホスファターゼに陽性でした。A 3D培養から細胞を単離した後、さまざまなことができます。例えば、微小環境で増殖した様々な細胞の細胞表現型を研究することができます。

遺伝子やタンパク質の発現を研究することができ、3D条件下でこれらの細胞からどのような分子が分泌されるかを決定することもできます。